rekombinánsfehérje alapú gyógyszerek,...

RekombinRekombináánsns fehfehéérje alaprje alapúúgygyóógyszerek, gyszerek, diagnosztikumokdiagnosztikumok

Fehérjék

• Az életfolyamatok során lejátszódó biokémiai reakciók túlnyomótöbbségét fehérjék katalizálják

• A sejtek, szövetek, szervek szerkezetét fehérjék alkotják, ezek formáját, stabilitását/átalakulását fehérjék határozzák meg

• A fehérjék működése elengedhetetlen a mozgáshoz, érzékeléshez

• A sejtekben lejátszódó folyamatok szabályozásában kulcsszerepet játszanak a fehérjék

• A szervezet működésének összehangolását fehérjék végzik

• A fehérjék meghatározó szerepet játszanak a kórokozók elleni védekezésben

A fehérjék építőelemei az aminosavakA fehérjék 20 (22) féle aminosavból felépülő (ko)polimerek, (de a fehérjék

utólagos módosítások következtében rendkívül sokféle molekulát tartalmazhatnak: cukrokat, lipideket, szerves és szervetlen molekulákat, -különleges elemek atomjait: Se, Co, Cu, Mo)

Az aminosavak oldallánca lehet poláros (hidrofil) ill. apoláros (hidrofób, víztaszító), A poláros aminosavak között vannak semlegesek, negatív ill. pozitív töltésűekAz oldallánc lehet alifás vagy aromás (gyűrűs)

Az aminosavak oldalláncai között is kialakulhatnak kölcsönhatások ill. kémiai kötések: van der Waals erők, hidrogén híd kötések, komplex-(koordinációs-), ionos- és kovalens kötések

Az aminosavak nagy változatossága miatt a fehérjék szerkezete elképesztően sokféle lehet: 8000 féle tripeptid, 3.2 millió pentapeptid és több, mint egy milliárd féle heptapeptid létezik!

Egy átlagos fehérje kb. 300 aminosavból áll

A peptidkötés és a polipeptidekAz egyik aminosav karboxil-

csoportja és a másik amino-sav aminocsoportja között alakul ki a peptidkötés

A fehérjék gerince –N-C-C-egységekből álló, monoton szerkezet, amely (mivel nincsenek benne kettős köté-sek) szabadon tud rotálni.

Az aminosavak sorrendjét tekintjük a fehérjék elsődleges (primér) szerkezetének

A fehérjék másodlagos szerkezeteA polipeptidlánc flexibilitása sokféle másodlagos szerkezetet tesz lehetővé:

lehet véletlenszerű (random coil), de kialakulhat alfa hélix és béta redő (lemez) szerkezet is

Az alfa hélix egy spirális lánc, a spirál „emeletei” közötti távolságot az aminosavak NH és CO csoport-jai között kialakuló H-híd kötések stabilizálják

Az alfa hélix igen stabil, de ugyan-akkor rugalmas szerkezet

Az aminosavak oldalláncai a hélixfelszínén, kifelé állnak, így meghatá-rozzák a hélix töltését, poláros vagyapoláros természetét

A fehérjék másodlagos szerkezete

Az alfa hélix szerkezete, az aa-k oldalláncai nélkül. A szaggatott vonal H-hidakat jelez.


Az alfa hélix szerkezete, oldalláncokkal együtt ábrázolva

A fehérjék másodlagos szerkezeteA párhuzamosan, de ellentétes irányban, futó peptidláncok között is kialakulhatnak H-

hidak által stabilizált szerkezetek: ezeket a lemez-szerű képződményeket nevezzük béta redőknek vagy lemezeknek.

Az 5-8 aa hosszúbéta lemezek külö-nösen stabil szer-kezetűek, igennagy szilárdságotbiztosítanak a bétalemezekből álló fe-hérjéknek

Az egymás felett elhelyezkedőlemezek paralel vagyantiparalel lefutásúak lehetnek. Egymáson elcsúszhatnak, ezért rugalmas pl. a selyem


A béta lemez szerkezete, az aminosavak oldalláncai nélkül


• A motívumokból kinyúlóoldalláncok ki tudnakalakítani poláros, vagyapoláros felszíneket.

• A képen azt látjuk, hogy a külső felszín poláros ol-dalláncai vízben oldható-vá tesznek egy polipepti-det, amely számos víz-taszító oldalláncot is tar-talmaz. Ezek egy hidrofób magot alkotnak a szerkezet belsejében.

• Számos fehérje alegységeit ilyen, apoláros csoportok tartják össze


Az alfa hélix és a béta lemez mellett gyakori szerkezeti elemek a fehérjékben a hurkok (turns, loops, fingers). A rövid U-alakú „kanyarokat” (turn) H-híd kötések stabilizálják. A turn-ök a fehérjék felszínén helyezkednek el, rendszerint prolintés glicint tartalmaznak.

A turn köti össze a hélixe-ket és lemezeket (meg-fordítva a polipeptidláncirányát).

A nagyobb hurkok (loops, fingers) a fehérje-fehérje ill. a fehérje-nukleinsav kölcsönhatásban játsza-nak szerepet.

A fenti elemekből számos„motívum” állhat össze.pl. helix-loop-helix

A cink ujj (zinc finger)Két olyan aminosav van, amelyik a Zn ionokkal kötést tud létrehozni: a

cisztein (SH) és a hisztidin (imidazol nitrogén)Két cys és két his által koordinációs kötésben kötött Zn alakítja ki

a cink ujjnak nevezett szerkezetet:

• Rövid hurkokat a Ca ion is stabilizálni tud (pl. helix-loop-helix típusúfehérjékben).

A fehérjék szerkezete: domének

• A szekvencia és a motívumok együttesen alakítják ki a fehérjék szerkezeti és működési elemeit, a doméneket (domain).

• Az evolúció során kialakult, jól használható szerkezeti elemek a domének, amelyeket gyakran egyetlen exon kódol, de ha több, akkor is a domén szekvencia határai mindig egybeesnek az exon-intronhatárokkal

• Igen sok fehérjében meg-találhatjuk ugyan azt a domént(ahol hasonló funkciókatlátnak el)

• Minél több feladatot lát el egy fehérje, annál több doméntalálható benne

• Az alternatív splicing eredménye-képpen eltérő domén-szerkezetűfehérjék termelődhetnek

A fehérjék harmadlagos és negyedleges szerkezete

• A domének együttesen alkotják a fehérjék (a polipeptid lánc) harmadlagos szerkezetét.

• A negyedleges szerkezet arra utal, hogy hány alegységből (polipeptid láncból) áll egy fehérje.

• Sok fehérjének van két alegysége, de meglepően gyakoriak még a négy, hat láncból álló fehérjék is (ritkább a 3-, 5-mer).

A fehérje szerkezetének kialakulása

• Az elsődleges szerkezet (aminosav sorrend) általában meghatározza a fehérje magasabb-rendű szerkezetét és a szerkezet magától kialakul (self assembly)

• A fehérje natív (működőképes) szerkezete az energetikailag legelőnyösebb forma (formák egyike)

• A membránfehérjék a ER lumenjébe bejutva nyerik el szerkezetüket. A bonyolult felépítésű fehérjék szerkezetének kialakulását „dajka-fehérjék”, chaperonok segítik elő

• Szintén a dajkafehérjék feladata a rosszul feltekeredett láncok szerkezetének „javítása”, vagy a fehérje-károsítóhatások következtében denaturálódott fehérjék renaturálása

A fehérje szerkezetének kialakulása

• A szerkezet kialakulása lépésenként történik és megfordítható folyamat. Magas hőmérséklet, extrém pH, szerves oldószerek, víz-levegő határa (pl. habverő), stb. a fehérjék szerkezetének végleges vagy reverzibilis átalakulásához, denaturációhoz vezethet.

• Minden fehérjének több lehetséges szerkezete van, de nem mindegyik képes ellátni a fehérje feladatát. Az egyik (vagy néhány) stabil szerkezet a „natív”, működőképes szerkezet.

random coil molten globule native state

Dajkafehérjék, chaperonokA dajkafehérjék a frissen készülő fehérjékhez

kapcsolódva alakítják ki azok natív szerkezetét

A denaturálódott fehérje jellemzője a sok, felszínre került apoláros oldallánca chaperonokezeket ismerik fel és tüntetik el a fehérjeszerkezeténekmódosításakor.

A dajkafehérjéket hő-sokk fehérjéknek is nevezik, mert ahőhatás indukáljatermelésüket.

Denaturáció, renaturációA H-hidakat megbontó vegyületek (karbamid,

guanidin, fenol) a fehérje szerkezetének össze-omlását, a fehérje denaturációját okozzák.

Redukáló anyagokkal a diszulfid hidak is felbonthatók, így a fehérje random coilállapotba kerül.

Számos olyan fehérje van, amelyek szerkezete viszonylag egyszerűen visszaáll, ha a denaturáló anyagokat eltávolítjuk (selfassembly).

Ezzel a módszerrel lehet pl. baktériumokban előállított (de azokban rosszul feltekeredett) gyógyhatású fehérjéket aktív szerkezetűvéalakítani.

Detergensek (pl. SDS) a hidrofób kölcsön-hatásokat megszüntetve okozzák a dena-turációt. Eltávolításuk nehézkes, de ha sikerül, renaturációhoz vezethet

A fehérjék jelentős része és a membrán lipidek az ER-hoz kötve szintetizálódnak. Ezeket a molekulákat szét kell szortírozni és működésük helyére kell szállítani – megfelelő átalakítások után.

Az összes enzim, amely afehérjék éréséhez, módo-sításához kell megtalálható az ER és a Golgi lumenében ill. a membránjaihoz kötve.

Az egyes cél-organellumokmegtalálását segíti a fehérjeaminosav sorrendjében fel-lelhető „szignál szekvenciák”jelenléte.

Vezikuláris transzport és fehérje érés

Az SRP tevékenységeAz SRP a készülő fehérje szignál szekvenciájához kötődve megakadályoz-

za a fehérje szintézisét, mindaddig, amíg kölcsönhatásra nem tud lépni receptorával, amely az ER felszínén helyezkedik el.

A kapcsolat kialakulása után afehérjeszintézis folytatódik, aszignálpeptid a pórusban kötve marad, de a peptidfolyamatosan csúszik be a lumenbe.

Végül a szignál peptidáz le-hasítja a szignálpeptideta fehérjéről.

Nascens polipeptidláncok bejutása az ER-be

Oldható fehérjék

Fehérje módosítás az ER-ben:

diszulfid híd képződés,glikoziláció (N-, O-)foszforiláció,arginiláció,oxidáció (lizin),acilálás (hosszúzsírsavak),metiláció, acetiláció,proteolízis,keresztkötések,ubikvitináció, poliubikvitináció

Nascens polipeptidláncok bejutása az ER-be

Type I membránfehérjékType II membránfehérjék

A fehérjék glikozilációjaA fehérjék glikozilációja több lépéses folyamat, amit specifikus enzimek

katalizálnak az ER és a Golgi lumenjeiben.A glikoziláló enzimek működése nem olyan pontos, mint amit korábban

megszoktunk: egyes lépések megtörténte esetleges, így sokféle fehérje izoforma alakulhat ki.

A vezikuláris transzport folyamat

A sejt valamennyi kompartmentje az összes többivel (és a külvilággal) folyamatos anyagcserében áll, ennek eszköze a vezikuláris transzport. A vezikulumok a citoszkeleton mentén, motor fehérjéket felhasználva közlekednek.

A fehérje aminosav sorrendje meghatározza a fehérjekésőbbi elhelyezkedését

A prokarióták, az egysejtűek, a gerinctelenek és agerincesek eltérőenzimkészlettelrendelkeznek:más módosításokat képesek kialakítani

Transzport vezikulumok és a Golgi networkA piros fluoreszcencia jelzi transzport vezikulumok helyzetét a kék mag és a zölden festett ER mellett. A jobboldali képen a trans-Golgi network, TGN, látható zöld színben, míg a plazmamembrán pirossal világít.

Rekombináns fehérjék –prokarióta rendszerek

In vitro rekombináns DNS technológia (génsebészet, génmódosítás, ‘génpiszkálás’)Transzgén- vagy genetikailag módosított organizmusok (GMO vagy GE élőlények)

Az izolált gének szekvenciáit új környezetbe helyezve, erős bakteriális promóterek(enhancerek) szabályozása alá rendelve expressziós vektorokat állítunk elő.

A DNS konstrukcióval sejteket transzformálva transzgénikus szervezeteket állítunk elő, amelyek az illető gének termékeit nagy mennyiségben képesek termelni.

P gene


A bioipar egyik első terméke az E. coliban termeltetett rekombináns inzulin volt (1986).

A rekombináns inzulin több tízmillióember életét menti meg

Az emberi inzulinnal tökéletesen megegyező molekula, nem vált kiellenanyag termelést.


Az elmúlt évek során számos rekombináns fehérje került forgalomba, amelyeket genetikailag módosított prokarióták segítségével állítanak elő.

inzulin – cukorbetegségvéralvadási faktor VIII és IX – vérzékenységTPA (szöveti plazminogén-aktivátor) – trombózis, infarktus növekedési hormon – törpenövés,interferonok – vírusfertőzések, vírus-indukálta daganatokGM-CSF és IL-3 – leukopenia, vérképzési rendellenességekangiostatin és endostatin – angiogenezis gátlása, daganatos betegségekbenADA (adenozin deamináz) – örökletes immunhiányos állapot kezelése vírális és bakteriális fehérjék – vakcinálás

Rekombináns fehérjék –eukarióta rendszerek

Számos olyan fehérje van, amelynek aktív formáját a prokarióták nem tudják előállítani. Ezek termelésére csak eukarióta sejtek (néha csak gerincesek sejtjei) képesek.

A DNS konstrukciókat (ingázó v. shuttle vektorokat) ilyen esetekben is baktériumokban állítják elő, de a transzformált, termelő sejt eukarióta eredetű:

Élesztőgomba

Rovarsejt / bakulovírus

Állati (emberi) sejttenyészetek

Transzgenikus állat (teje)

eritropoetin, véralvadási faktorok, HBV, vírusfehérjék, stb.

Rekombináns fehérjék –eukarióta rendszerek

A vese által termelt eritropoetin elengedhetetlen a vvt kialakulása szempontjából.Dialízisre szoruló vese betegek csak folyamatosan ismétlődő vérátömlesztéssel

voltak életben tarthatók a rekombináns eritropoetin kifejlesztése előtt.

Genetikailag módosított állatok tejéből lehet kinyerni emberi véralvadási faktorokat

A rekombináns fehérje gyógyszereket (Epo, HGH, IGF-1)a "profi" sport doppingként használja, nem törődve az életveszélyes szövődményekkel

„Dizájner” fehérjék• Az egyes domének működésének ismeretében mesterséges fehérjéket

állíthatunk elő:– új kémiai reakciók katalízise– tetszőleges molekulák megkötése– tetszőleges (DNS) szekvenciák felismerése– bizonyos molekulák jelenlétének detektálása– mozgás-, kémiai-, elektromos- és fény-energiák átalakítása egymásba

• IL-3-CSF fúziós fehérje• Science: Mátés L.: Molecule of the year, 2009

Immunglobulinok (Ig), B sejt receptorok (BCR)

Az immunglobulinok nagy méretű fehérjék, amelyek a szérumban ill. a B sejtek felszínén találhatóak (utóbbiak a B sejt receptorok).

Az emberi Ig-ok legalább 4 polipeptidláncból állnak, jellemzően két könnyű (light, L) és két nehéz (heavy, H) láncból, amelyeket S-S hidak tartanak összeA H-lánc 4-5, az L 2 doménból épül fel

Immunglobulinok (Ig), B sejt receptorok (BCR)A molekulák egyedi, nagyon különböző antigén-kötő része (Fab = antibody bindingfragment) a könnyű és a nehéz lánc kombinációjából alakul ki, a másik vége – amely az egyes típusú molekulákban azonos – csak a nehéz láncokból áll.

A láncok antigén kötő doménjétvariábilis doménnek nevezzük.

Az Fc részen szénhidrát oldalláncoktalálhatók. A könnyű láncok másik darabját és az Fc-t alkotó doméneketkonstans doméneknek nevezzük.

A B sejt receptorok (BCR) egy transz-membrán doménnel hosszabbak azimmunglobulinoknál, ez horgonyozza a molekulát a sejthártyába.

Immunglobulinok (Ig), B sejt receptorok (BCR)Az Ig-okat jellegzetes, béta redőkből álló immunglobulin domének építik fel, amelyeket diszulfid hidak stabilizálnakA hinge régió nagy mozgékonyságot biztosít a molekula Fab karjainak

Hibridóma sejtek

Az immunizált állat lépének B sejtjeitellenanyagot termelnek, de rövid életűek.

A mieloma sejtek (B tumorsejtek) nem termelnek, de 'halhatatlanok'.

A kétféle sejt fúziójával hibrid sejteket (hibridóma) lehet előállítani.

A hibrid sejtek közül kiválogathatóka folyamatosan osztódó és Ig-ttermelő klónok.

Ezek elszaporítva felhasználhatókellenanyagok gyártására.

Ellenanyagok biotechnológiájaPoliklonális és monoklonális

ellenanyagokAz antigén epitópjai ellen igen

sok, eltérő specificitásúB sejt termel antitestet

Egyetlen B sejt utódai (klónja)egy epitópot felismerő Ig-tállítanak elő (monoklonális)

'Humanizált' ellenanyagokA poliklonális ellenanyagokat általában állatokban, a monoklonálisakat egérben vagy

patkányban állítják elő. Így az állati Ig-t ismételten emberbe juttatva idegen fehérjeként immunválaszt vált ki (és rövid a keringési féléletideje).

Az antigén felismerésében csak a változó domének 3-3 ujja vesz részt, az állati eredetű konstans domének rekombináns technológiával lecserélhetők emberi Ig konstans doménekre. Így áll elő a kiméra ellenanyag.

A változó domének antigén-felismerésbenszerepet nem játszó részeinek ki-cserélésével 'humanizálni' lehet amolekulát,

A 'humanizált' ellenanyag ezután emberi Ig-ként viselkedik.

Az emberi immunglobulin géneket hordozó egerek immunizálásaazonnal human Ig termelésteredményez

'Humanizált' ellenanyagokA poliklonális ellenanyagokat általában állatokban, a monoklonálisakat egérben vagy

patkányban állítják elő. Így az állati Ig-t ismételten emberbe juttatva idegen fehérjeként immunválaszt vált ki (és rövid a keringési féléletideje).

Az antigén felismerésében csak a változó domének 3-3 újja vesz részt, tehát az állati eredetű konstans domének rekombináns technológiával lecserélhetők emberi Igkonstans doménekre. Így áll elő a kiméra ellenanyag.

A változó domének antigén-felismerésbenszerepet nem játszó részeinek ki-cserélésével 'humanizálni' lehet amolekulát,

A 'humanizált' ellenanyag ezután emberi Ig-ként viselkedik.

Az emberi immunglobulin géneket hordozó egerek immunizálásaazonnal human Ig termelésteredményez

Ellenanyagok és származékaikMonoklonális és bispecifikus ellenanyagok

Kétféle hibridóma sejt fúziójával olyan sejtet lehet előállítani, amely kétféle antigént ismer fel bispecifikus). Felszíniantigéneket és toxikus anyagokat felismerő bispecifikus Ig-ok,"mágikus lövedékek" alkalmasaklehetnek tumorsejtek pusztítására.

Ha az effektor feladatokra (komple-ment aktiválás, opszonizáció) nincs szükség, az Ig molekulalerövidíthető, egy- vagy kétszálúFab vagy Fv szakaszokra (ezek'minibody' néven is ismertek).

Ellenanyag származékok

A 'mágikus lövedékek' monospecifikus ellenanyagokból (felszíni tumor antigénekre specifikus antitestekből), vagy azok rövidített származékaiból is készíthetőek. Így a toxikus anyagok célba juttathatók, a mellékhatások jelentősen csökkenthetők.

Gyógyszerként használt ellenanyagok

• Az Avastin meggátolja új erek,kapillárisok keletkezését, hatásostumor-ellenes hatással rendelkezik.

Az Avastin egy humanizált, VEGF-ellenes monoklonális ellenanyag

A Remicade, az Infliximab, a Humira a TNF hatását gátolja, reumás artritiszben,Crohn betegségben, krónikus gyulladásos esetekben gyógyító hatású.

Hasonlóképpen, az IL-1 ellenes hatású Anakinra is nagyon hatásos krónikusgyulladásos kórképekben.

A vaksághoz vezető makula degeneráció kezelésére alkalmas a Lucentis(Ranimizumab).


• A Herceptin is humanizált monoklonális ellenanyag, ami az EGF receptorhoz kötődik és meggátolja annak dimerizálódását.

• Az EGF.R számos tumorban, pl. emlőrákokban túltermelődve fontos szerepet játszik a tumor kialakulásában, terjedésében.

A Xolair (Omalizumab) az IgE hatását neutralizálja, asztmás és súlyos allergiás betegekben jelentősen enyhíti a tüneteket.


Colorectal cc. ellen hatásos két másik EGF.R-t felismerő ellenanyag, a Vectibix(Panitumumab) és az Erbitux (Cetuximab).

Egyes vírusbetegségek ellen jelentenek védelmet más készítmények, pl. arespiratory syntitial virus (RSV) ellen a Synagis (Palivizumab).

A szervátültetéseket követő kilökődési reakciók fékezésére alkalmaskészítmények a Simulect (Basiliximab) vagy a Zenapax (Daclizumab).

Non-Hodgkin limfóma kezelésében, autoimmun betegségekben nagyon jóeredményeket értek el (a B sejtekre jellemző CD20 antigén elleni) Rituxan-nal(Tositumomab)

Sérült-, gyulladt szövetek csillapíthatatlan fájdalmát enyhíti a tanezumab, egyhumanizált monoklonális ellenanyag, ami az NGF kötődését gátolja

Diagnosztikai ellenanyagok

SzövettanImmunprecipitációSejt szeparálásFehérje (kórokozó) azonosításAffinitás kromatográfiaTumor diagnosztika Tumor terápiaRIA, ELISA

Immunogold 'festés'

Fluor-jelölt ellenanyagok

Diagnosztikai ellenanyagok

SzövettanImmunprecipitációSejt szeparálásFehérje (kórokozó)

azonosításAffinitás kromato-

gráfiaTumor diagnosztika Tumor terápiaRIA, ELISA

Tumor sejtek, magzati sejtek, ritka sejttípusok izolálására alkalmas, kíméletes eljárás

Diagnosztikai ellenanyagokSzövettanImmunprecipitációSejt szeparálás: Fluorescence-activated cell sorterFehérje (kórokozó) FACS

azonosításAffinitás kromato-

gráfiaTumor diagnosztika Tumor terápiaRIA, ELISA

rekombinánsfehérje alapú gyógyszerek,...

Documents