role metabolomiky v systémové biologii
DESCRIPTION
Role metabolomiky v systémové biologii. Studium procesů probíhajících v živých organismech. „OMICKÉ“ POLE. Genom / Genomika. DNA. transkripce. Transkriptom / Transkriptomika. mRNA. translace. PROTEIN. Proteom / Proteomika. biochemické procesy. METABOLIT. Metabolom / - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/1.jpg)
Role metabolomiky Role metabolomiky v systémové biologiiv systémové biologii
![Page 2: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/2.jpg)
Studium procesů probíhajících v Studium procesů probíhajících v živých organismechživých organismech
DNA
mRNA
PROTEIN
METABOLIT
transkripcetranslace
biochemické
procesy
Genom / Genomika
Transkriptom / Transkriptomika
Proteom / Proteomika
Metabolom / Metabolomika
„OMICKÉ“ POLE
![Page 3: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/3.jpg)
Systémová biologieSystémová biologie
![Page 4: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/4.jpg)
Důležité pojmyDůležité pojmy
METABOLISMUS – látková přeměna soubor všech enzymových reakcí, při nichž dochází k
přeměně látek a energií v buňkách a v živých organismech
Primární• anabolismus – reakce spojené s biosyntézou• katabolismus – reakce spojené s degradací
Sekundární
![Page 5: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/5.jpg)
![Page 6: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/6.jpg)
Důležité pojmyDůležité pojmy
METABOLOMIKA vědní disciplína zaměřená na studium metabolomu
• kompletní identifikace a kvantifikace všech metabolitů v daném organismu nebo v buňce za daného metabolického stavu.
Rychlé zastavení metabolismu
příprava vzorku nesmí vyloučit žádné metabolity
vysoká účinnost a senzitivita analytických technik
![Page 7: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/7.jpg)
Důležité pojmyDůležité pojmy
METABOLOM kompletní soubor metabolitů v buňce či biologickém
systému v daném čase (Fiehn, 2002)
METABOLIT nízkomolekulární organická sloučenina ( 1000 Da), produkt látkové přeměny
Chemická třídaChemická třída Typické příkladyTypické příklady
Aminokyseliny, aminy…Aminokyseliny, aminy… L-glutamát, L-aspartátL-glutamát, L-aspartát
Karboxylové kyselinyKarboxylové kyseliny Kys. PyrohroznováKys. Pyrohroznová
AlkoholyAlkoholy GlycerolGlycerol
AldehydyAldehydy Acetaldehyd, formaldehydAcetaldehyd, formaldehyd
Fosfátové estery, nukleotidyFosfátové estery, nukleotidy D-glukosa-1-fosfát, ATP, ADPD-glukosa-1-fosfát, ATP, ADP
SacharidySacharidy D-glukosa, D-fruktosaD-glukosa, D-fruktosa
Lipidy, steroidy a mastné kyselinyLipidy, steroidy a mastné kyseliny CholesterolCholesterol
Vitamíny a koenzymyVitamíny a koenzymy NADNAD++, NADH, NADH
Anorganické iontyAnorganické ionty Fosfáty, nitrátyFosfáty, nitráty
![Page 8: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/8.jpg)
![Page 9: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/9.jpg)
Strategie pro výzkum Strategie pro výzkum metabolomikymetabolomiky
FINGERPRINTING• komplexní analýza intracelulárních metabolitů bez nutnosti
kvantifikace a identifikace screening: klasifikace vzorku na základě jeho původu a zdroje
FOOTPRINTING• komplexní analýza extracelulárních metabolitů bez nutnosti
kvantifikace a identifikace screening: klasifikace vzorku na základě jeho původu a zdroje
![Page 10: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/10.jpg)
PROFILOVÁNÍ METABOLITŮ (metabolite profiling)
• analýza daného souboru metabolitů, např. souboru AMK, organických sloučenin
• často semikvantitativní analýza
CÍLENÁ ANALÝZA METABOLITŮ (metabolite target analysis)
• kvalitativní i kvantitativní analýza vybraných metabolitů související se specifickou metabolickou reakcí
• používána zejména když jsou požadovány nízké limity detekce
Strategie pro výzkum Strategie pro výzkum metabolomikymetabolomiky
![Page 11: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/11.jpg)
Strategie pro výzkum Strategie pro výzkum metabolomikymetabolomiky
METABONOMIKA (metabonomics) • komplexní metabolické studie zejména v toxikologii • ohodnocení tkání a biolologických tekutin na základě změn
endogenních metabolitů (výsledek nemocí nebo terapeutického léčení)
• bez potřeby specifické identifikace
![Page 12: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/12.jpg)
Proč se zabývat Proč se zabývat metabolomikou?metabolomikou?
Počet metabolitů v buňce může být až řádově nižší než počet genů a proteinů.
Metabolom – nejnižší linie genové exprese - přímo odráží funkční úroveň buňky.
Změny metabolitů v buňce nejsou regulovány pouze genovou expresí, ale i vlivy životního prostředí.
Kvantifikace metabolitů nabízí přímý přístup ke zkoumání vnitřní kinetiky metabolismu (in vivo kinetics).
Metabolomické experimenty vyžadují 2x – 3x méně času ve srovnání s proteomickými a transkriptomickými experimenty.
Metabolom
(Escherichia coli K12)
(4392 genů)
(4464 proteinů)
(796 metabolitů)
Genom
Proteom
V n ě j š í v l i v y
![Page 13: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/13.jpg)
Nevýhoda oproti jiným omickým Nevýhoda oproti jiným omickým přístupůmpřístupům
Obtížné technologie – obtížné měření, dostupnost dat!!
RT-PCR, DNA Microarrays, Gene Chips
2D-PAGE MALDI-TOF,2D-LC, LC-MSR
oste
che
mic
ká k
ompl
exno
st
anal
yzov
anýc
h sl
ouče
nin
Metabolom
Genom
Proteom
NMR, MSGC-MS, LC-MS, CE-MS
![Page 14: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/14.jpg)
Aplikace výzkumu metabolomuAplikace výzkumu metabolomu
Sledování fyziologického stavu buňky adaptace na prostředí, odhad toxicity xenobiotika, vývoj nových léčiv přítomnost metabolických biomarkerů stanovení diagnózy a odhad stupně nemocí průběh terapie zvýšení výtěžků fermentace, …
Charakterizace buňky – savčí, rostlinné, mikrobiální, GMO,…
Ohodnocení kvality úrody některých rostlin
![Page 15: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/15.jpg)
Příprava vzorkuPříprava vzorku
Významně ovlivňuje přesnost, správnost a reprodukovatelnost výsledků
Závislost na typu buněčných struktur a extrahovaných metabolitů
Zhášení buněčného
metabolismu• rychlá změna teploty
• rychlá změna pH
Extrakce metabolitů
z buňky
Separace metabolitů z biomasy
VZOREK• analýza• uskladnění
VZOREK• analýza• uskladnění
Zakoncentrování vzorku
• vakuové odpařování•lyofilizace
Obrázek: Hlavní kroky přípravy vzorku.
![Page 16: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/16.jpg)
Příprava vzorkuPříprava vzorku
Extrakce metabolitů z biologického vzorku• Biologické vzorky obsahují tři hlavní třídy metabolitů:
• metabolity rozpustné ve vodě• metabolity nerozpustné ve vodě• těkavé metabolity všechny tři třídy metabolitů mohou být nalezeny intra- i
extracelulárně
1) Extracelulární metabolity • zisk z extracelulárních médií
Zachycení na koloně Odpaření rozpouštědla – rozpuštění ve vhodném rozpouštědle Pokud vzorky těkavé – přímá analýza GC
![Page 17: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/17.jpg)
Příprava vzorkuPříprava vzorku
2) Intracelulární metabolity• 2 cesty narušení buněčných stěn:
Nemechanické• Enzymatické – enzymy• Fyzikální – osmotický, teplotní šok• Chemické – chemická činidla:
Kyselá extrakce – HClO4, HCl, CCl3COOH,… Bazická extrakce – NaOH, KOH Organickými rozpouštědly – CH3OH, C2H5OH, C2H3N,
CHCl3
Mechanické• Ultrasonikace• Superkritická fluidní extrakce (SFE)• French Press
![Page 18: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/18.jpg)
Soli, proteiny, lipidy ve vzorku zhoršují kvantifikaci analytu užití solid-phase extrakce (SPE)
využívá pevnou fázi a kapalnou k izolaci jednoho nebo jednoho typu analytu z roztoku
využívá stejné typy stacionárních fází jako se využívá v kapalinové chromatografii
limitací je selektivita SPE – ideální pro cílené analýzy jednoho typu, ale nevhodná pro široké profilování metabolitů metabolitů
Příprava vzorkuPříprava vzorku
![Page 19: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/19.jpg)
Analytické metodyAnalytické metodyBuňka
Buněčný extrakt
Frakce metabolitů
Derivatizace
MSG
C
NMR
CE
LC
ESI-MS
Profilování metabolitů, metabolomika
Biologické tekutiny
NMR, FT-IR, Raman
Fingerprintingmetabonomics
GC
HPLC
Derivatizace
Čištěná frakce metabolitů
MS MS RI UV
Cílená analýza metabolitů
![Page 20: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/20.jpg)
Metody metabolomikyMetody metabolomiky
![Page 21: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/21.jpg)
Nukleární magnetická Nukleární magnetická rezonance (NMR)rezonance (NMR)
![Page 22: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/22.jpg)
SpektrometrieSpektrometrie
![Page 23: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/23.jpg)
PodstataPodstata založena na sledování odezvy jader s založena na sledování odezvy jader s
nenulovým magnetickým momentem nenulovým magnetickým momentem umístěných v silném magnetickém poli a umístěných v silném magnetickém poli a jejich interakci s vysokofrekvenčním jejich interakci s vysokofrekvenčním elektromagnetickým vlněnímelektromagnetickým vlněním..
![Page 24: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/24.jpg)
PodstataPodstata Je detekována absorpce radiofrekvenčního Je detekována absorpce radiofrekvenčního
záření (RFR) jádry atomů v molekule – RFR záření (RFR) jádry atomů v molekule – RFR jsou schopny absorbovat pouze látky s jsou schopny absorbovat pouze látky s nenulovým spinovým kvantovým číslem nenulovým spinovým kvantovým číslem ll::- atomy s lichým hmotovým číslem: - atomy s lichým hmotovým číslem:
l = n½ l = n½ (( 1 1 H , H , 1313C , C , 1515N N 3131P)P)
![Page 25: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/25.jpg)
PodstataPodstata
E
E
spinyjaderné
![Page 26: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/26.jpg)
Blokové schémaBlokové schéma
+ Fe Ff - +
E
![Page 27: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/27.jpg)
Blokové schémaBlokové schéma
![Page 28: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/28.jpg)
Bruker 400 MHzBruker 400 MHz
![Page 29: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/29.jpg)
Bruker 400 MHzBruker 400 MHz
![Page 30: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/30.jpg)
NMR SpektrumNMR Spektrum
![Page 31: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/31.jpg)
NMR SpektrumNMR Spektrum
![Page 32: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/32.jpg)
Hmotnostní spektrometrieHmotnostní spektrometrie
![Page 33: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/33.jpg)
PodstataPodstata analytická metoda sloužící k analytická metoda sloužící k
převedení molekul na iontypřevedení molekul na ionty
rozlišení těchto iontů podle poměru rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z)hmotnosti a náboje (m/z)
záznam relativních intenzit záznam relativních intenzit jednotlivých iontůjednotlivých iontů
![Page 34: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/34.jpg)
Blokové schémaBlokové schéma
+ Fe Ff - +
E
![Page 35: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/35.jpg)
Ionizační technikyIonizační techniky
![Page 36: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/36.jpg)
Ionizační technikyIonizační techniky Tvrdé ionizační technikyTvrdé ionizační techniky
• EIEI
Jemné ionizační technikyJemné ionizační techniky• ESIESI• MALDIMALDI
![Page 37: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/37.jpg)
Electron impact (EI)Electron impact (EI)M + e- → M+. + 2 e-
Mr
![Page 38: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/38.jpg)
Electrospray (ESI)Electrospray (ESI)
![Page 39: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/39.jpg)
Matrix Assisted Laser Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI)Desorption Ionisation (MALDI)
![Page 40: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/40.jpg)
Hmotnostní analyzátoryHmotnostní analyzátory
![Page 41: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/41.jpg)
Magnetický analyzátorMagnetický analyzátor
![Page 42: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/42.jpg)
KvadrupolKvadrupol
![Page 43: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/43.jpg)
KvadrupolKvadrupol
![Page 44: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/44.jpg)
Iontová past (Ion Trap)Iontová past (Ion Trap)
![Page 45: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/45.jpg)
Ion TrapIon Trap
![Page 46: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/46.jpg)
Analyzátor doby letu (TOF)Analyzátor doby letu (TOF)
![Page 47: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/47.jpg)
DetektoryDetektory
![Page 48: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/48.jpg)
Elektronový násobičElektronový násobič
![Page 49: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/49.jpg)
FotonásobičFotonásobič
![Page 50: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/50.jpg)
MS spektrumMS spektrum
![Page 51: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/51.jpg)
MSMSnn
![Page 52: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/52.jpg)
MSMSnn
![Page 53: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/53.jpg)
ChromatografieChromatografie
Cvet – separace chlorofylů na CaCOCvet – separace chlorofylů na CaCO3 3 19011901
termín „Chromatografie“ 1906termín „Chromatografie“ 1906
![Page 54: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/54.jpg)
ChromatografieChromatografie
![Page 55: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/55.jpg)
ChromatografieChromatografie
![Page 56: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/56.jpg)
Kapalinová chromatografieKapalinová chromatografieLCLC
Mobilní fázeMobilní fáze -- kapalinakapalina
Stacionární fázeStacionární fáze -- pevná pevná fáze, kapalinafáze, kapalina
![Page 57: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/57.jpg)
Schéma chromatografuSchéma chromatografu
![Page 58: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/58.jpg)
Zařízení pro HPLCZařízení pro HPLC
![Page 59: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/59.jpg)
UV – VIS detektorUV – VIS detektors proměnlivou vlnovou délkous proměnlivou vlnovou délkou
![Page 60: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/60.jpg)
„„Electrospray“Electrospray“
![Page 61: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/61.jpg)
Reverzně fázová Reverzně fázová chromatografiechromatografie
Stacionární fázeStacionární fáze – nepolární – nepolární CC88,, CC1818
Mobilní fázeMobilní fáze – polární – vodné roztoky – polární – vodné roztoky pH pH potlačit potlačit
disociacidisociaci
EluceEluce – snižováním polarity mobilní fáze – snižováním polarity mobilní fáze ACN, MetOH, ACN, MetOH,
![Page 62: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/62.jpg)
ChromatogramChromatogram
Vm
Vr’
Vr
![Page 63: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/63.jpg)
Analýza kvalitativníAnalýza kvalitativní Srovnání retenčních časů píků u Srovnání retenčních časů píků u
vzorku a standardůvzorku a standardů
„„spiking“ – přidání standardu do spiking“ – přidání standardu do vzoru vzoru nárůst výšky píků nárůst výšky píků
MSMS
![Page 64: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/64.jpg)
Analýza kvantitativníAnalýza kvantitativní
Plocha (výška) píkuPlocha (výška) píku
Metoda externího Metoda externího standardustandardu
Metoda standardního Metoda standardního přídavkupřídavku
![Page 65: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/65.jpg)
LC analýzaLC analýza
![Page 66: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/66.jpg)
Plynová chromatografiePlynová chromatografie
Mobilní fázeMobilní fáze -- plynplyn
Stacionární fázeStacionární fáze -- pevná pevná fáze, kapalina fáze, kapalina
![Page 67: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/67.jpg)
Schéma plynového Schéma plynového chromatografuchromatografu
![Page 68: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/68.jpg)
Plynový chromatografPlynový chromatograf
![Page 69: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/69.jpg)
Nosné plynyNosné plyny
Plyn Výhody Nevýhody
N2 levný, bezpečná práce
nízká tepelná vodivost
H2 vysoká tepelná vodivost
explosivní
He inertní drahý
Ar inertní drahý
![Page 70: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/70.jpg)
Příprava vzorků pro GCPříprava vzorků pro GC
Plyny, kapalinyPlyny, kapaliny -- přímo přímo
Pevné látkyPevné látky -- po po derivatizaciderivatizaci
![Page 71: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/71.jpg)
KolonyKolony Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID - křemen, Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID - křemen,
10 - 100 metrů - délka 10 - 100 metrů - délka
![Page 72: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/72.jpg)
Kapilární kolonaKapilární kolona
![Page 73: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/73.jpg)
EluceEluce
![Page 74: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/74.jpg)
EluceEluce
![Page 75: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/75.jpg)
Plamenově ionizační detektorPlamenově ionizační detektorFIDFID
DestruktivníDestruktivní Princip – ionty vznikající Princip – ionty vznikající
spalováním vzorku vyvolávají spalováním vzorku vyvolávají nárůst proudunárůst proudu
![Page 76: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/76.jpg)
Plamenově ionizační detektorPlamenově ionizační detektorFIDFID
![Page 77: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/77.jpg)
Detektor elektronového záchytuDetektor elektronového záchytuECDECD
NedestruktivníNedestruktivní Princip – interakce Princip – interakce -- částic se částic se
vzorkem vyvolává pokles prouduvzorkem vyvolává pokles proudu
![Page 78: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/78.jpg)
Detektor elektronového záchytuDetektor elektronového záchytuECDECD
- - 63Ni
![Page 79: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/79.jpg)
GC MSGC MSpřímé spojenípřímé spojení
![Page 80: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/80.jpg)
GC analysaGC analysa
![Page 81: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/81.jpg)
Elektromigrační metody Elektromigrační metody
![Page 82: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/82.jpg)
PodstataPodstata
„„Pohyb elektricky nabitých Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“částic v elektrickém poli“
![Page 83: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/83.jpg)
PodstataPodstata
+ Fe Ff - +
E
![Page 84: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/84.jpg)
Elektromigrační metodyElektromigrační metody ElektroforézaElektroforéza
Izoelektrická fokusaceIzoelektrická fokusace
![Page 85: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/85.jpg)
Dvojrozměrná elektroforézaDvojrozměrná elektroforézapI
Mr
![Page 86: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/86.jpg)
Kapilární elektroforéza Kapilární elektroforéza
![Page 87: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/87.jpg)
1981 - Jorgenson Lukacsová1981 - Jorgenson Lukacsová
![Page 88: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/88.jpg)
2003 - Projekt lidského genomu2003 - Projekt lidského genomu
![Page 89: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/89.jpg)
PAGE - sekvenace DNAPAGE - sekvenace DNA
![Page 90: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/90.jpg)
37303730xlxl DNA Analyzer DNA AnalyzerApplied BiosystemsApplied Biosystems
![Page 91: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/91.jpg)
Proč CE a biochemie ?Proč CE a biochemie ?
![Page 92: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/92.jpg)
Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita
nabité i neutrální látkynabité i neutrální látkynízkomolekulární i vysokomolekulární látkynízkomolekulární i vysokomolekulární látkychirální i achirální látkychirální i achirální látkybakterie i virybakterie i viry
![Page 93: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/93.jpg)
Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita JednoduchJednoduchá instrumentaceá instrumentace
![Page 94: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/94.jpg)
Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita JednoduchJednoduchá instrumentaceá instrumentace
CZE, MEKC, CIEF, CITPNACE, MEEKC, CGE, ChCE
CEC
![Page 95: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/95.jpg)
Výhody CEVýhody CE Aplikační diverzitaAplikační diverzita JednoduchJednoduchá instrumentaceá instrumentace Vysoké rozlišení a účinnost separacíVysoké rozlišení a účinnost separací Malá spotřeba vzorkuMalá spotřeba vzorku Rychlost analýzyRychlost analýzy Malá spotřeba chemikálií a malé Malá spotřeba chemikálií a malé
množství odpadůmnožství odpadů
![Page 96: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/96.jpg)
Elektroosmotický tokElektroosmotický tok
![Page 97: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/97.jpg)
Původ elektroosmotického Původ elektroosmotického tokutoku
CathodeAnode EOF
![Page 98: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/98.jpg)
Původ elektroosmotického Původ elektroosmotického tokutoku
![Page 99: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/99.jpg)
Módy CEMódy CE
![Page 100: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/100.jpg)
Kapilární zónová elektroforéza Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapilářeve volné kapiláře
![Page 101: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/101.jpg)
Princip MEKCPrincip MEKC
Micela
a – střed – rozpustná v oboub – silně hydrofilní – nerozpustná v micelec – silně hydrofóbní – nerozpustná ve vodné fázi
![Page 102: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/102.jpg)
Micelární elektrokinetická Micelární elektrokinetická chromatografiechromatografie
![Page 103: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/103.jpg)
Chiralita –chirální separace ?Chiralita –chirální separace ?
![Page 104: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/104.jpg)
ThalidomidThalidomid
![Page 105: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/105.jpg)
ThalidomidThalidomid
![Page 106: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/106.jpg)
![Page 107: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/107.jpg)
Chirální separaceChirální separace
![Page 108: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/108.jpg)
Kapilární gelová elektroforézaKapilární gelová elektroforéza
![Page 109: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/109.jpg)
Polymerní matrice pro CGEPolymerní matrice pro CGE
![Page 110: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/110.jpg)
Kapilární izoelektrická Kapilární izoelektrická fokusacefokusace
![Page 111: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/111.jpg)
Instrumentace CEInstrumentace CE
![Page 112: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/112.jpg)
Schéma zařízení pro CZESchéma zařízení pro CZE
![Page 113: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/113.jpg)
Napájecí zdrojNapájecí zdroj
stabilizovaný stabilizovaný ± 30 ± 30 kVkV 300 μA300 μA
konstantní napětí nebokonstantní napětí nebo proudproud
obojí polaritaobojí polarita ochrana obsluhyochrana obsluhy
![Page 114: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/114.jpg)
KapiláraKapilára
křemenná křemenná - - 25 -100 25 -100 μm i.dμm i.d - 3- 350 μm o.d.50 μm o.d.
délka délka až 100 cm až 100 cm délkadélka
polyimidové vnější polyimidové vnější pokrytípokrytí
![Page 115: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/115.jpg)
DávkováníDávkování
![Page 116: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/116.jpg)
HydrodynamickéHydrodynamické
![Page 117: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/117.jpg)
ElektrokinetickéElektrokinetické
![Page 118: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/118.jpg)
DetekceDetekce
![Page 119: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/119.jpg)
Spektrofotometrická detekceSpektrofotometrická detekce
![Page 120: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/120.jpg)
Fluorescenční detekceFluorescenční detekce
![Page 121: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/121.jpg)
CZE-MSCZE-MS
![Page 122: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/122.jpg)
Schéma CZE-ESI-MSSchéma CZE-ESI-MS
![Page 123: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/123.jpg)
µµCE CE
![Page 124: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/124.jpg)
Bioanalyser Agilent 2100
![Page 125: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/125.jpg)
Charakterizace CECharakterizace CE
Výhody :Výhody : Široká řada aplikací Minimální organické odpady nízká cena Minimální požadavky na množství vzorku (méně než pg nebo nl) Vysoká účinnost separace Rychlost analýzy Automatizace
Nevýhoda :Nevýhoda : Nízká koncentrační citlivost (CE s UV detekcí)
Dávkování malých objemů analytů do kapiláry Krátká absorpční dráha paprsku
![Page 126: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/126.jpg)
Charakterizace CECharakterizace CE
Řešení nízké koncentrační citlivosti:Řešení nízké koncentrační citlivosti: Použití detektoru s vyšší citlivostí. Bublinkové kapiláry, Z - kapiláry, … On-line prekoncentrační techniky
field enhanced sample stacking sweeping dynamic pH junction transient isotachophoresis
Princip on-line prekoncentračních technik:Princip on-line prekoncentračních technik: prekoncentrace analytů v kapiláře do úzkých zón před vlastní separací možno nadávkovat větší objem vzorku zvýšení koncentrační citlivosti CE-analýz.
![Page 127: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/127.jpg)
Field enhanced stacking Field enhanced stacking (zakoncentrování vzorku zesílením pole)(zakoncentrování vzorku zesílením pole)
Obrázek: Field enhanced stacking, EOF potlačen.
VLEVO: zóna vzorku – zóna s nízkou elektrickou vodivostí – zóna s vysokým elektrickým polem.
VPRAVO: zóna základního elektrolytu – zóna s vysokou elektrickou vodivostí – zóna s nízkým elektrickým polem.
Obrázek: Field enhanced stacking, rychlost EOF je vyšší než rychlost elektroforetického pohybu.
![Page 128: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/128.jpg)
ExperimentExperiment
Analytická metoda:KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA, on-line prekoncentrace – field enhanced stacking
Metabolity: adeninové nukleotidy: ATP, ADP, AMPadeninové koenzymy: NAD+, NADH, NADP+, NADPH
Živý systém: bakterie Paracoccus denitrificans
![Page 129: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/129.jpg)
![Page 130: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/130.jpg)
ExperimentExperiment 1) Optimalizace metody na standardech.1) Optimalizace metody na standardech.
Optimální podmínky separace:
KŘEMENNÁ KAPILÁRA: vnitřní průměr 75 m, celková délka 64,5 cm.
BGE: 100 mM uhličitan/hydrogenuhličitan sodný s přídavkem - CD do výsledné 10 mM koncentrace, pH 9,6.
VZOREK: směs standardů ve vodě, koncentrace každého standardu ve směsi je 10 M.
SEPARAČNÍ NAPĚTÍ: 18 kV, (polarita pozitivní).
TEPLOTA KAPILÁRY: 20 0,1 °C.
DÁVKOVÁNÍ: hydrodynamické tlakové, dávkováno po dobu 20 s při 35 mbar.Obrázek: Separace standardů za optimálních podmínek.
CE-analýza
![Page 131: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/131.jpg)
ExperimentExperiment
2) Optimalizace přípravy bezbuněčného extraktu.2) Optimalizace přípravy bezbuněčného extraktu.Kultivace přes 2 inokula, sklízení, dávkování po 500 l, centrifugace.
Extrakce 50 % ACN, centrifugace, zisk supernatantu.
Odpaření rozpouštědla na vakuovém koncentátoru
Filtrace získaného extraktu přes 5 kDa filtr.
+ H2O
[1] W. Lu, E. Kimball, J. D. Rabinowitz, J. Am. Soc. Mass. Spectrom 17 (2006) 37; [2] E. Kimball, J. D. Rabinowitz, Anal. Biochem. 358 (2006) 273; [3] J. D. Rabinowitz, E. Kimball, Anal. Chem. 79 (2007) 6167.
![Page 132: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/132.jpg)
ExperimentExperiment
3) Analýza bezbuněčného extraktu bakterie 3) Analýza bezbuněčného extraktu bakterie Paracoccus denitrificans.Paracoccus denitrificans.CE-analýza
Optimální podmínky separace:
KŘEMENNÁ KAPILÁRA: vnitřní průměr 75 m, celková délka 64,5 cm.
BGE: 100 mM uhličitan/hydrogenuhličitan sodný s přídavkem - CD do výsledné 10 mM koncentrace, pH 9,6.
VZOREK: směs standardů ve vodě, koncentrace každého standardu ve směsi je 10 M.
SEPARAČNÍ NAPĚTÍ: 18 kV, (polarita pozitivní).
TEPLOTA KAPILÁRY: 20 0,1 °C.
DÁVKOVÁNÍ: hydrodynamické tlakové, dávkováno po dobu 20 s při 35 mbar.Obrázek: Analýza bezbuněčného extraktu.
![Page 133: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/133.jpg)
ExperimentExperiment 4) Sledování koncentračních změn metabolitů 4) Sledování koncentračních změn metabolitů
bakterie bakterie Paracoccus denitrificans.Paracoccus denitrificans.
[Baker, S., C., Ferguson, S., J., Ludwig, B., Page, M., D., Richter, O-M., H., Spanning, R., J., J., van. Microbiology and Molecular biology reviews. 1998, 62, 1046-1078.]
![Page 134: Role metabolomiky v systémové biologii](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062411/56814b1c550346895db83026/html5/thumbnails/134.jpg)
ExperimentExperiment
4) Sledování koncentračních změn metabolitů 4) Sledování koncentračních změn metabolitů bakterie bakterie Paracoccus denitrificans.Paracoccus denitrificans.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Čas (s)
Ploc
ha p
íků
(mA
U)
NAD AMP NADP ADP ATP