rules of transgene
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VERSUCHSTIERKUNDLICHER BLOCKKURS
EmbryotransferBlastozystentransferTransgene Tiere
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TRANSGENE TIEREDefinitionen
Begriff „transgen“erstmalig im Zusammenhang mit Labormäusen, in deren Genom fremdes genetischesMaterial mittels Vorkerninjektion übertragen wurde(Gordon JW, Ruddle FH; Science, 1981;214:1244-46)
Gentechnisch modifizierter Organismen
1. nach deutschem Gentechnikrecht (§3 GenTG, 1993):ein Organismus, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist,wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürlicheRekombination nicht vorkommt mittels gentechnischer Verfahren: - Vorkerninjektion
- homologer Rekombination- retroviraler Vektoren
2. Palmiter und Brinster, 1985 (Transgenic Mice. Cell;41:343-345):Organismen, bei denen eine in vitro rekombinierte und experimentell übertrageneDNA-Sequenz stabil ins Genom integriert ist und vererbt wird
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Gesetzliche Grundlagen
Gentechnische Arbeiten:Die Erzeugung gentechnisch veränderter Organismen.
Die Vermehrung, Lagerung, Zerstörung oder Entsorgung sowie der innerbetriebliche Transport gentechnisch veränderter Organismen....
Gentechnikrecht
à Gentechnikgesetz (GenTG):Genehmigung des Betriebes der jeweiligen Anlage
à Gentechniksicherheitsverordnung (GenTSV)Sachkundenachweis für: Projektleiter
Beauftragter für biol. Sicherheit§§ 15, 17 GenTSV
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Tierschutzrechtliche Bestimmungen
à Tierschutzgesetz àààà Herstellung und Haltung transgener Tiereà Experimente mit transgenen Tieren
1. Gewinnung von Embryonen:
à Organentnahme nach Töten der Spendertiere (ohne Superovulation!): nicht anzeige- oder genehmigungspflichtig
2. Hormonelle Stimulation/Superovulation:
für TVA als Halter und Züchter: eine biotechnolog. Zuchtmaßnahme
für Wissenschaftler: im Rahmen Erstellung transgener Tiereàààà genehmigungspflichtig!
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Der Gentransfer:
- Nutzung in vitro: kein Tierversuch § 7 Abs.1 TSchG
hier aber: Weiterentwicklung zu lebenden Individuen zu Versuchszwecken
alle notwendigen Tätigkeiten wie à Superovulationà Tötender Spendermäuseà Gentransferà Vasektomieà Embryotransferà Charaktersierung
genehmigungspflichtiger Tierversuch !
4. Zucht/Haltung:
Erlaubnis nach §11 TierSchG, Abschnitt1, Nr.1 àààà TVAin Verbindung mit Anhang V der GenTSV
5. Versuche mit transgenen Tieren: genehmigungs- oder anzeigenpflichtig
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Techniken
1. Mikroinjektion in den Vorkern (Maus)
Herstellung klassischer Transgene: à Expression zusätzlichen Gens
2. Homologe Kombination in Embryonalen Stammzellen, (Maus)
Herstellung von Knock out Tiere: à Ausschalten Genfunktion
3. Retrovirale Vektoren: à zufällige Änderung im Genom
Herstellung und Entwicklung transgener Tiere:
Eingriffe an Embryonen unterschiedlichen Entwicklungsalters nötig
à Embryonen im 1 –2 Zellstadium
à Blastozysten
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Embryonalentwicklung der Maus
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Entwicklungsstadien der befruchteten Eizellen
Tag 0.5 p.c. Einzeller Tag 1.5 p.c. Zweizellstadium
Tag 2 p.c. Vierzellstadium Tag 2.5 p.c. Achtzellstadium Tag 3.5 p.c. Blastozyste
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Gewinnung und Kultivierung von Embryonen bzw. Blaszozysten
1. Superovulation der Spendertiere- ermöglicht höhere Ausbeute an entwickelten Eizellen- hormonell: PMSG (Pregnant Mare‘s Serum Gonadotropin)
hCG (human chorionic Gonadotropin)
1. 5-10 IU PMSG i.p. nach 48 h2. 5-10 IU hCG i.p.
Zeitpunkt abh. vom Hell-Dunkel-Rhythmus des Tierraumes
- nach hCG- Gabe Verpaarung
- Kontrolle der Verpaarung: à Kontrolle Vaginalpfropf
- high ovulators z.B. C57BL/6- low ovulators z.B. BALB/c
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1. Spendertiere Embryonen: à ausreichende Anzahl an Embryonen
-Tiere: ♀ Alter 4-6 Wochen-Gewinnung der Embryonen an Tag 0.5 (Einzellstadium für Vorkerninjektion)
an Tag 1.5 (2-Zellstadium für Hygienesanierung)
2. Empfängertiere:Stämme: z.B. B6 x CBA F1 Hybriden, FVB Inzucht, NMRI Auszucht
♀ Tag 0.5 – 1.5 ihrer Pseudogravidität
Anforderungen:à Fellfarbenunterschied zwischen Empfänger- und Spendertier
à Empfängertiere sollten auch kleine Würfe großziehen
3. Technik: Ovidukttransfer
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Blastozystengewinnung:
1. Spendertiere:
zu beachten:- Fellfarbenunterschied zwischen ES-Zellen Spenderstamm und Empfängerstamm- Wirtsblastozyste geeigneter Empfänger für ES-Zelllinie- Manipulierbarkeit der Wirtsblastozyst- genügende Anzahl an injizierbaren Blastozysten- Superovulation bei 3 – 4 Wochen alter Tiere- Gewinnung der Blastozysten an Tag 3.5
2. Empfängertiere:
♀ Tag 2.5 ihrer Pseudogravidität
3. TechnikUterustransfer
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Isolierung von Ovidukt bzw. Uterus
-Töten der Tiere zum gewünschten Zeitpunkt
à 1- bzw. 2- Zell-Stadium: Tag 0.5-1.5 p.c.
à Blastozysten: Tag 3.5-4.5 p.c.
- Entnahme von Eileiter: Gewinnung von Embryonen im
1-Zell-Stadium à Vorkerninjektion
2-Zell-Stadium à hygienische Sanierung
- Entnahme von Uterus: Blastozystengewinnung Tag 3.5 p.c.
à ES-Zellen à homologe Rekombination
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Isolierung von Ovidukt bzw. Uterus
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a) Eileiter
b) Uterus
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Spülen des Eileiters
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-überführen der Embryonen in M2-Medium-Spülen, ev. Zugabe von Hyaluronidase-Überführen in M16 Medium-Kultivieren über Nacht im Brutschrank möglich-Aufnehmen in Transferkapillare und M2-Medium-8-10/Ovidukt
Transferkapillare mit Embryonen
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Eileitertransfer
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Uterustransfer
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Vasektomie: Durchtrennung der SamenleiterSexualverhalten aber noch vorhanden
zur Erzeugung scheinträchtiger Weibchen:
à sexuell intakte Weibchen werden mit vasektomierten Männchen verpaart
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1. Mikroinjektion in den Vorkern:
-Vorkerne: sichtbar in befruchteter Eizelle im Einzellstadium
-befruchtete Eizelle: 2 Vorkerne1 Polkörperchen
-Injektion mittels Mikroinjektionsanlage in männlichen Vorkern
-Fixation mittels Haltekapillare
-Injektionskapillare durch Zona pellucida und Cytoplasma in Vorkern
-Zugabe der DNA-Lösung (ca. 1-2 Picoliter)à Anschwillen Vorkern
-Waschen der Embryonen
-Eileitertransfer
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Vorkerninjektion:
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1. Mikroinjektion in den Vorkern
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2. Kultivierung Embryonaler Stammzellen für Blastozysteninjektion:
ES von Mäusen = pluripotente Zellenà gewonnen aus Blastocysten
Vorteil:Möglichkeit der gezielten Änderung eines Gens mit Hilfe homologer Rekombination
Isolierung von ES Zellen:
- aus Blastozysten
- Embryonalstadium:Tag 3,5 Embryonalentwicklung
- Entfernung des embryonalen Teils
- Kultivierung der Zellen:
à auf Gelatine vorbehandelten Petrischalenà enthalten Fibroblasten als Feeder- Schicht
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DNA-Integration:
- mittels Elektroporation
à Eintreten der DNA in die Zellen durch elektrischen Puls
Nachweis der homologen Rekombination
-positive Selektion erforderlich
-Verwendung eines Resistenzgens, z.B. Neomycin Resistenzgen
-Selektion mit Geniticin
-nach Selektion Isolierung der resistenten Kolonien
-Injektion diese ES Zellen in Blastozysten à Uterustransfer
-Ergebnis: chimäre Tiere
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Blastozysteninjektion/Injektion der ES-Zellen
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2. Blastozysteninjektion
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3. Retrovirusvektoren
Prinzip: Infektion von Mausembryonen mit Retroviren durch Kontakt zwischenEizelle und Viruspartikel
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Zucht/Zuchtaufbau
1. Allgemeine Zielsetzung bei der Zucht transgener Tiere:
- Keimbahnübertragung - stabile Integration des Transgens
-Ausgangstier: transgenes Foundertier
2. Rückkreuzung
à auf einen anderen genetischen Hintergrund (z.B. von 129 Sv auf C57BL/6)
Problem: - starke Reduktion des Transgens möglich
- Erreichen des gewünschten genetisch. Hintergrunds nach 10 Generationen
Vorteil: Wurfgeschwister als Kontrolltiere nicht mehr notwendig
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Vorkerninjektion:
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ES-Zellen
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Genomische Homogenität und Heterogenität im Verlauf
Generationenverlauf bei einer Rückkreuzung:
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Haltung und Transport
Haltung:
- Haltung und/oder Zucht à gentechnisches Arbeiten- nur in behördlich zugelassenen gentechnischen Anlagen- Sicherheitsstufen (S1-S4, i.d.R. S1, S2)
Empfängerlabor:
- personelle und räumliche Vorraussetzungen (nach GenTG, GenTS-VO)
Transport:
- innerbetrieblich, zwischenbetrieblich - geschlossene Behälter, bei Bedarf doppelwandig- Käfig/Box gegen Bruch gesichert- Transportrisiken: à Gefährdung des Personals
à Entfliehen transgener Tiere
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Nomenklatur gentechnisch modifizierter Stämme:
Transgene LinienTargeted Mutation (Knock out)Targeted Mutation (Double Knock out)Targeted Mutation (Knock in)
-Symbol für Transgene: 1. Tg für Transgen2. Offizielles Gensymbol der intergrierten DNA3. Laborlinie/Gründerbezeichnung/fortlaufende Nummer4. Registrierter Laborkode des Ursprungslabors
TgX = die angewandte transgene TechnikTgN = nicht homologe Insertion (Vorkernmikroinjektion)TgR = Insertion über retrovirale VektorenTgH = homologe Rekombination (ES-Zellen)
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1.Beispiel: Transgene Linien (Mikroinjektion):
C75BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg:
der CD8 Klon aus dem humanen Genomintegriert in C57BL/6 Mäuse aus dem Jackson Laboratory23. Maus, die im Labor von Jon W. Gordon etabliert wurde
2. Beispiel: Targeted Mutation (Knock out)
B6.129P2-TgHCftrtm1Unc: tm = targeted mutationZiffer = Anzahl der gerichteten MutationLaborcode
erste gerichtete Mutation im cystic fibrosis transmembraneconductance regulator homolog der University of North Carolinaunter Verwendung von 129P2 ES Zellen, rückgekreuzt auf C57BL/6
; à RK noch nicht abgeschlossen, . à RK abgeschlossen
Inzuchtmaus: z.B. C57BL/6 = C57BL/6NCrlAuszuchtmaus: z.B. NMRI = Crl:NMR(Han)
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Einflussfaktoren auf den Phänotyp transgener Tiere (nach Rülicke und Mertens, 1999)
genetische Faktoren Interaktion nichtgenetische Faktoren(biotische, abiotische Umwelt)
direkte Wirkung indirekte Wirkung(Mutation) (genet. Hintergrund)
Integrations-stellenAnzahl KopienStruktur des Transgens
PHÄNOTYP
![Page 36: Rules of transgene](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022020110/559e20ff1a28ab0e3c8b46d8/html5/thumbnails/36.jpg)
Auswirkung gentechnischer Manipulation
- abhängig vom transgenen Modell- abhängig vom genetische Hintergrund- betroffen können sein: Wohlbefinden, Lebensfähigkeit, Fertilität, Phänotyp
Genetischer Hintergrund: Beispiel: IL2 Knockouts*
Linie genetischer Hintergrund PhänotypB6;129-IL2tm gemischt: 50% Todesrate bei 4-9 Wochen
C57bl/6 Splenomegalie, Anämie129P2/OlaHsd
B6.129-IL2tm C57BL/6 congen Tod im Alter von 3 – 6 Monatenhämolytische Anämie
C3.129P2-IL2tm C3H/HeJ congen Tod im Alter von 7 Wochenhämolytische Anämie
*Linder, 2001
![Page 37: Rules of transgene](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022020110/559e20ff1a28ab0e3c8b46d8/html5/thumbnails/37.jpg)
Bedeutung Maus: Transgene Mausmodelle
à idealer Modellorganismus für genetische Analysen bei Säugern durch: - physiologische Ähnlichkeit zum Mensch- hohe Fruchtbarkeit à schnell produzierbar- kurzes Generationsintervall- geringer Platzbedarf
à Bedeutung für Humangenetik durch umfassende genetische Charakterisierungder Maus
Einsatz zur:Aufklärung molekularer Ursachen von Krankheiten-Strategieentwicklung für Therapie-Gentherapie-Testsystem für toxikologische Untersuchungen
(Abbildungen aus:Hogan et al. 1994. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor (NY)