1. SIN DUDA Saccharomyces cerevisiae ES EL MEJOR AMIGO DEL HOMBRE Facultad de Ciencias 20 de Enero de 2011

2. 55 regiones duplicadas376 pares de genes homlogosIdentidad vara entre el 24 y el 100%, con un promedio de 63% Representan el 50% del genomaLa duplicacin enSaccharomyces cerevisiae Kellis, et al. (2004). Detalle del cromosoma 4 3. Dos levaduras diploides ancestrales, cada una con 5000 genes (8 cromosomas), se fusionaron para formar un tetraploide. Despus de la duplicacin, estas especies se hicieron diploides (sufrieron un decaimiento de identidad de secuencia) al perderse 85% de las copias duplicadas,y quedaron con 5800 genes, muchos duplicados.La levadura, un poliploide degenerado Prdida balanceada y complementaria en las regiones pareadas, dejando al menos una copia de cada gen del conjunto gnico ancestral Divergencia,1.5 x 10 8aosDuplicacin genoma, 10 8aos Fisiologa de la levadura ancestral, ms parecida a la deKluyveromyces .Sintenia conservada 4. Diferencia fisiolgica entreS. cerevisiaey otras levaduras, su habilidad para fermentar azcares bajo condicionesaerobiasyanaerobias , produciendo etanol.Qu ventajas represent la duplicacin? Aparicin de un nuevo nicho ecolgico Retencin de vas glucolticas Duplicacin coincide con el tiempo en que las angiospermas se hicieron ms abundantesDeterminante en su adaptacin evolutiva al crecimiento anaerobio: - Varios duplicados, regulados de manera distinta en condiciones aerobias y anaerobias -Otros codifican para transportadores de azcares. 5. Cmo se originan los genes? 1.Duplicacin de genes preexistentes 2.Transferencia horizontal 3.Material no codificante 6. 72 % 16% descendientes de una duplicacin g enmica 16 % Hace10 8aos Duplicaci n Genmica 28 % en masde una copia 72 % 4n 2n 7.

Bioqu mica

Gentica clsica y molecular

Genmica estructural y funcional

5 m Redundancia gnica enSaccharomyces cerevisiae 8. A B C D E F G H LEVADURA ANCESTRAL 150 m.a. Wolfe& Shields (1997)Nat ure 2n A B C D E F G H A B C D E F G H A B C D E F G H Kluyveromyces lactis (aerobio estricto ) ANCESTRO DESaccharomyces 10 0 m.a. 2n 4n Saccharomyces cerevisiae (anaerobio facultativo) A B C D E F G H A B C D E F G H 2n duplicaci n genmica El ANCESTRO DES.cerevisiae : UNA LEVADURA TETRAPLOIDE LA RETENCION DE CIERTOS PARALOGOS ES UNA ADAPTACION AL METABOLISMO FACULTATIVO? 9. Lynchet al.(2001)Genetics Nonfunctionalization Neofunctionalization Subfunctionalization Sobre el destino de genes duplicados deletereous mutagenesis conservation 90% pierden la funcin 9% subfuncionalizacin 1% neofuncionalizacin 10. DUPLICACION GENICA Y EVOLUCION PREGUNTAS Cuando se retienen las dos copias de un gen duplicado: SUBESPECIALIZACION O REDUNDANCIA? SUBESPECIALIZACION Como evoluciona la proteina? Que papel juega la oligomerizacion en la diversificacion?Como evolucionan los elementos cis? Como se comportan los elementos trans que son comunes a los dos promotores, pero dan respuestas transcripcionales distintas? Y el ancestro???? 11. DUPLICACIONGENICAEVOLUCION ALT1-ALT2 LUIS ROBLEDO GEORGINA PEALOSA BAT1-BAT2 MARITRINI COLON FABIOLA HERNANDEZ JAMES GONZALEZ DIVERSIFICACION DEPROMOTORES HUGO HERNANDEZCRISTINA ARANDA HETERO-OLOGOMERIZACION GEOVANI LOPEZ MARIANA DUHNE JOAO SANCHEZ COLABORADORES: LINA RIEGO - SLP ALEXANDER DE LUNA GTO HECTOR QUEZADA CARDIOLOGIA GABRIEL DEL RIO IFC RELOCALIZACION GEOVANI LOPEZ MIRELLE FLORES JOAO SANCHEZ ANCESTROS KARLA LOPEZ MARITRINI COLON ADRIANA NEBREDA LABORATORIO 301 DE ORIENTE ALICIA GONZALEZ-CRISTINA ARANDA 12. EXISTEN VARIOS MODELOS QUE EXPLICAN LA APARICION,MANTENIMIENTO Y EVOLUCION DE PARALOGOS MODELO DENeofuncionalizacionPROPUESTO POROHNO (1970) 1.-Un solo gen es suficiente para realizar la funcin, las copias extras son redundantes. 2.- Si la copia extra se fija en la poblacin, el gen original mantendra su funcin y la copia nueva se pseudogenizara al acumular mutaciones neutrales de prdida de funcin. 3.- Ocasionalmente el gen en proceso de pseudogenizacin puedeacumular substituciones y adquirir una nueva funcin, que semantendr por seleccin positiva. MODELO DEDuplicacin-degeneracin-complementacinPROPUESTO POR Forceet al(1999) 1.- Ambas copias acumulan mutaciones degenerativas que resultan en que ninguna de las dos copias puede mantener la funcin, ambas copias se subfuncionalizan y se mantienen por seleccin. Ambas copias se requieren para llevar a cabo la funcin original. LOS CASOS DEGDH1-GDH3YLYS20-LYS21 13. NADP-GDH -ketoglutarate L-glutamate L-glutamine citrate oxalacetate malate fumarate succinate NH 4 + NH 4 + NAD-GDHGSNH 4 + Gdh1 / Gdh3 Gdh2 GOGATGlt1 Gln1 METABOLISMO CENTRAL DE NITROGENO glutaminasa aminotransferasa 14. CULTURE TIME (h) NADP-GDH ACTIVITY (U/mg) GDH1 GDH3 [glucose] [ethanol] GDH1,gdh3 GDH3,gdh1 6 G d h 1 p 6 G d h 3 p p H 5 . 8 0 1 2 3 4 5 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 NADP-GDH (U mg)-1 ) [ - c e t o g l u t a r a t o ] ( m M ) G D H W T 6 G d h 1 p 6 G d h 3 p [ - k e t o g l u t a r a t e ] ( m M ) NADP - GDH ACTIVITY (U/mg) GDH3 ACT1 G E GDH1yGDH3HAN DIVERSIFICADO:EXPRESION, PROPIEDADES CINETICAS, FORMAS OLIGOMERICAS 15. Identificacin de interacciones protena-protena mediante el uso de fragmentos de la GFP Bi molecularF luorescenceC omplementation (BiFC) Lys20Vn-HisLys21Vc-KanLys20Vn-His / Lys21Vc-KanLys20Vc-His / Lys21Vn-Kan L21 Geovani Lpez et al L20 L20 L20 L21 L21 16. En glucosa la expresion deGDH3se reprime por remodelacion de cromatina en etanol se dereprime p GDH3 3 2 1 4 * LacZ 3 2 1 2 3 4 G E 0.00 0.20 L 50bp 0.00 0.10 0.20 DNA 0.10 MNase (U/ml) 800 600 400 300 200 700 500 1230 G E 5' 3'probe 800 600 400 300 200 700 500 1230 L50 bp 0.00 0.10 DNA 0.20 0.00 0.10 0.20 G E MNase (U/ml) G E 3' 5'probe +1 17. Funcin respiratoria - KG citrato Glu - KG citrate Glu TCA cycle - KG succinato citrato Glu - KG succinate citrate Gdh3p Glu pyruvate glucosa ethanol etanol acetyl-CoA acetyl-CoA Gdh1pADP+Pi DeLunaet al.(2001)J Biol Chem Riegoet al.(2002)BBRC Avendaoet al.(2006)Mol Microbiol Gdh1p La retencin deGDH1yGDH3es una adaptacin al metabolismo factultativo 18. LA APORTACION DE NUESTRO GRUPO: 1.-GDH1yGDH3se mantienen diversificando el perfil de expresin y las propiedades cinticas de sus productos, y manteniendo lamisma localizacin subcelular todo esto permitela formacin dehetero-oligmeros seleccin positiva? 2.- La distribucion de genes en los bloques di como resultado la distribucin de algunas copias de parlogos localizados enzonas dezonas de cromatina condensada y por tanto con promotores cerrados a la expresin 19. EL DOGMA DE Gln3 Gln3UNICAMENTEDETERMINA LA RESPUESTA A LACALIDADDE LA FUENTE DENITROGENO Pries, R.,et al . (2002)Euk Cell1(5)663; Beck, T. & Hall, M. Nature 402:689 20. LA EXPRESIN DEGDH1Y ASN1 SE ACTIVA POR Gln3 DE MANERANO ORTODOXADAL5SE REGULA DE MANERA ORTODOXA (DOGMATICA) Glutamine Proline ACT1 WT gln3 ure2 G E-15 E-24 G E-15 E-24 G E-15 E-24 WT hap2 hap4 a b c WT gln3 ure2 DAL5 ASN1 GDH1 1 0.4 1.1 1 0.8 GDH3 1 0.6 1 1 0.8 1 15 1 2 WT gln3 ure2 WT gln3 ure2 Glutamine Proline ACT1 DAL5 ASN1 GDH1 1 0.7 1 0.8 GDH3 1 2 1 1 1 0.6 0.8 1 0.5 0.8 1 15 1 0.2 2 Glutamine ACT1 CYC1 ASN1 GDH3 GDH1 1 1 2 1 1 1 1 11 12 1 5 6 1 1 1 0.7 1 1 1 1 4 4 ACT1 ACT1 GLUCOSE ETHANOL 1 1 1 21. EL DOGMA DEL COMPLEJO HAP El COMPLEJO HAP SIEMPRE ESTA CONSTITUIDO POR 4 SUBUNIDADES CODIFICADAS POR HAP2, HAP3, HAP5 Y HAP4. Hap2-3-5 CONSTITUYEN EL DOMINIO DE UNION AL DNA Hap4 CONSTITUYE EL DOMINIO DE ACTIVACION Hap2-3-4-5 DETERMINA LA ACTIVACION DE LOS GENES IMPLICADOS EN LA RESPUESTA RESPIRATORIA 22. CYC1(citocromo C) SE REGULA POR HAP DE MANERA ORTODOXA (DOGMATICA) Glutamine Proline ACT1 WT gln3 ure2 G E-15 E-24 G E-15 E-24 G E-15 E-24 WT hap2 hap4 a b c WT gln3 ure2 DAL5 ASN1 GDH1 1 0.4 1.1 1 0.8 GDH3 1 0.6 1 1 0.8 1 15 1 2 WT gln3 ure2 WT gln3 ure2 Glutamine Proline ACT1 DAL5 ASN1 GDH1 1 0.7 1 0.8 GDH3 1 2 1 1 1 0.6 0.8 1 0.5 0.8 1 15 1 0.2 2 Glutamine ACT1 CYC1 ASN1 GDH3 GDH1 1 1 2 1 1 1 1 11 12 1 5 6 1 1 1 0.7 1 1 1 1 4 4 ACT1 ACT1 GLUCOSE ETHANOL 1 1 1 23. LA EXPRESIN DE GDH1 Y ASN1 DEPENDE DEL COMPLEJO HAP2-3-5 HAP4 NO PARTICIPA QUIEN ACTUA COMO DOMINIO DE ACTIVACION? Glutamine Proline ACT1 WT gln3 ure2 G E-15 E-24 G E-15 E-24 G E-15 E-24 WT hap2 hap4 a b c WT gln3 ure2 DAL5 ASN1 GDH1 1 0.4 1.1 1 0.8 GDH3 1 0.6 1 1 0.8 1 15 1 2 WT gln3 ure2 WT gln3 ure2 Glutamine Proline ACT1 DAL5 ASN1 GDH1 1 0.7 1 0.8 GDH3 1 2 1 1 1 0.6 0.8 1 0.5 0.8 1 15 1 0.2 2 Glutamine ACT1 CYC1 ASN1 GDH3 GDH1 1 1 2 1 1 1 1 11 12 1 5 6 1 1 1 0.7 1 1 1 1 4 4 ACT1 ACT1 GLUCOSE ETHANOL 1 1 1 24. Hap2 RECLUTA A Gln3 A LOS PROMOTORES DEASN1yGDH1 25. ASN1YGDH1TIENEN UNA ORGANIZACION QUE SUGIERE EL SITIODE UNION DE HAP2-3-5-Gln3 26. UNAMUTANTE cisAFECTADA EN LAS TRES CAJASGATAAGDEGDH1 PRESENTA UN FENOTIPO EQUIVALENTE AL DE UNA MUTANTEgln3 Y NOUNE A Gln3-Myc 13 27. Gln3-Myc13 COINMUNOPRECIPITA CON Hap2-TAPHAP2-TAP2 GLN3-myc 13 Myc Ab TAP Ab WCE Hap2-TAP 28. PARA EL CASO DEGDH3QUIEN FUNCIONA COMO DOMINIO DE ACTIVACION DE Hap2-Hap3-Hap5??? Rtg3? -895 -378 (1) ATTGG ATG +1 (3) CTTATC -393 (5) GTTATC -253 GDH1 -1158 ATG +1 GATAAA (2) -452 (3) CTTAT (4) CTTATCGATAAG (5) -214 GDH3 (1) TTTATC -928 -845 CCAAT (1) GATAAA (1) -634 GATAAA (2) -518 (4) CTTATC -358 -351 CCAAT (2) -278 CCAAT (3) -284 (2) ATTGG CCAAT (3) -240 (6) TTTATC -173 GGTAC (1) -224 GGTAC (1) -46 GTCAC (2) -5 29. Hap2-3-5-Gln3CONSTITUYE UN ACTIVADOR NUEVO YA QUE PROVOCA UNA RESPUESTA TRANSCRIPCIONAL PECULIAR: ACTIVA LA EXPRESION DE UN GRUPO DE GENES ENGLUTAMINA COMO FUENTE DE NITROGENO POR LO TANTO.. Gln3 TIENE OTRA FUNCION ADEMAS DE LA DESCRITA CUAL ES EL GRUPO DE GENES REGULADO PORHap2-3-5-Gln3 ????? EL PRESTAMO DE DOMINIOS PERMITE AMPLIAR EL REPERTORIODE REGULADORES TRANSCRIPCIONALES!!!!!!!!!!! QUE TAN FRECUENTE ES EL PRESTAMO DE DOMINIOS? CONCLUSIONES 30. 13011.712 151112 12.3 1111 161112 1111111.7 DAL5 DAL1 GDH2 DUR1,2 HIS3 HIS4 13.212.3 GLN3 GCN4 1311.2 ACT1 GDH1 131112.5 a Gln3 y Gcn4 determinan la expresin de genes catablicos y biosintticos en condiciones de derepresin de N y deprivacin de AA Gln3- regulador catabolismo Gcn4-regulador biosntesisWT gln3 gcn4 3-AT -+ -+ -+ GABA 31. DAL5 DAL1 gcn4 GLN3-myc 13 gln3 GCN4-myc13 GLN3-myc 13 DAL5 LEU4 DAL5 LEU4 DAL5 LEU4 GCN4-myc 13 DAL5 LEU4 GDH2 ATG -175 -350 -525 -700 DAL1 LEU4 gln3 GCN4-myc 13 GCN4-myc 13 gcn4 GLN3-myc 13 DAL1 LEU4 DAL1 LEU4 DAL1 LEU4 ATG -175 -350 -525 -700 ATG -150 -300 -450 -600 GLN3-myc 13 LEU4 GDH2 gln3 GCN4-myc 13 LEU4 GDH2 GCN4-myc 13 GDH2 LEU4 gcn4 GLN3-myc 13 GDH2 LEU4 GLN3-myc 13 GABA-3AT (a) (b) (c) DUR1,2 DUR1,2 LEU4 -100 -200 -300 -400 ATG gln3 GCN4-myc 13 GCN4-myc 13 gcn4 GLN3-myc 13 GLN3-myc 13 DUR1,2 DUR1,2 DUR1,2 LEU4 LEU4 LEU4 (d) Gln3 recluta a Gcn4 a los promotores catablicos Sitio de union de Gln3 (GATAAG) consenso y conservado Sitio de union de Gln3 (GATAAG) consenso no conservado Sitio de union de Gcn4(TGACTC) consenso y conservado Sitio de union de Gcn4 () (TGACTC) consenso no conservado INPUT Myc Ab HA Ab no Ab INPUT Myc Ab HA Ab no Ab INPUT Myc Ab HA Ab no Ab INPUT Myc Ab HA Ab no Ab 32. GDH1 GLN3-myc 13 gcn4 GLN3-myc 13 GDH1 gln3 GCN4-myc 13 GCN4-myc 13 HIS4 GLN3-myc 13 GCN4-myc 13 gcn4 GLN3-myc 13 gln3 GCN4-myc 13 LEU4 HIS3 HIS3 ATG -225 -450 -675 ATG -75 -150 -225 -300 ATG -50 -100 -150 -200 LEU4 HIS3 LEU4 HIS3 LEU4 LEU4 HIS3 INPUT Myc Ab HA Ab no Ab HIS4 LEU4 HIS4 LEU4 LEU4 gcn4 GLN3-myc 13 HIS4 GLN3-myc 13 INPUT Myc Ab HA Ab no Ab gln3 GCN4-myc 13 LEU4 GDH1 GCN4-myc 13 GDH1 LEU4 GDH1 LEU4 INPUT Myc Ab HA Ab no Ab GABA 3-AT (a) (b) (c) LEU4 HIS4 -900 Gln3 y Gcn4 se unen cooperativamente a los promotores biosintticos Sitio de union de Gln3 (GATAAG) consenso y conservado Sitio de union de Gln3 (GATAAG) consenso no conservado Sitio de union de Gcn4(TGACTC) consenso y conservado Sitio de union de Gcn4 () (TGACTC) consenso no conservado 33. GLN3-myc 13 Gln3 y Gcn4 forman parte del mismo complejo transcripcional y determinan de manera conjunta la expresin de genes catablicos y biosintticos+ + + -GCN4 -HA GLN3-myc 13 -MYC WCE 34. Gcn4-Gln3CONSTITUYE UN ACTIVADOR NUEVO YA QUE PROVOCA UNA RESPUESTA TRANSCRIPCIONAL PECULIAR: ACTIVA LA EXPRESION DE UN GRUPO DE GENES BIOSINTETICOS Y CATABOLICOS EN GABA 3-AT CUAL ES EL GRUPO DE GENES REGULADO PORGcn4-Gln3 ????? EL PRESTAMO DE DOMINIOS PERMITE AMPLIAR EL REPERTORIODE REGULADORES TRANSCRIPCIONALES!!!!!!!!!!! QUE TAN FRECUENTE ES EL PRESTAMO DE DOMINIOS? CONCLUSIONES 35. MODELO DEEspecializacion o solucin de conflicto adaptativopropuesto Por Hughes (1994). Si el gen original realiza dos funciones que no pueden mejorarse de maneraindependiente sin afectar a la contraparte, despues de la duplicacin cada una de las copias se especializa y mantiene por seleccin positiva. EL CASO DEBAT1-BAT2yALT1-ALT2 36. BAT1yBAT2CODIFICAN AMINOTRANSFERASAS DE AMINOACIDOS DE CADENA RAMIFICADABAT1 BAT1 BAT2 BAT2 KIV KIV KMV KMV KIC Leu Val Val Ile Ile BAT1 Leu KIC 37. Bat1 - caracter biosinttico Bat2 - caracter catablico Bat1 localiza en mitocondria Bat2 localiza en citosol Bat1 y Bat2 HAN DIVERSIFICADO SU FUNCION 38. 1.-Las mutantesbat1 son braditrofas de valina 2.-Las mutantesbat2 estan alteradas en el catabolismo de V y I 3.-Bat1 y Bat2 son parcialmente redundantes + V + I + L + VIL + V + I + L + VIL NH 4 + 39. BAT1 - PERFIL DE EXPRESION BIOSINTETICO BAT2 - PERFIL DE EXPRESION CATABOLICO EL PERFIL DE ACTIVIDAD ENZIMATICA SIGUE EL PERFIL DE EXPRESIONLeu3 ES UN MODULADOR POSITIVO DEBAT1 Y MODULADOR NEGATIVO DEBAT2NH 4 GABA VIL Val Ileu Leu SCR1 BAT2 SCR1 BAT1 GLN wt gcn4 gln3 leu3 gln3/leu3 Glutamina GABA wt gcn4 gln3 leu3 gln3/leu3 BAT1 BAT2 SCR1 40. + V + I + L + VIL 0 . 0 0 0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 6 0 . 0 8 0 . 1 0 0 . 1 2 0 . 1 4 0 . 1 6 0 . 1 8 0 . 2 0 Growth rate ( ) + V + I + L + VIL NH 4 + KlBat1 es una protenabifuncional El perfil de expresin deKLBAT1 es biosinttico KlBAT1 KlSCR1 NH 4 GABAGLNVIL NH 4VIL GABA VIL GLN VIL Klbat1 WTS. cerevisiae 11.21.60.30.40.61.600 w t k l b a t 1 41. KlBAT1no complementa mutantesbat2 glucose ammonium glucose VIL 42. Kl Bat1 es una enzima bifuncional La doble funcin de KlBat1 se ha distribuido entre lasdos enzimas parlogas (Bat1 y Bat2) presentes enS. cerevisiae BAT1yBAT2han diversificado 1.- perfil de expresin 2.- localizacin subcelular diferencial de sus productos No pueden formar hetero-oligomeros Bat1 es indispensable para sintetizar la poza de V mitocondrial Bat1 y Bat2 se requieren para catabolizar VIL seleccin positiva? La retencin deBAT1yBAT2es una adaptacin almetabolismo facultativo 43. DUPLICACIONGENICAEVOLUCION ALT1-ALT2 LUIS ROBLEDO GEORGINA PEALOSA BAT1-BAT2 MARITRINI COLON FABIOLA HERNANDEZ JAMES GONZALEZ DIVERSIFICACION DEPROMOTORES HUGO HERNANDEZCRISTINA ARANDA HETERO-OLOGOMERIZACION GEOVANI LOPEZ MARIANA DUHNE JOAO SANCHEZ COLABORADORES: LINA RIEGO - SLP ALEXANDER DE LUNA GTO HECTOR QUEZADA CARDIOLOGIA GABRIEL DEL RIO IFC RELOCALIZACION GEOVANI LOPEZ MIRELLE FLORES JOAO SANCHEZ ANCESTROS KARLA LOPEZ MARITRINI COLON ADRIANA NEBREDA LABORATORIO 301 DE ORIENTE ALICIA GONZALEZ-CRISTINA ARANDA 44. Gene Duplication and Diversification in the YeastSaccharomyces cerevisiae : Differential Gene Expression of Paralogous Pairs 45. No hay verdades absolutas; todas las verdades son verdades a medias. El error consiste en tratarlas como verdades absolutas. Alfred North Whitehead Di logos (1953)