UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

DEPARTAMENTO-CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN-BIOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA HUMANAS

“MANEJO DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS II

INCLUSIÓN Y MICROTOMÍA”

Anatomía e Histología Humanas

Equipo: 4 Grupo: 1302

Integrantes:

Fuentes Bautista Jesús UrielLuna Flores Oscar Medina Velázquez Laura QuetzallyRivero Alcalá Víctor Daniel

Profesores: Nopal Guerrero TaisVázquez Cianca Verónica Fecha: lunes 03 de septiembre de 2012

OBJETIVOS

a) Aumentar el conocimiento de las diferentes técnicas histológicas.

b) Practicar la Inclusión de órganos de rata en parafina.

c) Aprender cada uno de los pasos del proceso de inclusión.

d) Conocer otros tipos de inclusión que pueden utilizarse.

e) Reconocer la importancia de seguir paso a paso el proceso de inclusión.

f) Reconocer los errores que pueden presentarse por realizar mal el procedimiento.

g) Identificar los diferentes artefactos que se pueden encontrar en las laminillas.

h) Definir y discutir el posible origen de los artefactos identificados.

INTRODUCCIÓN

La inclusión es el método más común de endurecer el tejido y consiste en infiltrar la

muestra con sustancias líquidas que tras un proceso de polimerización o enfriamiento se

solidifican, sin afectar a las características del tejido. Con ello se consigue obtener cortes

delgados (desde decenas de µm a nm según el medio de inclusión) sin que el tejido se

rompa o se deteriore. Además son un buen método de preservar las muestras durante

largos periodos de tiempo. Existen diferentes sustancias o medios de inclusión

dependiendo del grosor del corte y de la técnica que necesitemos realizar. La mayoría de

los medios de inclusión no son hidrosolubles, es decir, no miscibles con el agua, luego si

queremos que la sustancia en la que vamos a incluir ocupe todo el tejido tenemos que

eliminar el agua y sustituirla por un líquido miscible con nuestro medio de inclusión. Si una

muestra no está completamente embebida en el medio de inclusión se deteriorará y la

obtención de secciones homogéneas será imposible.

Deshidratación

La deshidratación es el proceso que tiene por finalidad la remoción o eliminación completa

del agua de los tejidos o muestra tisular para que se pueda embeber adecuadamente en

un medio de inclusión no hidrosoluble, para que se solidifique y así permitir el corte de los

tejidos

Un buen agente deshidratante debe cumplir con las siguientes condiciones:

-No debe alterar las estructuras titulares.

-Debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente aclarante.

-Debe ser rápido.

-Reducir a un mínimo necesario el endurecimiento que provoca en los tejidos

-Baja toxicidad o peligrosidad (por contacto, ingestión, inhalación y evaporación de gases

tóxicos.

-Mínimos riesgos de incendio/explosión.

Principales agentes deshidratantes:

Alcohol etílico

Alcohol metílico

Acetona

Alcohol butílico

Dióxido de etileno

Alcohol isopropílico

Tetrahidrofurano

Aclaramiento o diafanización

Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es miscible

tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos

se utiliza como medio de inclusión Parafina líquida). La sustancia comúnmente utilizada

es el Xileno o Xilol. De la misma manera se coloca la muestra de tejido en un recipiente

de Xilol, que solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento ya que el tejido se

torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción.

También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios de aclaramiento.

Inclusión

Los tejidos son estructuras blandas y frágiles, incluso después de la fijación. De tal forma

que previo a la obtención de los cortes, es necesario incluirlos en un medio de soporte.

Los medios más utilizados son las ceras o resinas. En estado líquido, estos medios tienen

la capacidad de penetrar y rodear el tejido, de esta forma se puede producir el

endurecimiento (por enfriamiento o por polimerización), para formar un bloque sólido que

pueda ser cortado fácilmente en el microtomo. El objetivo de la inclusión es hacer facilitar

la sección del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la

luz y ser examinados mediante el microscopio. La inclusión se logra al infiltrar la parafina

liquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de

aclaramiento y penetra en el tejido.

Microtomía

Las muestras histológicas deberán orientarse en forma adecuada para después de

moldearse la pieza, según el método seleccionado se procede a la preparación de los

cortes, que son fragmentos muy delgados de tejido cuyo espesor varía desde los 4 a 16

micras. Al proceso mediante el cual se obtienen cortes finos con las características

adecuadas para su observación al microscopio se le da el nombre de microtomía. Los

cortes se hacen mediante aparatos especiales denominados micrótomos. Existen varios

modelos según las diferentes tipos de inclusión.

Tipos de micrótomo:

Micrótomo de Rotación: Es el micrótomo mas empleado. La cuchilla es relativamente

pequeña permaneciendo en una posición muy peligrosa (con el filo hacia arriba). No

conviene para cortar bloques grandes.

Micrótomo de Deslizamiento: Es el instrumento de mayor preferencia. Tiene un sujetador

de cuchilla ajustable tanto para el ángulo de deslizamiento horizontal como angular.

Permite obtener grandes cortes y se puede emplear cuchillas mayores que los que usan

los de rotación.

Micrótomo de Balanceo: Probablemente es el micrótomo más simple que existe. El bloque

del tejido se monta en el extremo de un brazo móvil y la cuchilla se mantiene rígida en

posición horizontal con el filo hacia arriba.

Micrótomo por Congelación: Se define de muchas maneras, pero en general, poseen una

cremallera central sobre la cual se coloca el congelador del bloque el cual es perforado y

unido por un tubo a un cilindro que contiene Bióxido de Carbono.

Artefacto:

Artefacto es todo aquello que puede dificultar, confundir o hacer que se malinterprete un

corte de tejido histológico visto al microscopio. Hay dos tipos de artefactos: Pre y post-

histología. Los artefactos pre-histológicos son las características y las estructuras que son

introducidos antes de la colección de los tejidos finos. Un ejemplo común de éstos incluye:

tinta de los tatuajes y de las pecas (melanina) en muestras de la piel. Los artefactos post-

histológicos resultan del procesamiento del tejido fino. El procesando puede conducir

comúnmente a los cambios como la contracción, a cambios del color en diversos tipos de

los tejidos finos y a las alteraciones de las estructuras en el tejido fino.

Porque éstos se causan en el laboratorio la mayoría de artefactos de la histología puede

ser evitada o ser quitada después de ser descubierta. Un ejemplo común es pigmento del

mercurio en el fondo después de usar el fijador de Bouin para fijar una sección.

Un plegamiento, destrucción de estructuras microscópicas, efectos luminosos de

difracción y refracción, burbujas de aire o aceite, sobreexposición a colorantes, fijadores,

etc., o la poca exposición a ellos, efectos de temperatura, contracción o expansión son

algunos de los artefactos más comunes.

DIAGRAMA DE FLUJO

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

Para la realización de ésta práctica, el equipo utilizó la muestra de estómago tomada de la

rata en la práctica “Manejo de técnicas histológicas I. Necropsia y toma de muestra para

procesamiento histológico” para poder realizar la observación de tejidos fijados. De dicha

observación debe rescatarse la conservación casi total del color original de la muestra

original, la apariencia física de la misma, ligero cambio de tamaño con respecto a la

muestra de tamaño original con algunos pliegues.

Figura 1 Muestra de Estómago de Roedor tras

la fijación en formol al 10% en buffer de

fosfatos

Figura 2 Tejido fijado preparado para la

observación al microscopio estereoscópico

Cuando se le proporciono el Riñón de rata Long Evans en el bloque de parafina al equipo,

se pudo observar que el dicho órgano se encontraba en el centro de la cara superior del

cubo de parafina sólida, muy pequeño en comparación al resto del bloque (Figura 5),

uniformidad en las partes alejadas del órgano, pero no en las proximidades de él además

de mala infiltración de la parafina al órgano por la posible existencia de agua en la

muestra (Figura 6).

Figura 3 Bloque de parafina con Riñón de Rata

de Rata Long Evas

Figura 4 Observación de bloque de parafina

con riñón Long Evans observada con el

microscopio estereoscópico

Para la búsqueda de artefactos en laminillas histológicas se realizó primero la observación

con un aumento total de 100x de una laminilla de Intestino delgado canino con una tinción

de Hematoxilina-Eosina. Se realizó un escaneo como se indica en la página 32 del

manual, lo que permitió observar una mancha alargada en forma de cicatriz de coloración

morada más intensa que la de los alrededores (Figura 5), por la existencia de un dobles

de tejido posiblemente ocasionada por errores en la etapa del montaje del tejido.

Figura 5 Observación con el microscopio óptico de

artefacto en laminilla de intestino delgado canino

Para la vía de inclusión de las muestras biológicas adecuadas, se colocó en la mesa el

tren de deshidratación y aclaramiento para colocar las muestras que después fueron

llevadas a la parafina para finalizar dicho proceso. Durante la deshidratación del tejido se

observó la conservación de color casi total después de la fijación, la apariencia de las

muestras aún era parecida a la del tejido original, n cambio de tamaño casi imperceptible

por la formación de pequeños pliegues en la muestra. A través del proceso de

aclaramiento sólo se observó un cambio evidente de color por las características del

agente aclarante

Figura 6 Vía de Lavado, Deshidratación y

Aclaramiento

Figura 7 Tren de deshidratación de muestras

biológicas

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

Mediante la observación del tejido observado, el equipo entendió la importancia de una

adecuada fijación de un tejido y la utilidad de esta en el proceso de las técnicas

histológicas Se observó y analizó la existencia de artefactos en laminillas, lo que

puede dificultar el análisis de estas en una posterior observación. Asimismo,

contempló y estudió los problemas que pueden existir antes, durante y después de la

inclusión histológica por medio de la realización de la misma además de la

observación de muestras en bloques de parafina para así, identificar errores de dicho

procedimiento.

BIBLIOGRAFÍA

1. Ainciburu A.; Araiza N; Navarro J.; Viguria P.M. Manual de Microscopia.

Historia, descripción y uso del microscopio óptico. Auxilab, S.L., México, 3 de

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2. Herrero J. de. J, Práctica Nº 2. La técnica Histológica (2): preparación del

material para ser cortado. Universidad d´Alacant por el Departamento de

Biotecnología, 19 de septiembre del 2011[Consultado el 28 de agosto del 2012]

3. Hilario E. Prácticas de Histología Humanas. Facultad de Medicina y

Odontología de la Universidad del País Vasco,

http://www.ehu.es/servicios/se_az, 7 de septiembre del 2007 [Consultada el 28

de agosto del 2012]