RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

RECUENTO DE ESPORAS CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR

TEORIA RELACIONADA

La contaminación microbiana de alimentos es un problema serio para la industria alimentaria por las grandes pérdidas económicas que trae consigo. Este fenómeno es mixto por la participación de bacterias, hongos filamentosos y levaduras, pero ha sido estudiado mayormente en bacterias y hongos filamentosos por su protagonismo en el daño.

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en los equipos. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc.

Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación y (c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimento.

Existen grupos de levaduras que ejercen efecto perjudicial sobre los alimentos los cuales son pocos y están identificados en géneros y especies comunes, según los reportes de cada tipo de alimento revisado. Esto puede estar dado por la capacidad que poseen de resistir factores físicos, compuestos químicos y factores ambientales que de forma natural o extrínseca contribuyen a proteger los alimentos de origen vegetal y animal; fresco o elaborado contra el ataque de microorganismos y en especial de levaduras.

Además de afectar la industria la contaminación microbiana de alimentos también afecta la salud. Algunos microorganismos produce enfermedades la mayoría de carácter gastrointestinal los cuales son síndromes originado por la ingestión de alimentos y/o agua que

contengan agentes etiológicos en cantidades tales que afecten la salud del consumidor a nivel individual o grupos de población.

La Organización mundial de la Salud (OMS) ha definido a las Enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) como “una enfermedad de carácter infeccioso o tóxico que es causada, o se cree que es causada, por el consumo de alimentos o agua contaminada”.

Entre las bacterias productoras de ETAs encontramos el Clostridium entre las especies que mas se destacan en alimentos son: C. botulinum es el nombre de la bacteria que produce la enfermedad del botulismo. Es formador de esporas y un potente productor de neurotoxina, aunque La incidencia de la enfermedad es baja es considerada de interés debido a la elevada tasa de mortalidad si no se diagnostica y trata apropiadamente. Y C. perfringens Está ampliamente distribuido en la atmósfera y se halla frecuentemente en el intestino humano y de muchos animales domésticos y salvajes. Las esporas del microorganismo están presentes en el suelo, sedimentos y áreas sujetas a la polución fecal por humanos y animales.

OBJETIVOS

Generales

Realizar el recuento de mohos y levaduras presentes en un alimento

Realizar el recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor presentes en un alimento.

Específicos

Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, el número de mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano.

Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de productos cárnicos.

PROCEDIMIENTO

Se prepararon diluciones logarítmicas a base 10 (10-1, 10-2 y 10-3). Se marco un frasco como dilución 10-1 y se adicionaron 90ml de agua peptonada al 0.1%; marcamos dos tubos de vidrio tapa rosca como 10-2 y dilución 10-3 y adicionamos 9ml de agua peptonada al 0.1%.Dilución 10-1: pesamos 10g del alimento (cande de cerdo) y lo agregamos al frasco marcado como dilución 10-1 y mesclamos hasta homogenizar la mezcla.

Dilución 10-2: tomamos 1ml de la dilución 10-1 y lo agregamos al tubo marcado como 10-2 y se mesclo hasta homogenizar.

Dilución 10-3: tomó 1ml de la dilución anterior y se agrego al tubo marcado como 10-3.

Obteniendo así las tres diluciones:

A partir de estas tres diluciones realizamos la determinación para mohos y levaduras y la determinación de esporas de Clostridium sulfito reductor.

1. Determinación de mohos y levaduras en carne de cerdo.

Se realizaron siembras en profundidad, para esto tomamos 3 cajas de petri estériles y las marcamos como 10-1, 10-2 y 10-3. Mezclamos unas diez veces con la pipeta de la dilución 10-1 y tomamos 1ml de esta dilución y lo adicionamos en la caja marcada como 10-1, mezclamos de igual forma con la pipeta marcada como 10-2 y tomamos 1ml de la dilución 10-2 y lo adicionamos en la caja marcada con la misma dilución, de la misma forma se tomó 1ml de la dilución 10-3 y fueron agregados a la caja marcada como 10-3.

Adicionamos 15ml de agar Extracto de malta-oxitetraciclina (OGY) fundido a 45°C a cada una de las cajas.

Una vez agregado el agar mezclamos varias veces en forma de ochos en dirección de las manecillas del reloj con el fin de que se produzca una distribución homogénea de la muestra en el medio de cultivo, se dejó en reposo para que se solidificara el agar y se incubaron a 22°C por 7 días.

2. Determinación de esporas de Clostridium sulfito reductor.

Para la determinación de Clostridium sulfito reductor se realizo por dos métodos. Recuento en placa y recuento en tubo.

Recuento en placa.Tomamos tres cajas de petri estériles las cuales marcamos como 10-1, 10-2 y 10-3. Luego con una pipeta tomamos 1ml de las diluciones preparadas anteriormente y se agregaron a cada una de las respectivas cajas de petri.Posteriormente agregamos 15ml de agar SPS fundido a 45°C en cada una de las cajas, se mezclaron de igual forma que el procedimiento anterior y dejamos solidificar.Colocamos las cajas con las tapas hacia arriba en la jarra de anaerobiosis y se incubaron a 37°C por 48 horas.

Jarra de anaerobiosis

Recuento en tubo.

Marcamos tres tubos como 10-1, 10-2 y 10-3. Tomamos 1ml de la dilución 10-1 y se los

agregamos al tubo marcado de igual, de igual forma con la pipeta marcada como 10-2

tomamos 1ml de la dilución 10-2 y lo adicionamos en el tubo de esta misma dilución,

de la misma forma se tomó 1ml de la dilución 10-3 y se agregaron al tubo marcado como 10-3.

Después procedimos a calentar los tubos en baño serológico a 80°C por 10 minutos, pasados estos enfriemos los tubos en un beaker con agua y hielo.

Una vez fríos les agregamos 12 ml de agar SPS fundido a 45°C en cada uno de los tubos y lo dejamos solidificar, para luego agregar una segunda capa de 3ml de agar SPS fundido a 45°C.

Se incubaron en anaerobiosis a 37°C por 72 horas.

Jarra de anaerobiosis

RESULTADOS

Recuento de mohos y levaduras.Pasados los 5 días de incubación se procedió a evaluar el crecimiento de las colonias.

Dilución 10-1: presento crecimiento de colonias de aspecto mucoide compatibles con levaduras mayor de 300 UFC. Y el crecimiento de 9 colonias de aspecto filamentoso compatibles con mohos.

Dilucion 10-2: esta dilución presento un crecimiento similar al de la dilución anterior siendo las colonias de aspecto mucoide mayores de 300 UFC y las colonias de hongos filamentosos se redujeron a 2 UFC.

Dilucion 10-3: es esta dilución se observó el crecimiento conglomerado de colonias de aspecto mucoide, imposibilitando se recuento.

Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor.

Recuento en placaAl revisar los medios de las distintas diluciones no se observo crecimiento de colonias negras características de Clostridium. En ninguna de estas. Sin embargo se observo e crecimiento de colonias bancas cremosas y otras de color amarillo claro en todas las siembras.

Recuento en tuboNo se observo crecimiento de ningún tipo de colonia.

PRELABORATORIO

1. Cual es el fundamento del agar OGY?El agar OGY (Agar-Oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura) es un agar selectivo para la demostración y numeración de mohos y levaduras en todo tipo de material de investigación (alimentos, material clínico, etc.) El agar-oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura ha sido recomendado como medio de rutina para la investigación de mantequilla. Esta compuesto por extracto de levadura, D-glucosa, Agar-agar, Oxitetraciclina 0,1 o Gentamicina 0,05.

2. Cual es la importancia de la determinación de mohos y levaduras y en que tio de alimentos se determinan?

El papel de los mohos y las levaduras es secundario en la contaminación microbiana de alimentos, las condiciones ambientales de preservación de estos, que tienden a inhibir el crecimiento de bacterias, han favorecido la aparición de levaduras contaminantes, causantes igualmente de afectaciones en los parámetros organolépticos de buena calidad en alimentos frescos, semi-elaborados y elaborados. La importancia de estos microorganismos es que Las levaduras alteradoras de alimentos, se definen como especies particulares capaces de causar deterioro en alimentos y bebidas que han sido procesados y empacados según las Normas de Buenas Prácticas para producción, manejo y empaque de los alimentos.

Estas se determinan en alimentos de origen vegetal, frutos, verduras y granos; productos de panadería; alimentos elaborados en salmueras y ácidos; leche y productos lácteos; así como carnes frescas y curadas.

3. Cual es el fundamento del agar SPS? El agar SPS se utiliza para la detección y la enumeración de Clostridium perfringens en los alimentos. Los medios propuestos para enumeración de anaerobias sulfito reductoras de Clostridium en los alimentos. Contiene peptona como fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales. Suministro de extracto de levadura complejo B, las vitaminas que estimulan el crecimiento bacteriano. Citrato férrico y sulfito de sodio son indicadores al ser reducidos por los Clostridium en sulfuro, que reacciona con el hierro a partir del citrato férrico para formar de un sulfuro de hierro precipitado negro. Polisorbato 80 es un agente dispersente. Sulfato de polimixina B y la sulfadiazina son inhibidores de otros organismos de Clostridium spp. Tioglicolato de sodio es un agente reductor. El agar es el agente solidificante

4. Cual es la importancia de l determinación de Clastridium perfringes en los alimentos?C. perfringens Está ampliamente distribuido en la atmósfera y se halla frecuentemente en el intestino humano y de muchos animales domésticos y salvajes. Las esporas del microorganismo están presentes en el suelo, sedimentos y áreas sujetas a la polución fecal por humanos y animales. Y es uno de los microorganismos productores de ETAs.

BIBLIOGRAFIA

GAMAZO Carlos y LOPEZ GOÑI Ignacio. Manual Practico de Microbiología. 3ra Edición. Ed. MASSON.

PASCUAL ANDERSON María del Rosario y CALDERON Vicente. Microbiología Alimentaria Metodología Analítica para Alimentos y Bebidas. 2da Edición.

www.google.com.co

Resolución 4282 de 2007

CONCLUSIONES

La identificación de levaduras y mohos en alimentos tiene un interés desde el punto de vista estético de la carne, pero a nivel de salud pública no representa interés alguno ya que conforman menos del 25 % de las especies identificadas y de éstas, un número muy bajo son de forma dañina.

Por otro lado es de gran de interés la determinación de bacterias entre ellas Clostridium ssp. Ya que esta relacionada con diferentes síndromes que afectan a nivel gastrointestinal llegando a comprometer la vida de los consumidores.

Por tal razón ha sido de gran importancia la realización de este informe que nos ha dado a conocer la importancia de la determinación de microorganismos en alimentos y el método para poder evaluar y cuantificar la presencia de estos, aprendiendo a su vez los parámetros microbiológicos permisibles para cada alimento.

COMPARACIÓN DE PARÁMETROS