Resistencia a los antimicrobianos y la PCR-ribotipificación de Shigella responsables de brotes de origen alimentario se produjeron en el sur de Brasil

Cheila Minéia Daniel de Paula I, *

, Mercedes Passos Geimba II ; Patrícia Heidrich do Amaral

I , Eduardo

Cesar Tondo I

I Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil

IIUniversidade Católica do Rio Grande do

Sul, Porto Alegre, RS, Brasil

RESUMEN

Hay poca información acerca de Shigella responsable de shigelosis transmitida por los alimentos está disponible en Brasil. El presente estudio tuvo como objetivo investigar la resistencia antimicrobiana y patrones de PCR-ribotipo de Shigella aislados responsables de brotes de origen alimentario ocurrido en Rio Grande do Sul (RS), el sur de Brasil, en el período comprendido entre 2003 y 2007. Shigella cepas (n = 152) fueron aislado en alimentos y muestras fecales de las víctimas de brotes de shigelosis investigados por el Servicio de Vigilancia. La identificación de las cepas a nivel de especie indicó que 71,1% de ellos eran S. flexneri, 21,5% S. sonnei, y 0,7%S. dysenteriae . Diez cepas (6,7%) fueron identificados sólo como Shigella spp. Una ocurrencia creciente de S.sonnei fue observado después de 2004. La mayoría de las cepas fueron resistentes a la estreptomicina (88,6%), seguido de ampicilina (84,6%), y sulfametoxazol / trimetoprim (80,5%). Las cepas resistentes pertenecían a 73 patrones, y el patrón A (resistencia a la ampicilina, sulfametoxazol / trimetoprim, tetraciclina, estreptomicina, cloranfenicol, y resistencia intermedia a la kanamicina) agrupa el mayor número de los aislados (n = 36). PCR-ribotipificación identificó tres patrones de bandas (SH1, SH2 y SH3). SH1 agrupadas, todas S. flexneri y SH2 agrupan todas S. sonnei. El S. dysenteriae cepa pertenecía al grupo SH3. De acuerdo con los resultados, variosShigella aísla comparte la misma PCR-ribotipificación patrón de bandas y el mismo perfil de resistencia, lo que sugiere que otras cepas estrechamente relacionadas fueron responsables de los brotes. Sin embargo, otros métodos de tipificación molecular necesitan ser aplicados para confirmar la relación clonal de estas cepas.

Palabras clave: shigelosis, Shigella, antimicrobiano, PCR-Ribotipo, RS / Brasil.

INTRODUCCIÓN

Muchos microorganismos pueden causar enfermedades transmitidas por los alimentos, sin embargo, Shigella ha sido identificado como uno de los agentes más importante de la diarrea por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (44). Kotloff et al. (22) informaron que los casos anuales de shigelosis es de alrededor de 165 millones de dólares, con más de 1,1 millones de muertes. De acuerdo con Silva et al. (40), la shigelosis es actualmente un importante problema de salud en todo el mundo, que se produce principalmente en niños menores de cinco años, principalmente en los países en desarrollo. La shigelosis es causada por Shigella spp., incluyendo Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y Shigella sonnei (23). Entre Shigella especies, S. flexneri y S. sonneison los más frecuentes en los países en desarrollo e industrializados, respectivamente (33, 38).

Shigella generalmente se transmite por el agua contaminada, alimentos crudos, y por contacto con personas infectadas (26, 44). La baja dosis infectiva, tan sólo 200 organismos viables, facilita la transmisión directa (persona a persona propagación). Los seres humanos y algunos primates son los únicos reservorios conocidos deShigella (37, 44), y la transmisión entre los seres humanos son comunes. Según Navia y Gascón (26) los brotes de origen alimentario se producen debido a la propagación clonal de una o pocas Shigella cepas.

Shigella invaden el epitelio local del colon (intestino grueso) en un formato paso a paso: entrar en las células epiteliales, multiplicación intracelular, intra e intercelular propagación, y la muerte de la célula huésped (32). La gastroenteritis causada por Shigella spp. suele ser autolimitada, aunque shigelosis es una de las pocas infecciones entéricas en la que los agentes antimicrobianos se prescriben para reducir la duración de la

enfermedad y el período de Shigella excreción después de que desaparezcan los síntomas. Por consiguiente, el aumento de la resistencia contra los agentes antimicrobianos más utilizados se ha observado (18).

En Brasil existen pocos informes sobre la shigelosis transmitida por los alimentos, probablemente atribuido al hecho de que hay una regulación actual requiere la investigación de Shigella en el agua o los alimentos. Sin embargo, de acuerdo con la Salud de Brasil Laboratorio Central ministro en Rio Grande do Sul (RS) Estado (FEPPS / LACEN / RS), este microorganismo se aísla con frecuencia de heces de pacientes con diarrea en brotes de origen alimentario en el sur de Brasil.

Shigella se ha caracterizado por diversos métodos, incluyendo resistencia a los antibióticos y métodos de genotipado en Brasil (35) y en otros países como Chile (16), Irán (37), y España (15). La determinación de la resistencia a los antibióticos de Shigella ha sido llevado a cabo, ya que puede proporcionar rápidamente información acerca de las cepas resistentes (3) y también puede servir como un método de caracterización preliminar. Sin embargo, debido al bajo poder de discriminación de la tipificación resistencia a los antimicrobianos, los métodos basados en el ADN ha sido recomendado. Entre ellos, la PCR-ribotipificación se ha aplicado con éxito, ya que es rápido de realizar, presenta un coste relativamente bajo y también se ha utilizado para escribir los agentes patógenos entéricos, tales como Salmonella (19, 27, 28).

Sobre esta base, el objetivo del presente estudio fue caracterizar Shigella aislados responsables de brotes de origen alimentario ocurrido en el sur de Brasil por sus patrones de resistencia a los antimicrobianos y PCR ribotypes.

MATERIAL Y MÉTODOS

Identificación y serotipificación cepas bacterianas

Shigella aísla: Shigella aislamientos utilizados en este estudio se obtuvieron a partir de muestras de heces de pacientes con shigelosis y de los alimentos implicados en los brotes ocurridos en diferentes localidades de Rio Grande do Sul, sur de Brasil. Shigella aisladas de alimentos fueron recolectados en un período de 12 meses, entre agosto de 2007 y agosto de 2008. Las muestras de los alimentos sospechosos fueron recogidos durante la investigación epidemiológica de los brotes transmitidos por los alimentos llevadas a cabo por la División de Vigilancia Sanitaria de Río Grande do Sul. Con base en los síntomas y los datos epidemiológicos, los brotes de origen alimentario se sospecha que la salmonelosis o la shigelosis. Las muestras fueron analizadas por el cumplimiento con el Reglamento Federal de Brasil RDC 12/2001 (2), en el Laboratorio Central de Rio Grande do Sul (FEPPS / IPB / LACEN / RS) siguiendo los métodos de APHA (1). Antes de su eliminación, 1200 placas de agar XLD (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra) y SS Agar (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra) que se utiliza para la detección de Salmonella, se enviaron al Laboratorio de Microbiología de Alimentos de la Ciencia de los Alimentos y el Instituto de Tecnología de Universidad Federal de Rio Grande do Sul (ICTA / UFRGS) para la investigación deShigella spp. Las colonias típicas de Shigella fueron seleccionados (217), se transfirieron a agar BHI (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra), y sometido a las siguientes pruebas para la identificación: la motilidad, la producción de sulfuro de hidrógeno, la producción de indol, el uso de citrato, glucosa, sacarosa, y la fermentación de la lactosa en agar TSI (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra), y de la lisina descarboxilasa en el LIA (Difco, Detroit, Michigan).Tras la identificación, Shigella aislados fueron confirmados por pruebas serológicas (14), utilizando antisueros suministrada por Probac do Brasil (Sao Paulo, Brasil).

Otros 149 Shigella aislamientos fueron obtenidos a partir de muestras fecales de pacientes que se presentan náuseas, vómitos y diarrea, entre enero de 2003 y diciembre de 2007 ( Tabla 1 ). Después de la identificación de las cepas de la Sección de Bacteriología de FEPPS / IPB / LACEN / RS, fueron enviados al Laboratorio de Microbiología de Alimentos de ICTA / UFRGS para la evaluación de la resistencia a los antimicrobianos y PCR-ribotipificación.

Las pruebas de resistencia a los antimicrobianos

Shigella aislados se analizaron para la susceptibilidad a nueve agentes antimicrobianos por el método de difusión en disco de acuerdo con la Estándares Clínicos y de Laboratorio (7). Los antimicrobianos y sus respectivas concentraciones ( μ g / disco) fueron: ampicilina (AMP), 10; tetraciclina (T), 30; gentamicina (GEN), 10; ácido nalidíxico (NAL), 30; cloranfenicol (C), 30; estreptomicina (S), 10; ciprofloxacina (CIP), 5; suministrado por Laborclin (Parana, Pinhais, Brasil) y sulfametoxazol / trimetoprim (SXT), 25; kanamicina (K), 30. Los discos fueron suministrados por Oxoid (Hampshire, Reino Unido), y Escherichia coli ATCC 25922 utilizado como cepa de referencia para el control interno. Para el propósito de escribir, se determinaron los patrones de resistencia, la creación de un código numérico basado en la resistencia a los antibióticos de cada aislamiento. La resistencia se clasifica como 1, la resistencia intermedia, tal como 2, y la sensibilidad completa como 3 (42).

PCR-Ribotipo

Extracción de ADN: se inoculó una colonia de cada aislado en 3 ml de caldo BHI (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra) y se incubó durante la noche a 37 º C. Después de la incubación, 1: el ADN genómico fue extraído mediante un tratamiento térmico, tal como se describe a continuación ml suspensiones de células bacterianas se centrifugaron a 5000xg durante 4 minutos en una microcentrífuga Eppendorf modelo 5415C, a temperatura ambiente. El sobrenadante se desechó y el sedimento se suspendió en 1 ml de TE (10 mM de Tris HCl, pH 8,0, 1 mM de EDA pH 8,0). Este paso se repitió dos veces. El sedimento se suspendió en 100 μ l de TE, mantenido en un bloque térmico durante 10 minutos a 95 ° C, y después se centrifugó a 14000xg durante 20 segundos. El sobrenadante se utilizó en las reacciones de PCR, tal como se describe a continuación.

Amplificación por PCR: los cebadores utilizados en la prueba fueron propuestos por Jensen y Hubner (20) y eran específicos para la amplificación de la región espaciadora entre los genes 16S y 23S rRNA. Las secuencias de los cebadores fueron los siguientes: 5 'CAA GGC ATC CAC CGT GT 3' y 5 'GTG AAG TCG TAA CAA GG 3'. Cada conjunto de reacciones de PCR incluyó un control sin molde de ADN. La mezcla de PCR-Ribotipo (25 μ l) se componía de 2,5 μ l de tampón de reacción (100 mmol l

-1 HCl Tris, 750 mmol l

-1 KCl pH

8,8), 0,4 μ l de 10 mmol l-1

dNTPs (5 mmol l -1

de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP), 1 μ l de 50 mmol l -

1 MgCl 2 , 2 μ l de cada cebador (20 ρ moles), 0,4 U de Taq ADN polimerasa 2 U / μ l (Invitrogen, Sao Paulo,

Brasil), el 14,9 μ l de agua ultrapura estéril y 2 μ l de ADN. El programa utilizado para la amplificación fue como sigue: un ciclo inicial de 94 º C durante 2 minutos, seguido por 25 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 55 º C durante 4 minutos y 72 ° C durante 1 minuto, y un paso de extensión final de 72 º C durante 30 minutos. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un Minicycler (MJ Research, Watertown, MA, EE.UU.) y 10 μ l de los productos amplificados se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 2,0% en tampón TBE. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV.

Las cepas con diferentes patrones de bandas electroforéticas de ADN se ensayaron al menos dos veces para evaluar la reproducibilidad del método. E . coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923, E . coli O157: H7, S.cholerasuis ATCC 10708, y S. Enteritidis 3091/05 cepas se utilizaron para evaluar el poder discriminatorio del método. S. Enteritidis 3091/05 se utilizó como una cepa de control en todas las amplificaciones de PCR-ribotipificación. Los patrones de bandas amplificadas se compararon visualmente y se atribuyen a la misma PCR-Ribotipo cuando sus patrones eran idénticos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento de Shigella

Tres Shigella cepas fueron aisladas de muestras de alimentos implicados en brotes de origen alimentario ocurrido en RS. Las cepas se identificaron como S. flexneri (n = 2) y S. sonnei (n = 1), y se aislaron a partir de placas considerados negativos para la presencia de Salmonella por el Laboratorio Oficial de la RS (FEPPS / IPB / LACEN / RS). Como la investigación de Shigella en los alimentos no es obligatorio en Brasil y sin Salmonella se encontró en estas muestras de alimentos, el agente etiológico de esos brotes podría haber sido considerado no identificado.De acuerdo con Carmen et al. (4), el agente etiológico del 80% de los 3.737 brotes de origen alimentario notificados se produjo en Brasil no pudieron ser identificados. Este alto porcentaje de agentes causales no identificados se puede atribuir a diversos factores como: la falta de muestras de alimentos para ser analizados, insuficiente sensibilidad de los métodos analíticos, los patógenos emergentes no investigados, y la falta de regulación oficial obligatoria para ciertos patógenos alimenticios, incluyendo Shigella .

Shigella es filogenéticamente relacionado con Salmonella, y ambos están relacionados con la Escherichia coli (17).Basándose en este hecho y en la falta de métodos de detección apropiados, el diagnóstico de la shigelosis es muy difícil. Actualmente, no hay medios selectivos específicos para el aislamiento de Shigella a partir de muestras de alimentos. En el presente trabajo, el aislamiento de Shigella fue posible con métodos para Salmonellarecomendado por la Asociación Americana de Salud Pública (24) y la FDA (14). Recientemente Warren et al. (43) publicó una revisión sobre los métodos para la detección de Shigella en los alimentos, y la citada tales metodologías. Los autores también hicieron hincapié en la necesidad de un protocolo de cultivo convencional apropiado diseñado específicamente para la detección de Shigella en los alimentos.

Muestras fecales humanas

La Shigella aislados obtenidos a partir de muestras fecales humanas (149) pertenecía a especie S. flexneri(71,1%), seguido de S. sonnei (21,5%). Sólo uno de los aislamientos (0,7%) fue identificado como S. dysenteriae. Diez cepas (6,7%) fueron identificados sólo como Shigella spp. Estos resultados son similares a los obtenidos en Brasil por Peirano et al. (35), que estudió 296 Shigella cepas aisladas de muestras fecales humanas en el Laboratorio de Cólera y Enfermedades entéricas (NRLCED) de la Fundación Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil, durante el período de 1999 a 2004. La mayoría de las cepas (52,7%) eran S. flexneri , y 44.2% eran S.sonnei , 2,3% fueron S. boydii , y sólo dos (0,6%) fueron S. dysenteriae . Silva et al. (40) reportaron que Shigellafue el cuarto agente causal de la diarrea en 877 niños atendidos por un hospital público de Rondonia, en la Amazonia occidental, Brasil, y entre los 25 aislamientos identificados a nivel de especie, el 72% fueron S. flexneri, 12% S. sonnei , 12% S. boydii, y 4% S. dysenteriae.

Resultados similares fueron reportados en otros países. Savadkoohi y Kacho (38), en Irán, observaron que entre 260 Shigella cepas aisladas de muestras de heces, el 70% fueron S. flexneri y 30% eran S. sonnei . En contraparte, en los Estados Unidos, según el CDC, hay una prevalencia de S. sonnei. Entre 1999 y 2002, entre 1598 aislamientos obtenidos en el Sistema de Monitoreo de Resistencia Antimicrobiana Nacional de bacterias entéricas (NARMS), e identificados a nivel de especie, 1.278 (80%) fueron S. sonnei , 295 (18%) fueron S.flexneri (16%), 18 (1%) fueron S. boydii , y 7 (0,4%) fueron S. dysenteriae (41).

Además de variar de acuerdo con el área geográfica, siendo S. sonnei la especie predominante (> 80%) en los países desarrollados y S. flexneri la especie más común en los países en desarrollo (23), la prevalencia de Shigellaespecies varía con el tiempo. De acuerdo con los resultados del presente estudio, en 2003 sólo el S. flexneri fue aislado en RS. Sin embargo, entre 2004 y 2007, la incidencia de S. sonnei aumentó de 17,9% en 2004 al 43,5% en 2007. Por consiguiente, la incidencia de S. flexneri disminuyó expresivamente: en 2003 se identificaron todos los aislamientos como S. flexneri, pero en 2007 sólo representaban el 47,8% de los brotes ( Cuadro 1 ).

De acuerdo con Chuang, et al. (8), entre 250 y 500 casos / año de la shigelosis fueron identificados en Taiwán desde 1995 a 2000. La mayoría fueron causadas por S. flexneri y S. sonnei , que representaron el 73,3% y el 26,5% del total de cepas aisladas, respectivamente. Sin embargo, de 2001 a 2003, S. sonnei reemplazado S.flexneri como la especie predominante en el centro de Taiwán (44).

De acuerdo con la Tabla 2 , Shigella se aisló con mayor frecuencia en niños menores de 5 años de edad, que representan el 40,7% de los aislamientos. Las personas de 5-19 años participaron en aproximadamente el 19,0% de los casos, y los mayores de 20-59 años se identificaron en 16.1% de los casos. La distribución general deShigella aísla por sexos fue similar, con las mujeres representan el 44,3% de los aislamientos y los hombres el 49,0%.

En Estados Unidos, la vigilancia de Shigella: Resumen Anual 2005 (5), informó que el 30,0% de los casos de niños afectados shigelosis menores de 5 años de edad, el 34,3% de ellos personas de 5 a 19 años, y el 26,6% de personas de 20-59 años de edad . Las diferencias de género no fueron verificadas.

Las pruebas de resistencia a los antimicrobianos

La resistencia antimicrobiana de 152 aislamientos de Shigella se muestra en la Tabla 3 . Los porcentajes más altos de resistencia se produjeron contra estreptomicina (88,6%), ampicilina (84,6%), y sulfametoxazol / trimetoprim (80,5%), y la frecuencia más alta de la resistencia intermedia se muestra en contra de la kanamicina (61,7%). La mayoría de los aislamientos fue sensible a la ciprofloxacina (96,6%), ácido nalidíxico (89,3%), y gentamicina (83,2%). Savadkoohi y Kacho (38) también reportaron altas tasas de resistencia a

sulfamethaxazole / trimetoprim (73,8%) y ampicilina (73,8%) de Shigella aisladas de niños con diarrea aguda en el norte de Irán. La sensibilidad a la ciprofloxacina fue similar a nuestros resultados (97,3%). Silva et al. (40) estudiaron Shigella spp. aislado de un hospital público de Rondonia / Brasil, y ha demostrado un alto nivel de resistencia a sulfametoxazol / trimetoprima y ampicilina.

En un estudio llevado a cabo en el noreste de Brasil, Sidrim et al. (39) informó que 26 cepas de S. flexneri eran resistentes a sulfametoxazol / trimetoprim, ampicilina y tetraciclina. Resistencias a cloranfenicol y gentamicina fueron verificadas en el 84,6% y el 7,6% de los aislados, respectivamente, y todas las cepas fueron sensibles al ácido nalidíxico y ciprofloxacina.

Tanto S. flexneri y S. sonnei mostraron altos porcentajes de resistencia a la ampicilina, estreptomicina, sulfametoxazol / trimetoprim, pero no hubo diferencias en la resistencia a otros antimicrobianos. Más cepas de S.flexneri eran resistentes a la tetraciclina (79,2%) y cloranfenicol (73,6%) de S. sonnei (3,13% y 6,25%) (datos no mostrados). En Estados Unidos, el Sistema de Monitoreo de Resistencia Antimicrobiana Nacional de bacterias entéricas (NARMS), también informó de que S. flexneri y S. sonnei presentó diferencias en la resistencia frente a los agentes antimicrobianos. En los NARMS Humanos Aísla Informe final de 2005, la resistencia a la tetraciclina y cloranfenicol fue mayor entre S. flexneri , mientras que S. sonnei aislados mostraron una mayor resistencia a la estreptomicina y sulfametoxazol / trimetoprim. El porcentaje de aislamientos sin resistencia detectada fue baja enS . sonnei (4,4%) y S . flexneri (5,8%) (6).

En base a la resistencia a los antimicrobianos de los aislamientos, se agruparon en 73 patrones ( Tabla 4 ). Nueve patrones agrupan 44,1% de los aislamientos.

Los resultados indicaron que el 96,7% de las cepas (147 cepas) fueron resistentes a al menos un fármaco y sólo dos aislamientos fueron sensibles a todos los fármacos probados. Resistencia múltiple, es decir, la resistencia a dos o más fármacos, se observó en 137 aislamientos (90,2%) y, entre ellos, 82.2% fueron resistentes a tres o más antibióticos. Aislamientos de alimentos eran resistentes a la gentamicina y sólo presentan resistencia intermedia a cloranfenicol, tetraciclina y sulfametoxazol / trimetoprim, que pertenece a la patrones de G, H e I (Tabla 4 ). Los tres aislamientos de alimentos pertenecían a tres patrones diferentes y únicos, lo que sugiere que se diferencian de los aislados de heces fecales.

Perfil de Resistencia A contenía 36 S. flexneri aislamientos, todos resistentes a la ampicilina, sulfametoxazol / trimetoprim, tetraciclina, estreptomicina, cloranfenicol, y resistencia intermedia a la kanamicina. Perfil B agrupa nueve S. flexneri aislamientos (5,9%), que difieren del perfil A sólo por la sensibilidad a cloranfenicol. Perfil C y D agrupan cinco S. flexneri aísla cada uno, y el perfil de E agrupa cinco S. sonnei aísla. Los aislamientos restantes (n = 85) se agruparon en más de 65 patrones, y representaron el 55,9% de las cepas analizadas. La mayoría de los multi-resistentes eran uno S. flexneri aislado que presenta resistencia a la ampicilina, sulfametoxazol / trimetoprim, tetraciclina, estreptomicina, cloranfenicol, y kanamicina (perfil de M), y dos S. flexneri aísla que presenta resistencia a la ampicilina, sulfametoxazol / trimetoprim, tetraciclina, estreptomicina, cloranfenicol, kanamicina, gentamicina y (perfil N).

Varios estudios han informado de la participación de los resistentes a los fármacos S. sonnei y S. flexneri en las enfermedades transmitidas por los alimentos. Por ejemplo, entre 392 Shigella aislados obtenidos a partir de muestras de heces de personas con diarrea aguda en el sur de Trinidad, durante 1997-2006, 75% de la S. sonneiaislamientos eran resistentes a todos los antibióticos probados (ampicilina, tetraciclina, sulpha-methoxazole/trimethoprim, amoxicilina-ácido clavulánico, cefuroxima, cloranfenicol, ciprofloxacina, aztreonam, y gentamicina) (30). En Calcuta, durante un período de 4 años (2001 a 2004), todos los S. flexneri aislamientos obtenidos de niños hospitalizados con diarrea entre 2001 y 2004, fueron resistentes a la ampicilina, cotrimoxazol, tetraciclina, ácido nalidíxico y fluoroquinolonas (33).

Durante un período de 12 años, 68 Shigella aislamientos (31 S. sonnei , 30 S. flexneri , 4 S. dysenteriae , y 3 S. boydii fueron recolectados) en un Hospital de la Universidad francesa de las heces de los pacientes con historia reciente de viaje a diversas partes del mundo, especialmente en África y la prueba de resistencia a los medicamentos. Estos aislados eran a menudo resistente a la estreptomicina, espectinomicina, trimetoprima, tetraciclina, sulfonamidas y, resistentes a la ampicilina y cloranfenicol (66 al 84%), o resistentes al ácido nalidíxico. Multi-resistencia se verificó en el 87% de los aislados, y se identificaron un total de 13 patrones de resistencia a los antibióticos (13).

En Brasil, un estudio llevado a cabo durante un período de 24 meses con el objetivo de evaluar la resistencia de los enteropatógenos aislados de niños con diarrea en Rondonia (Amazonía occidental, Brasil) indicó una alta frecuencia de cepas resistentes a sulfametoxazol / trimetoprima, ampicilina, amicacin, penicilina y cotrimoxazol.Dieciocho S. flexneri aísla resistencia está representada a múltiples antibióticos, así como una baja frecuencia de la resistencia al ácido nalidíxico y quinolonas (ciprofloxacina y norfloxacina) (40). Otro estudio, que comprende 62Shigella (47 S. flexneri y 15 S. sonnei ) aislados seleccionados a partir de muestras fecales y probado en Laboratorio de Cólera y Enfermedades entéricas (NRLCED) de la Fundación Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil, en 1999 - 2003, indicó que todos los aislamientos fueron sensibles al ácido nalidíxico, ciprofloxacino y gentamicina. Todos menos uno (cefalothin resistente) era cefalosporinas susceptible. Se identificaron un total de ocho perfiles de resistencia bacteriana. La AMP perfil, SMX, TMP, SPT, STR, TET, CHL fue la más común y se agrupan 38 S. flexneri aísla. Perfil SMX, TMP, SPT, STR, TET contenía 12 S. sonnei aislamientos (34).

Nuevos patrones de resistencia antimicrobiana de Salmonella y Shigella especies son motivo de grave preocupación en varias partes del mundo donde la fiebre tifoidea y la fiebre tifoidea y otras formas de salmonelosis y shigelosis son endémicas. La aparición de cepas multirresistentes tiene importantes implicaciones clínicas y de salud pública para la población en situación de riesgo, para continuamente necesaria esta vigilancia razón (25). La aparición de resistencia de Shigella spp. cepas, lo que resulta en un aumento de la mortalidad, presenta una amenaza importante para el control de enfermedades, especialmente en los países menos desarrollados, donde los antibióticos se prescriben con frecuencia sobre una base empírica. De acuerdo con Dromigny et al. (12) Los estudios regulares deben llevarse a cabo con el fin de vigilar la farmacorresistencia y contribuir a los esfuerzos de control de diarreas bacterianas.

PCR-ribotipificación

La PCR-ribotipificación utilizada en el estudio fue capaz de discriminar Shigella especies y otros géneros bacterianos ya que las muestras que contienen ADN de S. flexneri , S. sonnei , S. aureus ATCC 25923, S.cholerasuis ATCC 10708 y S. Enteritidis 3091/05 produjo patrones de bandas distintas. Curiosamente, Shigellaespecies presentan la misma bandas como E. coli ATCC 25922 y E. coli O157: H7. De acuerdo a Coimbra et al. (9)Shigella spp. (Excepto S. boydii serotipo 13) y Escherichia coli constituyen un único grupo de afinidad de ADN, y en una estricta base científica, los Shigella especies deben ser consideradas como E. coli clones. Corroborando esta similitud, Shigella spp. y enteroinvasivos E. coli (EIEC) se han considerado responsable de la shigelosis en los seres humanos (32).

En este estudio, los 152 Shigella aislamientos (149 fecales taburetes aislamientos + 3 aislamientos de alimentos) se sometieron a análisis de PCR-Ribotipo, presentado tres patrones de bandas, designado SH1, SH2, SH3 y ( . Fig. 1 ). Perfil SH1 fue compuesta por 116 S. flexneri aísla, y el patrón de bandas fue constituida por dos bandas (480 y 570bp). Perfil SH2 fue compuesta por 35 S. sonnei aísla, la presentación de un patrón de bandas de tres bandas (350, 480, y 570bp). El perfil SH3 contenía el S. dysinteriae aislar, presentando un patrón de bandas de dos bandas (570, y 700 pb), pero sus pesos moleculares no eran los mismos que de SH1. Una banda de aproximadamente 570bp se detectó en todos los Shigella aislados.

En el presente estudio, la PCR-ribotipificación era capaz de diferenciar Shigella especies involucradas en la shigelosis transmitida por los alimentos de S. Enteritidis 3091/05. Este Salmonella cepa presentó el mismo patrón genotípico (por PFGE y secuenciación del ADN) como S. Enteritidis SE86, el principal agente causal de las enfermedades transmitidas por los alimentos investigadas en el Estado de RS, en los últimos años (29). Teniendo en cuenta la dificultad de diferenciar Salmonella a partir de Shigella por métodos

convencionales, el método de PCR-ribotipificación utilizado en este estudio ha demostrado ser adecuado para la investigación de rutina de brotes de origen alimentario en RS. Además, la amplificación de las secuencias espaciadoras intergénicas utilizando rRNA genes es bien conocido como una buena herramienta para la tipificación de bacterias (10). Estas regiones espaciadoras demuestran extensa secuencia y variación de la longitud que se puede utilizar para introducir bacterias en el género, las especies y subespecies niveles (11, 20, 21). PCR-ribotipificación tiene algunas ventajas en comparación con otros métodos moleculares, principalmente debido a que no consume mucho tiempo y de bajo costo. Por ejemplo, muchos informes han utilizado PFGE para escribir Shigella porque es muy discriminatoria y considerado el "estándar de oro" para los microorganismos escribir (15, 26, 36), pero esta técnica es engorroso y costoso, lo que dificulta su aplicación en los laboratorios de salud pública.

Los patrones de bandas de diez cepas que no pudieron ser identificados a nivel de especie, aparecen como PCR-ribotipo Shigella spp, fueron similares a los presentados por S. sonnei (n = 2) y S. flexneri (n = 8), lo que sugiere que los diez aislamientos pertenecían a estas dos especies. Experimentos serológicos confirmaron estos resultados.

Los resultados de este estudio indican que los varios Shigella cepas implicadas en diferentes brotes Shigelosis presentan el mismo PCR-ribotipificación patrón de bandas y también el mismo perfil de resistencia, lo que sugiere que otras cepas estrechamente relacionadas pueden haber sido el agente causante de los brotes. Según Navia y Gascón (26), más a menudo los casos o brotes de shigelosis se producen debido a la propagación clonal de una o unas pocas cepas.

Cabe señalar que la PCR en ribotipificación resultó en un menor número de los patrones de bandas que hacían la prueba de resistencia a los antibióticos. A pesar de que la resistencia antimicrobiana en microorganismos podría estar mediada por plásmidos u otros elementos de ADN transmisibles, no modificando el ADN cromosómico, se requieren otros métodos de tipificación molecular para asegurar la relación clonal de la Shigella cepas.

CONCLUSIÓN

Varios Shigella cepas demostraron PCR-ribotipificación patrones de bandas similares y también del perfil de resistencia a antibióticos, lo que sugiere que las cepas estrechamente relacionadas son responsables de los brotes de shigelosis transmitidos por los alimentos estudiados se produjo en el Estado de Rio Grande do Sul. PCR-ribotipificación era capaz de diferenciar correctamente las especies de Shigella, lo que demuestra que es útil para la investigación de brotes de origen alimentario.

AGRADECIMIENTOS

Nos gustaría expresar nuestro sincero agradecimiento al personal del Laboratorio Central de Rio Grande do Sul (FEPPS / IPB / LACEN / RS), proporcionando las muestras, especialmente de Solange Mendes Longaray y Juana Mari Correa Ambos, de la Sección de Alimentos y a Silvia da Silva Ríos, de la Sección de Bacteriología.

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Enviado: 08 de abril 2009; devuelto a los autores para correcciones: 04 de abril 2010, Aprobado: 21 de junio de 2010.