Regulación de la Expresión Genética Mediante RNA: Interferencia por RNA

(RNA Interference), Ribozimas y Aptámeros

Oscar N. Ruiz, Ph.D.

Curso: BIOT 3250

Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamon

A. Objetivos

• Entender los mecanismos de silenciamiento y regulación de genes controlados por RNA.

• Comprender los conceptos que permiten la aplicación de la regulación mediante RNA a la biotecnología moderna.

• Aplicar los conceptos de la regulación de expresión mediante RNA para el desarrollo de agentes terapéuticos.

B. Conceptos Previos• Transcripción

– Promotor y Terminador– Estructura secundaria del RNA

• Modificaciones Post-transcripcionales– RNA Splicing : separacion del RNA

– RNA Editing: cambios de nucleotidos para favorecer codones abundantes

• Regulacion de la expression:– Eucariota: transcripcional, post-transcripcional y traduccional– Procariota: transcripcional

C. Pertinencia del Tema• Nuevas terapias son requeridas para contrarrestar:

– Enfermedades bacterianas • MRSA: “methicillin-resistant S. aureus” (www.cdc.gov)

– Enfermedades virales • VIH: Retrovirales (inhibidores de proteasa y inhibidores

de retro-transcripción)• Fiebre aviar (Avian Flu)

– Enfermedades genéticas• Cáncer: gen p53 (Brummelkamp et al., 2002)

– Desarrollo de organismos modelos

– Estudios de función de los genes mediante “gene knockdown”

D. Marco Conceptual

• Interferencia por RNA o RNA interference (RNAi): la inhibición especifica de la expresión de genes mediante dsRNA (Fire, 1999).

• RNAi es un mecanismo conservado en eucariotas:– Protege contra:

• RNAs exogenos: viruses• Transposones: elementos móviles y repetitivos

– Regulación post-transcripcional• Genes del desarrollo

• Aplicaciones biotecnológicas:

– Permite el análisis proteomico a gran escala

– Se está convirtiendo en una tecnología muy prometedora para el desarrollo de agentes terapéuticos (Santel et al., 2006) .

• Gran especificidad

• Bajos efectos secundarios

• No se conoce resistencia

– Desarrollo de organismos modelos para enfermedades humanas.

RNAi en la Célula

Shi et al., 2002

Mecanismo del RNAi

• En animales RNAi requiere múltiples pasos:

– Generación de siRNAs a partir de dsRNAs largos

• Rnase III-like endonuclease (Dicer)

– Degradación de RNA complementario mediante el complejo siRNA-RISC (RNA-induced silencing complex) (Hannon, 2002).

www.rnaiweb.com/RNAi/What_is_RNAi

• El mecanismo de RNAi es bien conservado pero con características diferentes en cada organismo:

– C. elegans: ocurre la amplificación y conversión de ssRNA a dsRNA

• RNA-dependent RNA polymerase

• Este dsRNA es substrato para mas RNAi mediante (Ahlquist, 2002).

– C. elegans: se ha observado el esparcimiento de RNAi de una célula a otra:

• Efecto sistémico

• Transportador específico de siRNA en la membrana celular (Winston et al., 2002).

• ORFs similares a los de C. elengans en humanos y en ratones pero .

park.itc.u-tokyo.ac.jp/mgrl/IINO_lab/g2_molgenet2.html

RNA polimerasa dependiente de RNA “RNA-dependent RNA polymerase”

• En C. elegans and Drosophila: – siRNA se deriva de dsRNA largos.

• En las células mamíferas:– dsRNA mayores de 29 nt producen la activación de la

“dsRNA-dependent protein kinase (PKR)” (Stark et al., 1998; Schiffelers et al., 2004)

• Produce la inhibición generalizada de la transducción e induce a la apoptosis (Gil, 2000).

• Dicer tiene baja actividad en el procesamiento de dsRNA largos in vivo

– Acumulación de dsRNA (Brummelkamp et al., 2002).

• Activa la respuesta tipo 1 mediada por inteferón• “STAT-mediated expression of PKR”.

– signal transducer and activator of transcription 1 (91kDa)

• dsRNA se une a PKR directamente y la activa– Ocurre fosforilacion del factor de iniciación eucariota (global

shutdown of translation).

• dsRNA promueve la síntesis de acido poliadenílico “polyadenylic acid”

– Activa a Rnase L

http://www.ambion.com/techlib/resources/RNAi/

fig.cox.miami.edu/~cmallery/.../how_siRNA_works.htm

www.biovalley.fr/francais/.../collec_shrna_pour_rnai.htm

• Producción de siRNA por síntesis química– Beneficios:

• Muy específicos • Síntesis a gran escala es posible

– Problemas: • Se necesita suplir el siRNA de forma continua• Su síntesis es costosa• Se necesitan con alta pureza y concentración

– estudios in vivo necesitan altas concentraciones.

• Es necesaria la utilización de lisosomas y compuestos poli-cationicos para envío.

Estatus de la Tecnología

Producción de siRNA mediante vectores plásmidos:Se Pueden utilizar el promotor de la RNA polimerasa III:

• contiene todos los elementos de transcripción contenidos de forma compact

• La RNA polimerasa III esta envuelta en la producción de micro-RNA celulares y produce una extensión de 2 nt.

• Permite expresión por periodos mas prolongados

• Alta expresión y costos mas bajos

• Problemas:

– Expresión temporera del siRNA

– Eficiencia de la transfección es muy baja especialmente in vivo.

• Para resolver algunos de los problemas encontrados se han utilizado vectores virales incluyendo: retroviruses, lentiviruses, and adeno-associated viruses:

– Herramienta muy efectiva para la producción de siRNAs en células (Brummelkamp et al., 2002; Haasnoot et al., 2004; Zhang et al., 2004)

• Expresión estable y constitutiva • Alta transferencia del transgene

• Desventajas:

– Retroviruses han causado efectos adversos en estudios clínicos.

– Limita la aplicación de este sistema y otros sistemas de integración al azar como métodos de expresión de siRNA en el futuro cercano (Recchia et al., 2006).

• Posibilidad de contaminación con virus viables.

– Capacidad limitada para utilización in vivo en humanos:

• Tropismo del virus es limitado

• Es trabajoso seleccionar las células transfectadas.

• Enfermedades humanas en estado avanzado requieren expresión del siRNA en múltiples tejidos o en el cuerpo completo.

• De manera alternativa, se podría inyectar siRNA sintetizados in vitro o químicamente cubiertos por liposomas (Santel et al., 2006).

– Mas seguro

– Requiere altas concentraciones del siRNA

– Es muy costoso

G. Resumen La tecnología del RNAi ha demostrado gran

potencial RNAi in vitro and in vivo (Fraser et al., 2000; Lewis et al., 2002)

• Grandes aplicaciones terapéuticas

• RNAi ha logrado la reducción de la expresión de proteínas en sobre un 90%.

• Múltiples genes han logrado ser silenciados:– Genes reporteros– Genes virales (HIV proteins vif, nef and LTRs)– Oncogenes (p53)

Problemas que limitan el uso de RNAi como agentes terapéuticos en humanos: (Uprichard 2005).

– Mecanismos de envío

– siRNA (small interference RNA) de tamaño específico 19-23 nt

– Efecto transitorio

– Síntesis costosa

D. Marco Conceptual: Aptámero

• Oligonucleótidos de RNA o DNA que producen estructuras secundarias tridimensionales con especificidad por otras moléculas

• SELEX: Evolución sistemática de ligándos por enriquecimiento exponencial “Systematic evolution of ligand by exponential enrichment”– Biblioteca de 1 x1014-1015

http://www.devicelink.com/ivdt/archive/07/05/010.html

E. Ventajas y Aplicaciones• Macugen (OSI Pharmaceuticals):

aptamero inhibe el “antivascular endothelial growth factor” que participa en el crecimiento de vasos sanguíneos en el ojo.– Aprobado por el FDA para tratar

degeneración macular neovascular.

• ARC183 (Gilead) : aptamero anti-trombina que inhibe la coagulación fisiológica de la sangre. – Aprobado en fase clínica I

Riboenzimas “Ribozymes”• Riboenzimas: RNA con

capacidad catalítica que cortan otras moléculas de RNA. – Cortan su propia secuencia

– Cortan secuencias en otros RNA

– Muchas contienen Mg+2 como cofactor

– Dos regiones:• Catalítica• Secuencia de reconocimiento

Pley, H.W., Flaherty, K.M. and McKay, D.B. (1994) Three-Dimensional Structure of a Hammerhead Ribozyme. Nature 372, 68-74.

E. Aplicaciones

• Ribozima anti-hepatitis B (Penn State College of Medicine): Destruye hasta el 80% del virus en el hígado del ratón.

• Es el único mecanismo in vivo que ha demostrado la reducción del virus de la hepatitis B.