RESULTADOS E DISCUSSO

UNIVERSIDADE TECNOLGICA FEDERAL DO PARANDEPARTAMENTO ACADMICO DE QUMICACURSO DE BACHARELADO EM QUMICABARBARA COSTA FORMICA

FELIPE MEGER

LARISSA GLIENKE

LILIANE SESSI DA ROCHAMARCELO ANDR PETRY PONTES

WAGNER ALBERTTONI

SEPARAO DE PIGMENTOS DO ESPINAFRE ATRAVS DE CROMATOGRAFIA EM COLUNA

RELATRIO ACADMICOCURITIBA

2014

BARBARA COSTA FORMICA

FELIPE MEGER

LARISSA GLIENKE

LILIANE SESSI DA ROCHA

MARCELO ANDR PETRY PONTES

WAGNER ALBERTTONI

SEPARAO DE PIGMENTOS DO ESPINAFRE ATRAVS DE CROMATOGRAFIA EM COLUNATrabalho apresentado disciplina de Mtodos Cromatogrficos, do Curso de Bacharelado em Qumica, da Universidade Tecnolgica Federal do Paran, ao Professor Marcus Vinicius de Liz, vlido como atividade avaliativa.

CURITIBA

2014

1 INTRODUO

Extratos vegetais normalmente so misturas complexas e, o isolamento pra identificao das substncias que a compem pode ser realizado pela tcnica de cromatografia.

Considera-se cromatografia lquida toda tcnica de separao que envolve uma fase mvel lquida, em que as substncias so separadas por partio entre um lquido mvel e uma fase estacionria que pode ser slida, finamente particulada ou um um lquido imobilizado em uma superfcie slida; as substncias que compem a mistura se distribuem entre as duas fases conforme a afinidade por uma ou outra (AQUINO NETO, 2003).

A cromatografia lquida clssica em coluna caracterizada por uma coluna de vidro com dimetro em torno de 0,5 a 3,0 cm, recheada pela fase estacionria, pela qual a fase mvel percola por ao da gravidade (AQUINO NETO, 2005).

Na cromatografia em coluna a fase estacionria geralmente formada por slica ou alumina particulada, as quais no so muito reativas e, por isso, suas superfcies so preparadas para aumentar sua capacidade de adsoro dos solventes; a coluna saturada com o solvente e uma pequena quantidade da mistura a ser separada colocada no topo da coluna e, na sequncia, mais solvente colocado; as substncias da mistura migram lentamente de cima para baixo e so eludas (removidas como fraes) no fim da coluna; se a fase mvel for menos polar do que a fase estacionria, as substncias menos polares sero eludas primeiro e as mais polares em seguida (ATKINS, 2006).

O objetivo desta prtica foi de isolar os pigmentos do extrato de espinafre por meio da cromatografia em coluna e, em seguida, analis-los utilizando espectrofotometria UV-Vis.

2 PROCEDIMENTO

Inicialmente foi preparado o extrato de espinafre, fervendo-se folhas (cujas ranhuras centrais haviam sido removidas) em gua deionizada por 2 minutos. As folhas fervidas foram secas em papel absorvente, cortadas em pedaos e maceradas com a ajuda de graal e pistilo juntamente com 10 mL de acetona.Em seguida, foi realizado o preparo da coluna, pesando-se em um bquer aproximadamente 10g de slica ativada e adicionando 60mL de hexano. A mistura foi agitada com basto de vidro at atingir o ponto de uma massa fluida e homognea. Na coluna cromatogrfica adicionou-se um pequeno chumao de algodo e, com a torneira aberta, a parte fluida de slica foi vertida cuidadosamente pela parede a fim de obter uma sedimentao homognea at o empacotamento da slica. A operao foi repetida at que praticamente toda a slica do bquer, com exceo daquela muito aderida ao vidro, fosse empacotada. O solvente da massa de slica foi recolhido para ser utilizado posteriormente.

O escoamento da fase mvel durante a preparao da coluna foi interrompido quando o menisco desta estava pouco acima do nvel da fase estacionria, evitando assim danos fase estacionria que poderiam interferir na corrida cromatogrfica. Aps interromper o escoamento do hexano foi determinada o volume morto (Vm) atravs da diferena entre o volume recolhido no bquer e o volume retido na coluna.

O extrato de espinafre previamente preparado foi filtrado para o topo da coluna com auxlio de um funil com algodo bloqueando a sada dos pedaos de folha. Foram ento adicionados 50 mL da fase mvel (hexano), escoando pela parede da coluna. Aps a eluio com hexano deu-se incio a eluio com uma mistura hexano/acetona, preparada com auxilio de bureta, na proporo 80:20. Cada frao de separada eluda foi coletada em um bquer para posterior varredura em espectrofotmetro (800-200nm).3 RESULTADOS E DISCUSSO

No primeiro contato entre a fase mvel FM (hexano), fase estacionria FE (slica) e amostra, observou-se que nenhum composto foi deslocado pelo solvente, sendo este volume recolhido correspondente ao volume morto (Vm) e igual a 27,5 mL. Com a segunda passagem do solvente pela coluna, obteve-se a primeira banda, de cor amarela. Considerando que o hexano um solvente apolar, ento possvel afirmar que esta banda tambm apolar, pois melhor interagiu com a FM (hexano) do que com a FE (slica, que polar). A segunda banda, de cor verde, manteve-se no topo da coluna, devido maior interao com a FE.

O deslocamento da primeira banda demandou um tempo maior do que as demais bandas, pois a mistura hexano/acetona possui baixa polaridade, o que causa desvantagem na competio pelo stio ativo na superfcie do adsorvente e retarda o arraste dos componentes.

Aps a eluio da primeira banda, a segunda banda, verde, permaneceu imvel, sendo o seu deslocamento realizado atravs de eluio por polaridade, que consistiu na adio de eluente contendo acetona (solvente polar) coluna. A acetona apresenta polaridade superior da FE, o que permitiu o deslocamento dos componentes das clorofilas, que tambm possuem carter polar.

Na Figura 1 so mostradas as estruturas qumicas dos pigmentos extrados. O -caroteno um hidrocarboneto insaturado, portanto interage mais efetivamente com a FM apolar. As xantofilas possuem grupos hidroxila, entretanto sua cadeia carbnica extensa reduz a afinidade pela FE. As estruturas da clorofila possuem um tomo de magnsio coordenado a uma porfirina, o que favorece uma interao mais forte com a FE (FONSECA; GONALVES, 2004).Na Figura 2 so mostradas as estruturas qumicas da FM. O hexano por se tratar de um hidrocarboneto um solvente apolar, pois a diferena de eletronegatividade entre carbono e hidrognio muito baixa. Por outro lado, a acetona possui uma regio eletronicamente densa, a carbonila provoca a polarizao da molcula, o que configura este solvente como polar.

Figura 1. Estruturas qumicas do -caroteno (I), xantofila (II), clorofila a (III) e clorifila b (IV). Fonte: FONSECA; GONALVES, 2004.Figura 2. Estruturas qumicas da fase mvel, hexano (I) e acetona (propanona) (II).Assim, a ordem de eluio da coluna deve ser em primeiro lugar os carotenos, que apresentam menor polaridade, seguidos da xantofila e da clorofila, com maior polaridade.

Neste experimento, o mecanismo que descreve a interao da FE e da FM com os componentes da amostra o processo de adsoro, que se baseia principalmente em atraes eletrostticas ou dipolares (foras de Van der Waals adsoro fsica) e na formao de ligaes de hidrognio (adsoro qumica). A adsoro ocorre na interface entre o slido e a fase mvel, devido presena de stios ativos na superfcie.

Na Figura 3 esto apresentados os espectros de absorbncia das alquotas coletadas durante o experimento. Os pigmentos estudados apresentam absoro no comprimento de onda do Ultra Violeta ao visvel, estando na faixa de 200 a 800, entretanto na faixa de 200 at 330 nm a absorbncia medida estourou, chegando a valores de absorbncia 10.

Figura 3. Espectro dos pigmentos de espinafre obtidos atravs de espectrofotometria UV-Vis.

A primeira banda coletada (1 alquota) mostrada na Figura 4. Ela possui dois picos sendo o de maior intensidade em 451 nm e outro de menor intensidade em 478 nm. Segundo Xu et al. (2006) o -caroteno possui trs picos caractersticos em 417, 450 e 478 nm. O primeiro pico no est evidente no espectro obtido, entretanto percebe-se um pequeno sinal em torno de 425 nm que pode ser atribudo quele pico. O segundo e terceiro picos so bem evidentes no espectro obtido, portando esta primeira banda foi atribuda ao -caroteno.

Figura 4. Espectro de absorbncia do -caroteno obtido atravs de espectrofotometria UV-Vis.

A segunda alquota no apresentou picos detectveis. A terceira alquota mostrada na Figura 5. Trs picos foram observados em 432, 474 e 663 nm. Segundo Lichtenthaler e Buschmann (2001) a clorofila-a e a clorofila-b apresentam absoro no azul perto de 428 e 453 nm, respectivamente e no vermelho perto de 661 e 642 nm, respectivamente. Eles ainda analisaram que ocorre um pequeno aumento do comprimento de onda dos picos, de 428 para 432 nm e de 661 para 665 nm, para a clorofila-a devido ao aumento da polaridade do solvente. Deste modo o espectro obtido para a terceira alquota pode ser atribudo para a clorofila-a.

Figura 5. Espectro de absorbncia da clorofila-a obtido atravs de espectrofotometria UV-Vis.O pico observado em 474 nm na Figura 5 uma provvel contaminao por xantofilas que absorvem em regies muito prximas ao -caroteno (RUBAN et al., 1993).

As alquotas 4 e 5 possuem caractersticas muito prximas da alquota 3 possuindo apenas algumas interferncias devido a mistura das bandas ao decorrer da corrida cromatogrfica gerando essas contaminaes, assim a presena da clorofila acabou mascarando a presena das xantofilas.A literatura mostra uma srie de diferentes misturas de FM, dentre elas pode-se citar, acetonitrila com diclorometano (75:25, v/v) (XU et al., 2006) e tolueno com metanol (9:1, v/v) (PETERS e NOBLE, 2014). Este ltimo citado como sendo a FM com melhores resultados produzidos para a separao desses pigmentos.

4 CONCLUSES

Foi demonstrado atravs do experimento com a coluna a separao dos pigmentos do extrato de espinafre. Foi ainda analisado a ordem de separao, considerando a polaridade dos compostos e suas interaes com as fases mvel e estacionria devido s polaridades dos mesmos.

Tendo uma fase estacionria polar observou-se que compostos com maior polaridade eluram por ltimo, j os compostos apolares tiveram maior interao com a fase mvel (hexano) eluindo primeiro e os compostos de polaridade intermediria foram melhor eludos quando um aumento na polaridade da fase mvel foi realizada por adio de acetona.

Os solventes escolhidos para a fase mvel conseguiram separar bem o -caroteno. A clorofila-a foi separada, entretanto com algumas contaminaes e as xantofilas no puderam ser observadas pela espectrofotometria UV-Vis.REFERNCIAS

AQUINO NETO, Francisco Radler de; NUNES, Denise da Silva e Souza (Autor). Cromatografia: princpios bsicos e tcnicas afins. Rio de Janeiro, RJ: Intercincia, 2003. xvii, 187 p.

ATKINS, P. W.; JONES, Loretta (Autor). Princpios de qumica: questionando a vida moderna e o meio ambiente. 3. ed. Porto Alegre: Bookman, 2006. 965 p. ISBN 8536306688. FONSECA, Sebastio F.; GONALVES, Caroline C. S. Extrao de Pigmentos de Espinafre e Separao em Coluna de Acar Comercial. Qumica Nova na Escola. n. 20, nov. 2004.

LICHTENTHALER, Hartmut K.; BUSCHMANN, Claus. Chlorophylls and Carotenoids: Measurement and Characterization by UVVIS Spectroscopy. Current protocols in food analytical chemistry, 2001.

PETERS, Reisha D.; NOBLE, Scott D. Spectrographic measurement of plant pigments from 300 to 800nm. Remote Sensing of Environment, v. 148, p. 119-123, 2014.

RUBAN, A. V.; HORTON, P.; YOUNG, A. J. Aggregation of higher plant xanthophylls: differences in absorption spectra and in the dependency on solvent polarity. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, v. 21, n. 2, p. 229-234, 1993.XU, Fang; YUAN, Q. P.; DONG, H. R. Determination of lycopene and -carotene by high-performance liquid chromatography using sudan I as internal standard. Journal of Chromatography B, v. 838, n. 1, p. 44-49, 2006.

II

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