Rozpraszanie światła

Światło

• fala elektromagnetyczna o długości z zakresu widzialnego (400-700nm)

• strumień fotonów

Natura falowa światła

• Ez(t)=Eosin(2πυt-ky)• Hx(t)=Hosin(2πυt-ky)

• Eo,Ho - amplitudy• υ - częstotliwość• k=(2π/λ)=ω/c - wektor falowy w kierunku rozchodzenia się fali• ω=2πυ=2πc/ λ - częstość kątowa

Natura falowa światła

• w liczbach:prędkość światła c=2,9979×108m/s

długość fali λ=(390 - 780)nm (nm = 10-9m = 10Å)

częstotliwość υ = (7,7 - 3,8)×1014 Hz (fioletowe-czerwone)

liczba falowa (częstość υ =1/λ) 25000-13000 cm-1

rozmiar cząsteczek rozpraszających: 10-100Å (1-10 nm)

• promieniowanie EM jest strumieniem fotonów• E=hν=hνc, energia fotonu o częstotliwości ν

Natura korpuskularna światła

Hemoglobina ma kolor czerwony!- silnie absorbuje promieniowanie żółte, zielone i niebieskie a przepuszcza czerwone

Zaabsorbowany foton odpowiadający światłu żółtemu (λ=550nm)to energia 3,61×10-19J

Rozpraszanie światła

• http://www.wyatt.com/theory/

Prawo elektrodynamiki klasycznej: drgający ładunek jest źródłempromieniowania rozchodzącego się we wszystkich kierunkach wpłaszczyźnie prostopadłej do oscylacji

Cechy:częstość i intensywność

Cechy promieniowania rozproszonego

• Intensywność (natężenie), I

I ~ Eo2 (kwadrat amplitudy pola elektrycznego)

I ~ λ-4 (fale krótsze rozpraszają się silniej niż dłuższe)I zależy od kąta rozpraszania θ

• Częstość:– równa częstości promieniowania padającego =

rozpraszanie Rayleigha (1871r.) = elastyczne– różna od częstości promieniowania padającego =

rozpraszanie Ramana (1928r.) = nieelastyczne

Dlaczego niebo jest niebieskie?

I ~ 1/4

(700 nm / 400 nm)4 = 1.754 = 9.4

Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słabiej niż fioletowe.

Dlaczego niebo jest niebieskie!

I ~ 1/4

(700 nm / 400 nm)4 = 1.754 = 9.4

Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słabiej niż fioletowe.

Dlaczego niebo jest niebieskie!

Rozpraszanie w roztworze V

Eo, o

P

R

v

ki

ks

q

ES

v

r

v-mikroskopijnie mały element objętości zawierający molekuły rozpraszające światło, ki , ks – wektory falowe światła padającego i rozproszonego. q- wektor rozpraszania, P- punkt obserwacji natężenia pola elektrycznego Es, odległy o R od środka układu rozpraszającego, W elastycznym rozpraszaniu światła, ki i ks są sobie równe, |q| = |ki   ks| = 2n/sin().

Częstotliwość światła rozproszonego

•Częstotliwość:–równa częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Rayleigha) = elastyczne oddziaływanie pola fali EM z dipolem elektrycznym cząsteczki

–różna od częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Ramana) = nieelastyczne oddziaływanie- zmiana stanu energetycznego atomu lub cząsteczki

!!Ale zmiana częstotliwość może wyniknąć z ruch cząsteczek rozpraszających - efekt Doplera

Zmiana częstotliwości

Widmo światła rozproszonego

Fluktuacje natężenia

Wielkość mierzona - rodzaj eksperymentu

• Natężenie całkowite (rozpraszanie statyczne) – SLS(Statyczne Rozpraszanie Światła)

• Widmo światła rozproszonego (Interferometria Fabry-Perota)

• Fluktuacje natężenia światła rozproszonego DLS lub PCS(Dynamiczne Rozpraszanie Światła lub Spektroskopia Korelacji Fotonów)

                                                              

Układ pomiarowy

q =  2n/sin()

laserλ, Ii

θ

I

detektor

próbka

Ist - standard (benzen, toluen)

Io - rozpuszczalnik (buffor)

I - roztwór (białka, DNA, etc.)

Układ pomiarowy

Rozpraszanie promieniowania

gdzie:

RΘ jest współczynnikiem Rayleigha

q - wektor rozpraszania,K - stała zależna od przyrządu oraz kontrastu optycznego dn/dc,c - stężenie wagowe,M - masa cząsteczkowa (wagowo średnia),P(q) - czynnik kształtu (interferencja wewnątrzcząsteczkowa),S(q) - czynnik struktury (interferencja międzycząsteczkowa)

Natężenie promieniowania rozproszonego I(q):

)()( qSqKMcPR 2

st

o

st

ost n

n

I

IIRR

2

4

24

dc

dn

N

nK

A

o

1/M

c

Kc/R

siła jonowa

Rozpraszanie statyczne w roztworze

cBMR

Kc222

1

)()( qSqKMcPR

P(q) 1 (interferencje wewnątrzcząsteczkowe)S(q) interferencje międzycząsteczkowe

Indykatrysy rozpraszania światła – I(θ) P(q)

Dla cząsteczek małych w porównaniu z długością fali światła: d <<

Dla cząsteczek porównywalnych z długością fali światła: d

1/I

q2

tg = 1/3 q2 Rg2

Rozpraszanie statyczne w roztworze I(θ) P(q)

P(q) interferencje wewnątrzcząsteczkowe ~ Rg

0.01 0.1 11E-3

0.01

0.1

1

Obliczone czynniki kształtu dla trzech brył o takiej samej objętości

P(q

)

q / nm

kula kula wydrążona pałeczka

Wymiary:R = 10 nm

R = 17.7 nm, h = 1 nmL=333 nm, d = 20 nm

Rozpraszanie dynamiczne

g()

tt

II

g()

widmo

natężenie

funkcjakorelacji

światło laseraświatło rozproszone

Zastosowanie do badań submikrosopowych obiektów biologicznych.

Co można zmierzyć:

Współczynnik dyfuzji translacyjnej (DT):

makrocząsteczek biologicznych (białka, kwasy nukleinowe),

biologicznych układów supramolekularnych (organella komórkowe, pęcherzyki utworzone z błony lipidowej, asocjaty białkowe, mniejsze komórki)

G(t) = <I(0)I(t)>g(2)(t) = 1 + exp(-2 q2 DT).

Spektroskopia Korelacji Fotonów(Photon Correlation Spectroscopy - PCS)

DT = kBT/(6RH)

Informacje z pomiaru spektroskopii korelacji fotonów (PCS)

• Pomiar DT - informacje o rozmiarze i kształcie obiektu rozpraszającego– kula– elipsoida obrotowa– pałeczka– „model kulkowy”

odpychanie

kompensacja

przyciąganie

c

DT

Z zależności DT od stężenia otrzymuje się informacje o sile i naturze oddziaływań między obiektami.

Spektroskopia Korelacji Fotonów

Vh = (Mw/NA)(v2 + δ1v1)

v2 - objętość właściwa cząsteczki, dla białek 0.69-0.75 (cm3/g), średnio 0.73 (cm3/g) [na podstawie

sekwencji]

δ1 - hydratacja, dla białek 0.2-0.6 (g H2O/g białka), średnio 0.35(g H2O/g białka) [na podstawie sekwencji]

v1 – objętość właściwa wody związanej z makrocząsteczką, v1 = 0.9058(cm3/g)

Vh = (Mw/NA)(v2 + δ1v1)

v2 - objętość właściwa cząsteczki, dla białek 0.69-0.75 (cm3/g), średnio 0.73 (cm3/g) [na podstawie

sekwencji]

δ1 - hydratacja, dla białek 0.2-0.6 (g H2O/g białka), średnio 0.35(g H2O/g białka) [na podstawie sekwencji]

v1 – objętość właściwa wody związanej z makrocząsteczką, v1 = 0.9058(cm3/g)

Rh =  [(3/4π)Vh]1/3 = [(3/4π)(Mw/NA)(v2 + δ1v1)]

1/3 Rh =  [(3/4π)Vh]1/3 = [(3/4π)(Mw/NA)(v2 + δ1v1)]

1/3

RH = Rh F RH = Rh F

Vo = (Mw/NA)v2  (objętość „suchego” białka)

VH2O = δ1 (Mw/NA)v1 (objętość dołączonej wody)

Vh = Vo = VH2O    (objętość hydratowanego białka)

Kombinacja RH z v2 i δ1v1

Lizozym - model elipsoidy

0.0102 g/cm s

NA 6.02E+23 1/mol

kB 1.38E-16 g cm2/s2K

Mw 14300.00 MU

v 2 0.73

v 1 0.99009901

1 0.2

DT 1.14E-06 cm2/s

RH 1.846E-07 cm

Rh 1.739E-07 cm

Ro 1.605E-07 cm

f 3.549E-8 kT/D

fh 3.344E-8 6Ro

f/fh 1.0612

1

max 0.1439 g/g

F przy 1 1.06123

el.wydł. 0.442 b/a

el.spłaszcz. 2.312 b/a

a(wydl.) 30.0E-8 cm

b(wydl.) 13.3E-8 cm

a(spl.) 09.9E-8 cm

b(spl) 23.0E-8 cm

a

b b

a

b b

a

b b

a

b b

L

d

Może się zdarzyć, że różne cząsteczki (modele) będą miały taki sam współczynnik dyfuzji.

Trudniej (niemożliwe) jest znaleźć dwie różne cząsteczki z dwoma takimi samymi parametrami hydrodynamicznymi (np. współczynnikiem dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej)

Kombinacje różnych parametrów

• DT - współczynnik dyfuzji• S - współczynnik

sedymentacji• τ - czas relaksacji

rotacyjnej• [η] - graniczna liczba

lepkościowa

• Mw (masa),

• RH, Rg (rozmiar),

• υ1, ρ (objętość właściwa, hydratacja)

• a/b (kształt)• giętkość• stopień asocjacji

parametry hydrodynamiczne informacje

Kombinacja parametrów

• DT i DR (lub τ ) • S i DT

• DT i [η] • DT i Rg

p=b/alubp=L/d

+ informacje o objętości właściwej i hydratacji

Proste modele hydrodynamiczne

elipsoida obrotowa wydłużona (p=a/b)

elipsoida obrotowa spłaszczona (p=a/b)

pałeczka (cylinder) (p=L/d)

BPTI

aktyna

20mer DNA

Modele kulkoweWymagają informacji o budowie (np. z NMR lub krystalografii)

i

(F = -fv)

)( iiii vuF , i = 1, 2, ..., N

viDT = kT -1

Programy obliczające parametry hydrodynamiczne na podstawie modelu kolkowego:HYDRO: http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydro/hydro.htm HYDROPRO: http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htmHI4 (R. Pastor - u autora)

Różne typy modeli kulkowych

a)

b)

c)

a) model kula-atom domeny katalitycznej CBD, b) model kulka-aminokwas inhibitora trypsyny, BPTI, c) model dużych podjednostek dla immunoglobuliny IgG3.

Model „powłokowy”Kulka na atom

powłokowy model lizozymu(pusty w środku, shell model)

pierwotny model lizozymu,model wypełniony (filling model)

Kulka na aminokwas4.5 Å

2.6 Å

4.5 Å

2.6 Å

Kulka na nukleotyd

Jedna kulka na nukleotyd Dwie kulki na nukleotyd

PodsumowanieInformacje najczęściej wykorzystywane w badaniach biologicznych:

Współczynnik dyfuzji translacyjnej (DT),

Promień hydrodynamiczny (Rh),

Liczba składników w roztworze,

Masa cząsteczkowa (dla każdego składnika osobno) w połączeniu z rozpraszaniem statycznym,

Procentowy udział poszczególnych składników (w połączeniu z rozpraszaniem statycznym),

Zjawiska asocjacji i agregacji,

Kinetyka agregacji,

Oddziaływania w roztworze,

Ładunek efektywny cząsteczek,

Mody drgań wewnętrznych dla dużych obiektów (np. długie fragmenty DNA),

Kształt dużych obiektów (czynnik kształtu – pomiary kątowe).

Koniec Zadania