Replikacija DNK

Replikacija genomske DNK je ključna za život svih stanica i organizama. ZAŠTO? Osnovni biološki proces razmnožavanja zahtijeva vjerni prijenos genetičke informacije sa roditelja na potomstvo.

Svaki put kada se stanica dijeli, njezin cjelokupni genom mora biti udvostručen, pri čemu je za kopiranje velikih molekula iz DNK ( koje grade prokariotske i eukariotske hromosome ) potrebna prisutnost cijelog niza ENZIMA.

Replikacija je SEMIKONZERVATIVAN proces, u kojem svaki roditeljski lanac služi kao kalup za sintezu novih, komplementarnih lanaca kćeri.

Dva se lanca roditeljske DNK razdvajaju i svaki od njih služi kao kalup za sintezu po jednoga novoga lanca. Na taj način nastaju dvije nove, potpuno identične molekule DNK. Slijed nukleotida u novonastalim lancima DNK određen je komplementarnim sparivanjem baza.

Semikonzervativna replikacija DNK

Glavni enzim uključen u ovaj proces je DNK-POLIMERAZA, koja katalizira spajanje deoksiribonukleozid – 5' trifosfata ( dNTP ) rastućeg lanca DNK. Ipak, replikacija DNK je znatno kompleksnija i zahtijeva više od jedne enzimatske reakcije.

Udvajanje ( duplikacija, replikacija, matična sinteza ) molekuke DNK je proces nastajanja ( u prisustvu odgovarajućih enzima ) dva molekula DNK koji su identični izvornom molekulu DNK.

Dokaz da se replikacija odvija na semikonzervativan način potvrdili su 1958 godine Mezelson i Stal ( M. Messelson i F. W. Stahl ).

Koristili su metodu centrifugiranja DNK u gradijentu gustine cezijumhlorida ( CsCl ).

Eksperimentalni dokaz semikonzervativne replikacije DNK

Gajili su bakteriju E. coli u podlozi kojoj su dodali radioaktivni obilježeni azot ( dušik ), teški izotop azota 15N – NH4Cl, koji se ugrađivao u lance DNK u toku replikacije, tako da je ova DNK imala veću gustinu od normalne. Zatim su prenijeli bakterije u «laku» podlogu koja je kao izvor azota sadržavala 14N - NH4Cl i gajili ih u toku nekoliko generacija. Rezultat ovog eksperimenta je:

DVOLANČANA DNK KĆERKI ĆELIJA JE HIBRIDNA, SADRŽI JEDAN RODITELJSKI ( «TEŠKI» ) I JEDAN NOVI ( «LAKI» ) LANAC.

Opći pregled replikacije

Molekuli DNK su, čak i kod vrlo jednostavnih organizama veoma dugački, naprimjer genom virusa SV 40 se sastoji od jedne molekule DNK koja sadrži 5,1 kb ( 1 kb = 1 kilobaza = 1 000 nukleotida ) i ima dužinu od 1,7 µm, genom faga T2 sadrži 166 kb i ima dužinu 56 µm.

Bakterijski genom ( E. coli ) sadrži ( također se sastoji od jednog molekula DNK ) 4 000 kb i ima dužinu 1360 µm.

Humani genom ( HAPLOIDNI ), a zna se da svaki hromosom sadrži po jedan molekul DNK, se sastoji od oko 3 milijarde bp ( baznih parova ) i ima dužinu od oko 1 m. DNK mnogih ćelija ( npr. E. coli ) su kružnog oblika ( termin kružni koristi se da bi se istaklo da je molekul ZATVOREN, a ne da bi se opisao stvarni oblik molekule ).

DNK bakterije E. coli u toku replikacije izgleda kao zatvorena kružna linija s unutrašnjom petljom i podsjeća na grčko slovo θ ( teta ), tako da roditeljski lanci nisu u potpunosti razdvojeni.

Mjesta na hromosomu na kojima se replikacija odvija imaju oblik slova « Y « i nazvana su replikaciona viljuška.

Danas se zna da je replikativna viljuška asimetrična. Oba lanca se sintetišu u smjeru 5' 3' i istovremeno, s tim da se jedan sintetiše kontinuirano ( vodeći lanac ), a drugi diskontinuirano, u vidu fragmenata koji se naknadno povezuju usljed čega se završava sa zakašnjenjem ( lanac koji zaostaje ).

Dakle, REPLIKACIJA je i semikonzervativni proces

Replikativna viljuška

Replikacija vodećeg ( direktnog ) lanca DNK ( engl. leading strand ) teče NEPREKIDNO ( kontinuirano ), dok se replikacija zaostajućeg lanca DNK ( eng: lagging strand ) odvija sa prekidima ( diskontinuirano ) i sporije.

Replikacija zaostajućeg lanca odvija se POSREDNO ( indirektno ) – nastaje povezivanjem OKAZAKIJEVIH fragmenata ( R.T. Okkazaki i saradnici, 1968 ).

OKAZAKIJEV fragment je dio DNK, tj. kratki lanci novosintetizirane DNK ( dužine 1 000 – 2 000 nukleotida kod bakterija, odnosno 100 – 200 nukleotida kod eukariota ).Kao početna matrica za sintezu Okazakijevih fragmenata služi molekula RNK sa prajmerom.

ENZIMI REPLIKACIJE

Učestvuje oko 20-ak enzima i drugih proteina.

Enzim koji katalizira fosfodiestersko povezivanje nukleotida u smjeru 5' – 3' je DNK polimeraza I ili Konbergov enzim. Ovaj enzim zahtijeva postojanje začetnika ili PRAJMERA ( eng. primer ) u vidu kratkih polinukleotidnih lanaca komplementarno sparenih sa lancem – matricom.

Enzim dobija instrukcije za sintezu novog lanca DNK od matrice. Pored polimerazne, posjeduje i egzonukleaznu aktivnost u oba smjera, 3' – 5' i 5' – 3'.

Kod bakterija DNK polimeraza I - kao egzonukleaza uklanja prajmere ( kada više nisu potrebni ), a kao polimeraza popunjava praznine nastale njihovim uklanjanjem.

Enzimi DNK polimeraza II i III su slični DNK polimerazi I – katalizuju sintezu DNK u smjeru 5' – 3' i to samo u prisustvu lanca matrice i prajmera. Egzonukleazna aktivnost im je samo u smjeru 3' – 5'. DNK polimeraza III može da ugradi više hiljada nukleotida u novi lanac ( prije nego se odvoji od matrice – ugrađuje 1 000 nukleotida / sec. ), a DNK polimeraza I ugrađuje 10 nukleotida / sec. DNK polimeraza III obavlja sintezu najvećeg dijela DNK molekule, pa se naziva DNK replikaza.

Ulogu prajmera u toku replikacije DNK imaju kratki lanci RNK dužine od 10 do 60 nukleotida ( komplementarno spareni sa dijelovima DNK lanca – matrice ). Kako nastaju prajmeri? Enzim primaza katalizuje nastajanje prajmera. Primaza međusobno povezuje ribonukleozidfosfate i može da započne sintezu polinukleotidnog lanca.

Mehanizmi neophodni za razdvajanje lanaca DNK i formiranje replikativne viljuške su 3 tipa proteina:

DNK HELIKAZA – omogućava raskidanje H – veza i otvaranje dvolančane zavojnice.

PROTEINI koji destabiliziraju dvolančanuzavojnicu ( SSB proteini, eng. single strand DNA – binding, ili

HDP – proteini, eng. Helix destabilizing proteins ).

DNK TOPOIZOMERAZE ( više tipova ovih enzima )DNK topoizomeraza I ( umanjuje tenziju uvrtanja u molekuli DNK )DNK topoizomeraza II , bakterijska se naziva DNK-žiraza ( stalno se umeću negativni supernavoji – djelovanjem ovog enzima). Specifični enzimi koji «odmotavaju» dvostruku uzvojnicu na mjestu SINTEZE.

Neki enzimi replikacije

MEHANIZMI REPLIKACIJE DNK KOD PROKARIOTA

Uslovno cio proces replikacije se može podijeliti u tri faze:

• INICIJACIJA replikacije.• ELONGACIJA novonastalih lanaca DNK.• TERMINACIJA replikacije.

Inicijacija: replikacija kod bakterijske DNK počinje na mjestima koja obuhvataju 245 bp i odlikuje se specifičnim redoslijedom nukleotida – označenog kao LOKUS oriC, gdje se nalaze 4x ponovljeni segmenti od po 9 bp, kao i 3 ponovka nukleotidnog niza dužine 13 bp.

Ishodište replikacije E. coli

DNK se u prisustvu proteina – HU ( sličnog eukariotskim histonima ) savija obuhvatajući proteinski kompleks DnaA ( oko 30 subjedinica ) i nastaje DnaA – DNA – POČETNI ili INICIJALNI KOMPLEKS.Za otvoreni kompleks uz pomoć proteina DnaC vezuju se HELIKSAZE gradeći PREINICIJALNI kompleks.

Inicijacija elongacije

Elongacija: Napredovanje REPLIKACIJE u oba pravca se odvija uz djelovanje DNK heliksaze i proteina SSB ( destabilizira dvolančanu zavojnicu ). Zatim sinteza prajmera – RNK polimeraze i primaze. DNK polimeraza III se vezuje za replikativnu viljušku i počinje kontinuiranu sintezu vodećih lanaca DNK. Sinteza lanca koji zaostaje je mnogo kompleksnija. Obezbjeđuje je « putujući» kompleks, PRIMOZOM, koji pored PRIMAZE I HELIKAZE sadrži 5 različitih proteina.Terminacija: replikacija se završava u regionu od 350 bp nazvanih REPLIKATIVNI TERMINUS – nasuprot REPLIKATIVNOM početku oriC. Replikativni terminus ili TERMINACIONI region obuhvata 6 identičnih segmenata dužine 23 bp ( TerE, TerD, TerA, TerF, TerB i TerC) po 3 sa svake strane. Replikativna viljuška koja dolazi u ovaj region preko segmenata biva zaustavljena u terminacionom regionu.

Terminacija replikacije DNK kod bakterija

MEHANIZMI REPLIKACIJE DNK KOD EUKARIOTA

Molekuli DNK u eukariotskim ćelijama su znatno veći nego u prokariotskim ćelijama i čvrsto su vezani za PROTEINE i REPLIKUJU se u okviru hromatinske strukture.Mehanizmi procesa replikacije su zajednički – odvijaju se semikonzervativnim i semidiskontinuiranim mehanizmom i istovremeno u oba smjera – bidirekciono.Molekula DNK se replikuje 10 – 20 puta sporije nego u prokariotskim. Mjesta početka replikacije nazvana su ARS elementima ( eng. autonomously replicating sequences, autonomni replicirajući slijedovi ) – obuhvataju regione od 300 bp.Replikon je region hromosoma čija replikacija započinje u određenom ARS elementu i predstavlja jednu replikativnu jedinicu.ENZIMI – najmanje 5 vrsta DNK polimeraza – α, β, γ, δ i ε itd.

DNK polimeraza α se sastoji od više subjedinica ( 4 u ćelijama Drosophile, 5 u ćelijama jetre pacova ) katalizuje sintezu lanca DNK u smjeru 5' – 3', počevši od prajmera – može da ugradi samo 100 – 200 nukleotida. Ne posjeduje EGZONUKLEAZE. AKTIVNOST – ne može da provjerava sopstveni učinak i ispravlja nastale greške.Polimeraze β i δ učestvuju u reparaciji oštećenja molekule DNK.Polimerazi γ se pripisuje replikacija mitohondrijalne DNK.

DNK polimeraza δ se sastoji od 2 subjedinice – može da ugradi neograničen broj nukleotida u rastući lanac DNK, posjeduje egzonukleaznu aktivnost smjera 3' – 5' ( koriguje greške u toku replikacije ). Njena katalitička aktivnost zavisi od interakcije sa proteinom PCNA ( eng. proliferating cell nuclear antigen ) – prisutan u nukleusu stanica koje imaju sposobnost da se dijele. Kompleks polimeraze δ i proteina PCNA ima ulogu REPLIKAZE vodećeg lanca DNK.

Kompleks RFA se vezuje za jednolančane regione molekula DNK ( uloga slična ulozi bakterijskog proteina SSB ), dok RFC učestvuje u formiranju aktivnih replikativnih kompleksa.Enzim telomeraza ( ribonukleoproteinski kompleks, čija komponenta RNK sadrži segment komplementaran nizu koji se ponavlja u okviru telomere ). Uloga mu je u replikaciji krajeva linearnih molekula DNK u telomerama. Telomerni dijelovi DNK sadrže ponovljene jednostrane slijedove DNK sa nakupinama G ostataka u jednom lancu. Djelovanjem telomeraze nastaju jednolančani 3' krajevi u kojima se često pojavljuje GVANIN ( G ), tzv. G - KVARTET G ≡ G.

• REPARACIJA NESPARENIH NUKLEOTIDA

• REPARACIJA ISJECANJEM BAZA ( EKSCIZIONA REPARACIJA )

• REPARACIJA ISJECANJEM NUKLEOTIDA

• DIREKTNA REPARACIJA

• POSTREPLIKATIVNA( REKOMBINACIJSKA ) REPARACIJA

• SOS ODGOVOR

POPRAVAK OŠTEĆENIH MOLEKULA DNK

( REPARACIJA )

VRSTE REKOMBINACIJA

HOMOLOGNA GENETIČKA REKOMBINACIJA )

SPECIJALNA REKOMBINACIJA ( ključna uloga enzima REKOMBINAZE )

TRANSPOZICIONA REKOMBINACIJA