SalmonellaSalmonella

Laboratorio de Microbiología Laboratorio de Microbiología AplicadaAplicada

Dra. Esther Z. Vega BermúdezDra. Esther Z. Vega Bermúdez

SalmonellaSalmonella sp.sp.

SalmonellaSalmonella

Salmonellaenterica

Salmonellabongori

Subs. enterica

Subs.salamae

Subs. arizonae

Subs.diarizonae

Subs.indica

Subs.houtenae

From: Porwollik, S., et al., 2004. Characterization of Salmonella enterica subspecies I genovars by UseOf Microarrays. J. of Bacteriol. 186:5883-5898.

Incidencia de SalmonellaIncidencia de Salmonella

CaracterísticasCaracterísticas

Enterobacterias Enterobacterias Bacilos Gram (-)Bacilos Gram (-) Mótiles conMótiles con flagelación perítricaflagelación perítrica No esporulanNo esporulan No fermentan No fermentan lactosalactosa 2, 300 especies2, 300 especiesCrece entre 40-140Crece entre 40-140ooCC

Variantes GenéticasVariantes Genéticas

Mediada por Plasmidios Mediada por Plasmidios – Utilización de lactosa y sucrosaUtilización de lactosa y sucrosa

Microorganismos atípicos pueden Microorganismos atípicos pueden “escapar”a la detección en situaciones “escapar”a la detección en situaciones clínicasclínicas

Las especies de Las especies de SalmonellaSalmonella no son un no son un grupo homogéneo de organismosgrupo homogéneo de organismos

Reservorios / Alimentos Reservorios / Alimentos RelacionadosRelacionados

Carnes crudasCarnes crudas AvesAves HuevosHuevos Leche y productos lácteosLeche y productos lácteos PescadoPescado CamaronesCamarones SalsasSalsas Mezclas para bizcochoMezclas para bizcocho Postres de cremaPostres de crema otrosotros

PatogénesisPatogénesis

Dosis infecciosa tan bajo como 15-20 células Dosis infecciosa tan bajo como 15-20 células (depediendo de hospedero)(depediendo de hospedero)

Antígenos estructurales (pared celular o Antígenos estructurales (pared celular o antígeno O, H- flagelar y el IV-antígeno antígeno O, H- flagelar y el IV-antígeno capsular termolábil -poder frente a loscapsular termolábil -poder frente a los ácidos)ácidos) Sustancias tóxicasSustancias tóxicas EndotoxinasEndotoxinas Exotoxinas (efecto irritante y citotóxicoExotoxinas (efecto irritante y citotóxico para el tracto intestinal)para el tracto intestinal) Ruta oral-fecalRuta oral-fecal

Sintomatología y Sintomatología y EnfermedadesEnfermedades

Período de Período de incubación de 6-incubación de 6-48hrs48hrs

DiarreasDiarreas Dolor abdominalDolor abdominal Fiebre entre 8-72hrs Fiebre entre 8-72hrs Dolor de cabeza yDolor de cabeza y en el cuerpoen el cuerpo EscalofríosEscalofríos NaúseasNaúseas VómitosVómitos

SepticemiasSepticemiasBacteremiasBacteremiasCistitis, Cistitis,

endocarditis y endocarditis y osteomilitisosteomilitis

Síndrome de Síndrome de Reiters que puede Reiters que puede terminar en terminar en artritis crónicaartritis crónica

Fiebre tifoidea ó Fiebre tifoidea ó paratifoideaparatifoidea

Diagnóstico y Diagnóstico y TratamientoTratamiento

Pruebas de serología y de heces Pruebas de serología y de heces fecalesfecales

Aislar el pacienteAislar el paciente Tratamiento para todos en el Tratamiento para todos en el

hogarhogar AntibíoticosAntibíoticos

Muestreo en AlimentosMuestreo en Alimentos

Métodos convencionales de Métodos convencionales de aislación que requieren de aislación que requieren de cinco días para confirmar cinco días para confirmar resultados.resultados.

Cultivo 37-42Cultivo 37-4200C o en neveraC o en nevera..

SalmonellaSalmonella

MetodologíaMetodología

Pre-EnriquecimientoPre-Enriquecimiento– Caldo de lactosaCaldo de lactosa

Permite la recuperación de células “heridas”Permite la recuperación de células “heridas” Aumenta la razón Salmonella:Non-SalmonellaAumenta la razón Salmonella:Non-Salmonella

– Agua de dilución peptonadaAgua de dilución peptonada

Productos AnimalesProductos Animales

Dilución 1:10 Dilución 1:10 – I.e.. 25 g muesra a 225 ml de caldoI.e.. 25 g muesra a 225 ml de caldo

24 horas a 35 24 horas a 35 ooCC

Enriquecimiento SelectivoEnriquecimiento Selectivo

1 ml de caldo de Lactosa 1 ml de caldo de Lactosa – 10 ml Selenite Cystine10 ml Selenite Cystine– 10 ml tetrathionate broth10 ml tetrathionate broth

Permite el crecimiento de Permite el crecimiento de SalmonellaSalmonella No hay resultados despúes de este No hay resultados despúes de este

pasopaso 24 horas a 3524 horas a 35ooCC

Placas SelectivasPlacas Selectivas

Tres tipos de medio selectivoTres tipos de medio selectivo– Bismuth SulfiteBismuth Sulfite

Marrón, gris, negro con “metallic sheen”Marrón, gris, negro con “metallic sheen”

– Hektoen Enteric AgarHektoen Enteric Agar Azul-verdoso con o sin centro negro o “glossy black”Azul-verdoso con o sin centro negro o “glossy black”

– Xylose Lysine DesoxycholateXylose Lysine Desoxycholate Rosado con o sin centro negroRosado con o sin centro negro

Estriado de “Selective Enrichments” Estriado de “Selective Enrichments” Incubación de 18-24 h a 35Incubación de 18-24 h a 35ooCC Resultados – PRESUMPTIVE POSITIVEResultados – PRESUMPTIVE POSITIVE

Medio Diferencial – Medio Diferencial – Discernimiento bioquímicoDiscernimiento bioquímico

Triple Sugar Iron AgarTriple Sugar Iron Agar– Streak Slant and Stab ButtStreak Slant and Stab Butt– 1% Lactosa1% Lactosa– 0.1% Glucosa0.1% Glucosa– Sulfato FerrosoSulfato Ferroso

Indicador de HIndicador de H22S S

– TiosulfatoTiosulfato Producción de HProducción de H22S S

– Rojo fenolRojo fenol Alkalina – Rojo, Acido – AmarilloAlkalina – Rojo, Acido – Amarillo

– Incubación a 35 Incubación a 35 ooC por 24 horasC por 24 horas

Triple Sugar Iron AgarTriple Sugar Iron Agar

Reacción de Reacción de SalmonellaSalmonella – Red Slant (Alkalino)Red Slant (Alkalino)– Acid Butt (Amarillo)Acid Butt (Amarillo)– Precipitado NegroPrecipitado Negro

Lysine Iron Agar- Discernimiento Lysine Iron Agar- Discernimiento bioquímicobioquímico

Stab Butt and Streak SlantStab Butt and Streak Slant– Se quiere condiciones anaeróbicas en el fondo Se quiere condiciones anaeróbicas en el fondo

para que ocurra la decarboxilaciónpara que ocurra la decarboxilación Decarboxilación a partir de L-LysinaDecarboxilación a partir de L-Lysina Sulfato FerrosoSulfato Ferroso Bromo Cresol PurpleBromo Cresol Purple

– Violeta – Alkalino, Amarillo - AcidoVioleta – Alkalino, Amarillo - Acido GlucosaGlucosa TiosulfatoTiosulfato

Lysine Iron AgarLysine Iron Agar

Reacción de Reacción de SalmonellaSalmonella– Alkaline Butt – PurpleAlkaline Butt – Purple– Precipitado NegroPrecipitado Negro

Sólo es negativo si hay condiciones Sólo es negativo si hay condiciones ácidicas, pueden obtenerse otras ácidicas, pueden obtenerse otras reacciones no típicasreacciones no típicas

Confirmación BioquímicaConfirmación Bioquímica

Aglutinación de antígenos superficiales Aglutinación de antígenos superficiales con anticuerpos específicos para con anticuerpos específicos para Salmonella Salmonella

Antígenos de Antígenos de Salmonella Salmonella – O – Somático – LipopolisacáridoO – Somático – Lipopolisacárido– H – Flagellar – ProteínaH – Flagellar – Proteína– K – Capsular - PolisacáridosK – Capsular - Polisacáridos

AglutinaciónAglutinación

Mezcle anticuerpos con un poco de Mezcle anticuerpos con un poco de cultivocultivo

Aglutinación es un resultado positivoAglutinación es un resultado positivo

Aislamiento vs. EnumeraciónAislamiento vs. Enumeración

Usualmente sólo se aislaUsualmente sólo se aisla Se enumera para propósitos de Se enumera para propósitos de

investigacióninvestigación– Método MPNMétodo MPN– Método de filtración por membranasMétodo de filtración por membranas

No “Accurate”No “Accurate”

Otros métodos- kits Otros métodos- kits bioquímicosbioquímicos

Table 1. Partial list of miniaturized biochemical kits and automated systems for identifying foodborne bacteria* ( 5, 8, 15, 16, 21, 35, 36 ). System Format Manufactur

erOrganisms

APIb biochemical

bioMerieux Enterobacteriaceae, Listeria, Staphylococcus, Campylobacter, Non-fermenters, anaerobesCobas IDA biochemi

calHoffmann LaRoche

Enterobacteriaceae Micro-IDb biochemi

cal REMEL Enterobacteriaceae, Listeria

EnterotubeII

biochemical

Roche Enterobacteriaceae Spectrum 10

biochemical

Austin Biological

Enterobacteriaceae RapID biochemi

cal Innovative Diag.

Enterobacteriaceae BBL Crystal

biochemical

Becton Dickinson

Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Non-fermenters, anaerobesMinitek biochemi

cal Becton Dickinson

EnterobacteriaceaeMicrobact biochemi

calMicrogen Enterobacteriaceae, Gram negatives, Non-fermenters, Listeria

Vitekb biochemicala

bioMerieux Enterobacteriaceae, Gram negatives, Gram positivesMicrolog C

oxidationa

Biolog Enterobacteriaceae, Gram negatives, Gram positivesMISb Fatty

acida

Microbial-ID Enterobacteriaceae, Listeria, Bacillus, Staphylococcus, CampylobacterWalk/

Awaybiochemicala

MicroScan Enterobacteriaceae, Listeria, Bacillus, Staphylococcus, CampylobacterReplianaly

zerbiochemicala

Oxoid Enterobacteriaceae, Listeria, Bacillus, Staphylococcus, CampylobacterRiboprinte

rnucleic acida

Qualicon Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Escherichia coliCobas Micro-ID

biochemicala

Becton Dickinson

Enterobacteriaceae, Gram negatives, Non-fermentersMalthusb conducta

ncea Malthus Salmonella, Listeria, Campylobacter, E. coli, Pseudomonas,

coliformsBactometer

impedancea

bioMerieux Salmonella* Table modified from: Feng, P., App.I., FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed.a Automated systems b Selected systems adopted AOAC Official First or Final Action.NOTE: This table is intended for general reference only and lists known available methods. Presence on this list does not indicate verification, endorsement, or approval by FDA for use in food analysis.

Identificación basada DNA-DNAIdentificación basada DNA-DNA

Table 2. Partial list of commercially-available, nucleic acid-based assays used in the detection of foodborne bacterial pathogens* (2, 5, 8, 12, 14, 22, 25, 36, 37).

Organism Trade Name Format Manufacturer

Salmonella GENE-TRAKc probe GENE-TRAK

BAX PCR Qualicon

BINDb phage BioControl

Probelia PCR BioControl

* Table modified from: Feng, P., App.I, FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed.a Polymerase chain reactionb Bacterial Ice Nucleation Diagnosticsc Adopted AOAC Official First or Final Action

NOTE: This table is intended for general reference only and lists known available methods. Presence on this list does not indicate verification, endorsement, or approval by FDA for use in food analysis.

Identificación basada en detección Identificación basada en detección de antígenosde antígenos

Table 3. Partial list of commercially-available, antibody-based assays for the detection of foodborne pathogens and toxins* (3, 5, 8, 12, 33, 36).Organism/toxin Trade Name Assay Formata ManufacturerSalmonella Bactigen LA Wampole Labs

Spectate LA Rhone-PoulencMicroscreen LA MerciaWellcolex LA Laboratoire WellcomeSerobact LA REMELRAPIDTEST LA Unipath Dynabeads Ab-beads DynalScreen Ab-beads VICAMCHECKPOINT Ab-blot KPL1-2 Teste diffusion BioControlSalmonellaTEKe ELISA Organon TeknikaTECRAe ELISA TECRAEQUATE ELISA BinaxBacTrace ELISA KPLLOCATE ELISA Rhone-PoulencAssurancee ELISA BioControl Salmonella ELISA GEM BiomedicalTransia ELISA TransiaBioline ELISA BiolineVIDASe ELFAb bioMerieuxOPUS ELISAb TECRAPATH-STIK Ab-ppt LUMAC Reveal Ab-ppt NeogenClearview Ab-ppt UnipathUNIQUEe Capture-EIA TECRA

* Table modified from: Feng, P., App.I, FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed.a Abbreviations: ELISA, enzyme linked immunosorbent assay; ELFA, enzyme linked fluorescent assay; RPLA, reverse passive latex agglutination; LA, latex agglutination; Ab-ppt, immunoprecipitation. b Automated ELISA c EHEC - Enterohemorrhagic E. coli; ETEC - enterotoxigenic E. coli d Also detects E. coli LT enterotoxin e Adopted AOAC Official First or Final Action

** CAUTION: unless the assays claim that they are specific for the O157:H7 serotype, most of these tests detect only the O157 antigen; hence will also react with O157 strains that are not of H7 serotype. These O157, non-H7 strains, generally do not produce Shiga toxins and are regarded as not pathogenic for humans. Furthermore, some antibodies to O157 can also cross react with Citrobacter, E. hermanii and other enteric organisms.NOTE: This table is intended for general reference only and lists known available methods. Presence on this list does not indicate verification, endorsement, or approval by FDA for use in food analysis.

Identificación basada en la utilización de Identificación basada en la utilización de sustratossustratos

Table 4. Partial list of other commercially available rapid methods and specialty substrate media for detection of foodborne bacteria* (4, 8, 13, 20, 27, 36).

Organism Trade Name Formata Assay Manufacturer

Salmonella Isogridb HGMF QA Labs

OSRT Medium/ motility Unipath (Oxoid)

Rambach Medium CHROMagar

MUCAP C8esterase Biolife

XLT-4 Medium Difco

MSRVb Medium  

* Table modified from: Feng, P., App.I, FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed.a Abbreviations: APC, aerobic plate count; HGMF, hydrophobic grid membrane filter; ATP, adenosine triphosphate; MUG, 4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide; ONPG, O-nitrophenyl ß-D-galactoside; MPN, most probable number.b Adopted AOAC Official First or Final Action.c Application for water analysisd EHEC - enterohemorrhagic Escherichia coli

NOTE: This table is intended for general reference only and lists known available methods. Presence on this list does not indicate verification, endorsement, or approval by FDA for use in food analysis.