Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet

Katedra za biologiju

SEMINARSKI RAD

Tema: “Replikacija DNA”

Mentor: Student:

dr.sc Rifet Terzić,redovni profesor Armin Karić

Tuzla,decembar 2012.

SADRŽAJ:

Uvod …………………………………………………………………..3

Semikonzervativnost

…………………………………………………..4

Bidirekcionost

………………………………………………………....6

Enzimi replikacije ………………………………………………...

……7

Tok replikacije

…………………………………………………………9

Rna prajmjeri i primaze

……………………………………………….11

Replikacija telomera

………………………………………………......12

Literatura ………………………………………………………………

14

2

Uvod :

Replikacija DNK odvija se prije svake ćelijske diobe i omogućava kasniju podjelu svakog

hromozoma na dvije hromatide. Započinje odmotavanjem lanaca DNK i njihovim razdvajanjem.

Za oslobođene baze u svakom od lanaca vežu se komplementarne baze koje međusobno poveže

DNK polimeraza. Tako na svakom lancu nastane jedan novi lanac i cijela se DNK udvostruči.

Prije nego što se ćelija podijeli, neophodno je da se hromozomi tj. DNK udvostruči (duplira,

kopira) kako bi kćerke ćelije sadržale istu količinu DNK, odnosno sve kopije gena kao i

roditeljska ćelija. U S-fazi interfaze se vrši dupliranje molekula DNK, tako da ćelija u G2 fazi

ima duplo veću količinu DNK nego u G1 fazi (svaki hromozom u G2 fazi ima dva molekula

DNK (dvije hromatide),koji su međusobno potpuno jednaki).

Tri modela replikacije bila su razmatrana :

-Konzervativni,

-Semikonzervativni i

-Disperzivni.

3

Slika 1. : Tri modela replikacije

Semikonzervativnost

Sposobnost DNK da duplira samu sebe naziva se replikacija, a od osnovne je važnosti za njenu

ulogu nasljednog materijala. Za replikaciju je od najveće važnosti princip komplementarnosti

vezivanja naspramnih baza u polinukleotidnim lancima DNK. Udvajanju molekula DNK

prethodi rasplitanje dvostruke spirale i odvajanje roditeljskih lanaca. Roditeljski lanci služe kao

kalup (matrica) za sintezu novog komplementarnog lanca DNK . Svaki novonastali molekul

DNK sadrži po jedan stari i jedan novi lanac DNK, pa se zbog kaže da je replikacija

semikonzervativan proces(lat. semi= polu; konzervativan=očuvan).

Dokaz da je replikacija semikonzervativan proces dobijen je iz eksperimenata sa bakterijom

Escherichia coli. Bakterije su gajene na medijumu koji je sadržao teški azot N15 i utvrđeno je da

se on ugradio u njihove ćelije i DNK.Zatim su ove bakterije prebačene na medijum koji je

sadržao laki azot N14 i u njemu je obavljena samo jedna dioba bakterija. Na osnovu analize

sastava DNK utvrđeno je da ona sadrži N15 i N14 u jednakim količinama

4

Slika 2. : Semikonzervativnost replikacije: novosintetisani lanci (crveno), roditeljski lanci (plavo)

Messelson – Stahlov eksperiment iz 1958. godine potvrđuje semikonzervativni model DNA replikacije.

Slika 3. : Messelson – Stahlov eksperiment

Obilježja DNA replikacije:

• Brzina :

5

– prokarioti : 500 nukleotida/sek

– eukarioti : 50 nukleotida/sek

• Preciznost :

-spontana pogreška: 10−9do 10−10

Bidirekcionost

Replikacija se i kod prokariota i kod eukariota vrši bidirekciono, što znači da se od mjesta gdje

počinje vrši istovremeno u oba smjera i to isključivo u 5'- 3' smeru. Pritom, replikacija

koplementarnog lanca se sa jedne strane replikacione viljuške vrši kontinuirano dok se sa druge

strane sintetišu tzv. Okazaki fragmenti koji se pod dejstvom ligaza spajaju u lanac. Kod

prokariota Okazaki fragmenti su dužine 1000-2000 nukleotida, dok su kod eukariota nešto preko

10 puta manji.

Kod prokariota, čija je DNK prstenasta (kružna) replikacija počinje na samo jednom mjestu i

odvija se bidirekciono. Kada se lanci DNK razmotaju obrazuje se replikaciona viljuška (ima

oblik slova Y). Kod prokariota u svakom trenutku replikacije postoje dve replikacione viljuške:

jedna se kreće u smjeru kazaljke na satu, a druga u suprotnom smjeru.

Replikacija DNK u eukariotama, čija je DNK linearna, započinje istovremeno na mnogo mjesta

duž hromozoma i teče istovremeno. Na taj način replikacija ukupne hromozomske DNK se u

6

eukariotskim ćelijama završava za nekoliko sati, iako je brzina ugrađivanja nukleotida znatno

sporija nego kod prokariota.

Brzina replikacije u eukariotskoj ćeliji je 10-100 nukleotidnih parova u sekundi. Ako bi

počinjala na jednom mestu,replikacija ukupne ljudske DNK trajala bi oko tri mjeseca ili

više od 500 sati za jedan hromozom.

Iako je princip replikacije veoma jednostavan, u ćeliji je to složen proces u kome

učestvuje 20-ak enzima i drugih proteina.

Enzimi replikacije

Slika 4. : Enzimi replikacije

Iako je princip replikacije veoma jednostavan, u ćeliji je to složen proces u kome učestvuje 20-ak

enzima i drugih proteina.

7

Neki od najvažnijih enzima u relikaciji su:

helikaze,

nukleaze,

DNK-polimeraze,

ligaze i

primaza.

Helikaze su enzimi koji hodaju po DNK raskidajući vodonične veze između lanaca DNK.

Nukleaze su enzimi koji raskidaju fosfodiestarske veze, pri čemu se razlikuju one koje deluju na

krajevima lanaca (egzonukleaze) i one koje deluju na veze unutar lanca (endonukleaze).

DNK- polimeraze su enzimi koji imaju ključnu ulogu u replikaciji. Prokariotske ćelije sadrže tri

tipa DNK-polimeraze: I, II i III,pri čemu je DNK-poly III najvažnija jer obavlja najveći dio

replikacije; u eukariotskim ćelijama nalazi se najmanje 5 vrsta ovih enzima koje su označene kao

DNK polimeraze a, b, g, d i e, pri čemu je najvažnija DNK-poly d. DNK polimeraza III u 5’- 3’

pravcu povezuju nukleotide novog lanca fosfodiestarskim vezama, pošto su se oni postavili

komplementarno (A=T, CºG) nukleotidima starog (roditeljskog) lanca. DNK polimeraza (III

odnosno d) ima još jednu ulogu: u suprotnom pravcu, 3’- 5’, ona raskida fosfodiestarske veze

između pogrešno vezanih nukleotida novog lanca. Ukoliko DNK polimeraza naiđe na pogrešno

sparen nukleotid, ona upotrijebi svoju egzonukleaznu aktivnost u smjeru 3’- 5’ i raskine vezu tog

nukleotida sa lancem. Ta njena egzonukleazna aktivnost omogućava ispravljanje grešaka, koje

tokom replikacije nastanu što doprinosi tome da je replikacija izuzetno tačan proces.Greške pri

ugrađivanju nukleotida javljaju se sa učestalošću od 10-10.

8

Ligaze djeluju suprotno nukleazama – one dijelove novog lanca povezuju u cjelinu obrazujući

između tih dijelova fosfodiestarske veze. Primaza međusobno povezuje nukleotide RNK u kratke

lance da bi time omogućila dejstvo DNK polimeraze.

Nukleaze su enzimi koji raskidaju fosfodiestarske veze, pri čemu se razlikuju one koje djeluju na

krajevima lanaca (egzonukleaze) i one koje djeluju na veze unutar lanca (endonukleaze).

Primaza međusobno povezuje nukleotide RNK u kratke lance da bi time omogućila dejstvo

DNA-polimeraze.

Tok replikacije

Dvolančana zavojnica DNK je vrlo stabilna struktura, tako da su ćeliji neophodni mehanizmi

koji će omogućiti razdvajanje lanaca i formiranje replikativne viljuške. U ovim mehanizmima

učestvuju helikaze i još neki proteini.

Endonukleaza zasijeca samo jedan lanac DNK čime počinje njeno rasplitanje. Helikaze raskidaju

vodonične veze između lanaca čime se lanci razdvajaju i obrazuju se replikativne viljuške. Pošto

se replikacija odvija bidirekciono, na svakom mjestu gde ona počinje obrazuju se dvije

replikativne viljuške koje se kreću u suprotnim smjerovima. Pratićemo sada šta se dešava u

jednoj replikativnoj viljušci.

9

Svaka replikativna viljuška je asimetrična jer su lanci antiparalelni, a istovremeno se naspram

oba sintetišu novi lanci u 5’- 3’ pravcu. Lanac DNK koji se sintetiše u pravcu kretanja

replikativne viljuške naziva se vodeći lanac, a onaj koji se sintetiše u suprotnom smjeru je lanac

koji zaostaje. Vodeći lanac se sintetiše kao cjelovit dok se ovaj drugi sintetiše u vidu dijelova

koji se nazivaju Okazakijevi fragmenti. Okazakijevi fragmenti su naziv dobili prema autoru koji

ih je otkrio; imaju dužinu od 1000-2000 nukleotida u prokariotskim, odnosno 100-200

nukleotida u eukariotskim ćelijama; naknadno se spajaju ligazama pa pošto se sinteza tog lanca

završava sa zakašnjenjm on dobija naziv lanac koji zaostaje.

Sintezu oba lanca obavlja DNK polimeraza tek pošto se veže za roditeljski lanac koji služi kao

matrica. Ovaj enzim ne može da se veže za ogoljeni lanac-matricu već zahtijeva postojanje

začetnika (prajmera; engl. primer). Začetnik je kratki lanac RNK i njegovu sintezu katalizuje

enzim primaza. Kada se kratki lanac RNK komplementarno spari (hibridizuje) sa početkom

lanca matrice to omogućuje vezivanje DNK polimeraze i počinje sinteza novog lanca. Za sintezu

lanca koji zaostaje potrebno je da se sintetiše veći broj začetnika. Okazakijeve fragmente, po

završetku sinteze, međusobno povezuje enzim ligaza.

10

Slika 5. : Sinteza vodećeg i tromog lanca

Pomoćni proteini DNA polimeraze:

1. RCF – proteini za stavljanje stezaljke,

- Specifično prepoznaju i vežu DNA na mjestu spajanja početnice i kalupa

2. PCNA – protein kližuće stezaljke

- Vežu se na RFC i stvaraju prsten koji održava združenost DNA polimeraze s njezinim kalupom

tijekom replikacije.

11

RNK prajmeri i primaze:

Učešće RNK u inicijaciji rerplikacije bazirana na otkrićima:

• Okazaki fragmenti često imaju kratke nizove RNK (3-10 n) na svojim 5‘ krajevima,

• DNK Pol katalizuju dodavanje nukleotida na 3‘ kraj lanca RNK kao i na DNK,

• Ćelije sadrže enzim PRIMAZU koji sintetiše RNK fragmente dužine oko 10 baza koristeci

DNK kao matricu,

• Nasuprot DNK Pol koja dodaje nukleotide na kraj postojećeg lanca, primaza inicira sintezu

RNK iz sredine povezujući dva nukleotida.

PRIMAZA je vrsta RNK polimeraza koja je uključena jedino u proces DNK replikacije.

• U E.coli primaze su neaktivne dok se ne udruže sa 6 drugih proteina formirajući kompleks

PRIMOZOM . Uloge ovih proteina su u odmotavanju roditeljske DNK i prepoznavanju ciljne

DNK sekvence od koje zapocinje replikacija. Kod eukariota termin primozom se ne koristi jer

njihove primaze nisu asocirane sa odmotavajućim proteinima već su vezane za DNK Pol α,

ključnu u inicijaciji replikacije.

• Primaza je enzim koji ne poseduje ispravljacku aktivnost može da formirarelativno veliki broj

grešaka tako da bi to moglo da poveca nivo mutacije nastale tokom replikacije, da se ne iseca i

ne zamenjuje sa dezoksiribonukleotidima..

Telomere i telomeraze: replikacija linearnih krajeva hromozoma

• Telomere (linearni krajevi hromozoma) sačinjeni su od naizmjenično zastupljenih kratkih

repetativnih nekodirajućih sekvenci (humane telomere cine 100-1500 kopija TTAGGG sekvence

12

tandemski ponovljene) koje onemogućavaju gubljenje važnih genetičkih informacija tokom

skraćivanja DNK molekula u replikaciji.

Telomere se repliciraju telomerazama, reverznom transkriptazom koja

sintetiše DNK od RNK, a koja nosi sopstveni RNK molekul komplementaran

telomernoj DNK. Telomere štite gene na hromozomima na dva načina,

predstavljaju rezervoar nekodirajućih DNK i vezuju protein koji sprečavaju

degradaciju krajeva hromozoma.

Konvencionalna DNK pol ne može da replicira telomerni region jer prostorno

nema gdje da veže RNK prajmer. Telomere se sintetišu de novo katalitičkom

aktivnošću Telomeraze.

Greider i Blackburn iz protozoa Tetrahymene prvi izoluju telomerazu. Po

svom sastavu telomeraza je ribonukleoproteinski kompleks koji u sebi nosi

RNK molekul ( kod Tetrahymene dug 159 nukleotida i sadrži sekvencu od 9

nukleotida – AACCCCAAC, koja odgovara 1,5 telomernom ponovku –

TTGGGGTTG

LITERATURA:

1. E.Đuričić,R.Terzić,M.Kapović,B.Peterlin, Biologija sa humanom genetikom.

2. M.Pavlica, udžbenik iz genetike ( elektronska forma ).

13

3. Kosanović, M, Diklić, V: Odabrana poglavlja iz humane genetike, Beograd, 1986.

( elektronska forma ).

4. Pomoćna literatura ( Internet ) – www.google.ba ( Replikacija DNA ).

14