receptores respuesta - iib.unsam.edu.ar · las señales intracelulares se propagan a través del...
TRANSCRIPT
El comportamiento celular es regulado por numerosas y variadas señales (=estímulos) extracelulares.
Las señales contienen información y son sensadas por receptores que inician una respuesta en la célula
blanco.
Cualitativamente, información refiere a significado en relación a una función biológica.
Cada tipo celular expresa una combinación de receptores particular que determina el rango de señales
extracelulares que puede detectar y el rango de respuestas.
Los receptores convierten las señales extracelulares en señales intracelulares (transducción de la señal).
Las señales intracelulares se propagan a través del citoplasma y eventualmente el núcleo.
Las señales exhiben rangos de amplitud, frecuencia, duración y distribución espacial característicos.
La propagación de la información involucra cambios de estado en las moléculas que participan en la
señalización.
Los cambios de estado de las moléculas señal se acoplan en tiempo y espacio, organizando vías de
señalización que a su vez se interconectan formando redes.
Las moléculas señal predominantes son proteínas que poseen una estructura y función modular.
Proteínas adaptadoras y “scaffolds” utilizan múltiples dominios de interacción para ensamblar
complejos de señalización y anclarse a un compartimiento subcelular.
Interruptores o “switches” moleculares controlan la activación de múltiples vías o subredes. Representan
centros de conexión/distribución o “hubs” en el interactoma.
Los complejos de señalización facilitan la compartimentalización y la especificidad de los eventos.
Redes de señalización regulan los diferentes sistemas moleculares funcionales de la célula,
por ej. el secretor, el citoesqueleto, el transcripcional, etc.
survival
proliferation
apoptosis
Hanahan & Weinberg, Cell 2000
Múltiples estímulos (señales) regulan el comportamiento celular
La transferencia de información entre componentes celulares involucra cambios de estado
cambio de estado controlado
(positiva o negativamente)
por múltiples modificaciones
El cambio de estado es inducido
por un evento (“input”) que
produce una respuesta (“output”).
cambio de estado de un
substrato controlado por
un par de enzimas antagónicas
Kim & Pawson, Cell 2010
En la célula existen varias posibilidades de cambios de estado
(ej. ATF6, p53
CAMs)
(ej. integrins,
GTPasas)
(ej. MAPK, β-cat)
(ej. proteínas G, Bad, NFβ)
Las proteínas pueden modificarse post-traducción por la adición covalente de diversos grupos funcionales
Las modificaciones post-traducción pueden alterar la estructura, interacción, localización y estabilidad de las proteínas
(a) Serina y fosfoserina; (b) lisina
y N-acetil lisina se muestran en
formato de varillas con la
superficie molecular superpuesta.
Tanto el fosfato como el grupo
acetilo incrementan el tamaño de
la cadena lateral. El potencilal
electrostático de la superficie es
indicado en rojo (negativo) y en
azul (positivo). La fosforilación
introduce una fuerte carga
negativa mientras que la
acetilación disminuye la carga
positiva de los respectivos
residuos no modificados.
OH
PO3=
Frecuentemente múltiples cambios de estado están acoplados
tirosina quinasa Src
conformation change
/dephosphorylation
Los sistemas de procesamiento de información operan de manera análoga a diferentes escalas
(redes)
bacterias
- sensado de nutrientes (plasticidad metabólica, ej. operon lac)
- quimiotaxis (movilidad direccionada, ej. sistema Che)
- “quorum sensing” (respuesta a la densidad poblacional, ej AHLs)
eucariotas unicelulares (levaduras, Dictyostelium)
- sensado de feromonas (apareamiento o “mating”)
- quimiotaxis (migración direccionada)
eucariotas pluricelulares
- gran complejidad de señales (hormonas, citoquinas, adhesión,
factores de crecimiento, etc)
Bacterias flageladas (E. coli, Salmonella) responden a gradientes de moléculas atractoras o repelentes
adoptando diferentes patrones de migración: direccionado (A) o al azar (B). En ausencia de gradiente las
células alternan fases de movimientos direccionados y al azar.
Señales reguladoras de migración en bacterias (quimiotaxis)
A: movimiento direccionado
(rotación de flagelos en
sentido anti-horario)
B: movimiento no direcionado
(rotación de flagelos
en sentido horario)
Alberts et al, BMC 2002
Los receptores quimiotácticos modulan la
actividad de la histidin-quinasa CheA (auto-
fosforilación) y la transferencia del fosfato a
CheY (regulador). CheY fosforilado
interacciona con FliM, un componente del
motor que induce la rotación del flagelo en
sentido horario. La fosfatasa CheZ defosforila
a CheY y termina la señalización. Otros
mecanismos regulatorios controlan la
sensibilidad de los receptores (adaptación).
sentido
horario
adaptador
histidin-kinasa
regulador
fosfatasa
FliM
(activan
la vía)
motor del
flagelo
FliM
Señales de confinamiento o densidad poblacional “quorum sensing” (QS)
Bacterias Gram negativas sintetizan y secretan moléculas que actúan como autoinductores, por ejemplo las acil homoserina
lactonas (AHLs) sintetizadas por la enzima AHL sintasa (LuxI). En condiciones de confinamiento o alta densidad bacteriana,
la concentración de AHLs supera un umbral requerido para unirse a una proteína que actúa como receptora (LuxR), que se
une al ADN y regula la expresión de numerosos genes blanco que responden al “quorum sensing”.
Sistema LuxI/R de Vibrio fischeri
Li & Nair, Protein Sci 2012
S-Adenosyl Metionina (SAM)
+ acyl Acyl Carrier Protein (ACP)AHL
Genes regulados por éste
sistema de QS están
relacionados con virulencia,
resistencia a antibióticos, etc.
Señales inductoras de migración direccional en Dictyostelium (quimiotaxis)
En ausencia de nutrientes las amebas de Dictyostelium (musgo) secretan cAMP de modo intermitente. El cAMP estimula
receptores acoplados a proteínas G en la superficie de células vecinas y promueve una respuesta migratoria quimiotáctica
que facilita la movilidad colectiva, la agregación de las células y el subsecuente desarrollo de un órgano productor de esporas.
cAMP
patrones espiralados de migración
hopf.chem.brandeis.edu/.../spiral/index.html
ameba
cuerpo
fructífero
receptor acoplado
a proteínas G
regulación del
citoesqueleto,
migración,
transcripción
Señales reguladoras de crecimiento direccional (quimiotropismo) en levaduras
no estimuladas estimuladas
(polarización)
Células haploides de levadura secretan un factor de apareamiento (feromona) a
o a que estimula receptores acoplados a proteínas G en células que secretan
el factor alternativo. El receptor activo dispara respuestas relacionadas con el
crecimiento polarizado y el arresto del ciclo celular. ~ 200 genes involucrados.
Alberts et al, BMC 2002; Lodish et al, MCB 2004
Lee et al Integr Biol 2012
gra
die
nte
de
fe
rom
ona
Ste: “sterile” mutants
(WASP)Ste20
Ste11
Ste7
Fus3
Pak
MAPKK
MAPK
cell division arrest
Ste
5
cytoskeletal rearrangement,
polarized growth
pheromone
Ste18/
Ste4
MAPKKK
Ste12
Cdc42
Péptidos con N-formil-metionina (fMLP) secretados por bacterias estimulan
receptores acoplados a proteínas G en la superficie de neutrófilos,
induciendo una respuesta quimiotáctica, y la liberación de microbicidas.
liberación de una pequeña
cantidad de formil-Met-Leu-Phe
(fMLP) con una micropipeta.
respuesta:
polarización
respuesta:
migración
hacia la fuente
de péptido
Alberts et al, BMC 2002
Señales inductoras de motilidad direccional en neutrófilos (quimiotaxis)
video disponible a:
http://www.biochemweb.org/fenteany/research/cell_migration/movement_movies.html
sensado de
Información
espacial
formil-péptidos se unen a receptores FPR acoplados
a proteínas G presentes en monocitos y neutrófilos.
respuesta biológica: polarización y motilidad,
producción de ROS, secreción de proteasas
lamela
Los espermatozoides responden a diferentes gradientes
Los espermatozoides de diversas especies de mamíferos responden a gradientes
químicos (quimiotaxis), de tempertura (termotaxis) y a la corriente de fluído (reotaxis).
reotaxis
Perez-Cerezales et al Asian J Androl. 2015
quimiotaxis (a progesterona)
cuando la célula sensa el gradiente (1)
reduce la frecuencia de cambios de
dirección o giros. Incrementa los giros
en ausencia de gradiente (2)
1
1
2
termotaxis
cambio de temperatura
Plantas. TropismoRespuesta al sombreado
Los fitocromos alternan entre
2 estados regulados por luz
roja (660 nm) y roja lejana (~730 nm)
La respuesta al sombreado
es controlada por moléculas
fotoreceptoras, ej. fitocromos.
Las plantas de la derecha son sujetas al sombreado (baja relación rojo/rojo lejano).
Responden elongando sus tallos y los pecíolos, y variando la posición de las hojas.
luz normal luz normal
luz normalluz normal
luz roja lejana (FR)
Las disminución de la relación R/FR
promueve la forma Pr y se induce la
respuesta de las plantas al sombreado.
Esto involucra la expresión de diversos
genes nucleares regulados por factores
de transcripción (Phytochrome-Interacting
Factors, PIFs).
Pr, inactivo Pfr, activo
luz roja (R)
↓PIFs↑PIFs
Una señalización compleja guía el crecimiento axonal en el desarrollo
Thanos & Mey, BBRC 2001
Factores tróficos estimulan la supervivencia neuronal y la elongación axonal; moléculas de adhesión
y de direccionamiento (repelentes y atractoras) controlan el tropismo de los axones hacia su blanco.
1) Fibroblastos asociados al tumor secretan
factores (ej. HGF/SF) que estimulan receptores c-
Met en las células tumorales y promueven la
migración.
2) Células tumorales secretan factores (VEGF y
bFGF), que estimulan a receptores en las
células endoteliales e inducen angiogénesis.
3) Fibroblastos y células endoteliales
secretan enzimas latentes como MMPs y uPA,
que son activadas en contacto con el
invadopodio de la célula tumoral, y degradan
la ECM y los ectodominios de las caderinas,
promoviendo la invasión celular.
4) La degradación de la ECM libera factores
como el TGFb y el EGF que promueven
angiogénesis y proliferación de la célula tumoral.
5) La degradación de la ECM expone sitios
RGD que estimulan integrinas celulares
promoviendo la migración.
6) La activación de vías de señalización en la
célula tumoral estimulan proliferación (ras, b-
catenina), motilidad (FAK, MLCK) y supervivencia
(PI3K/Akt).
Múltiple señalización existe en el microambiente de una célula tumoral
Liotta & Kohn, Nature 2001
3
3
2
1
4
3
5
6
Mecanismos involucrados en la señalización intercelular/intracelular
Síntesis/generación de señales (proteínas, péptidos, esteroides, etc)
Propagación (rango de acción espacio-temporal)
Detección receptores (célula o efector blanco)
Respuesta (nivel celular, molecular)
Eliminación de la señal y terminación de la respuesta
Uniones en hendidura: permiten
el pasaje rápido de pequeñas
moléculas señal entre células
adyacentes. Ej: Ca++ y cAMP
señalización endócrina
- lenta (difusión, transporte vascular)
- hormonas en baja concentración
- receptores de álta afinidad (nano-picomolar)
En los organismos pluricelulares las señales extracelulares se propagan en diferentes rangos temporales
Alberts et al, BMC 2002
señalización sináptica,
parácrina, autócrina
- rápida
- neurotransmisores en álta
concentración
- receptores de baja afinidad
(micromolar)
minutos, horas milisegundos, segundos
Las señales rápidas y de acción local
tienen en general una vida media
funcional corta, a causa de diferentes
mecanismos: inestabilidad,
degradación enzimática, captación,
inmobilización/enmascaramiento,
modificación, etc.
Las señales extracelulares actúan en diferentes rangos espaciales
AUTOCRINE
Permite coordinar la función de grupos de células,
p. ej. La agregación de las amebas de Dictyostelium
mediada por el cAMP, o la expansión monoclonal
de linfocitos T activados por interleuquina-2.
Alberts et al, BMC 2002
Ej. Células presentadoras de
antígenos y linfocitos T .
Ej. Factores de
crecimiento (FGF), citoquinas, NO.
Ej. Insulina sintetizada por células
b del páncreas.
La dinámica de la señalización codifica informacióny genera respuestas biológicas específicas
Purvis & Lahav, Cell 2013
EGF NGF
LPSTNFa
-irradiation UV-irradiation
activity
activity
levels
diferentes señales
(“upstream”) disparan
diferentes patrones
dinámicos de la misma
molécula blanco
(“downstream”).
Además, promueven
distintas respuestas
biológicas.
La rapidez de la señalización intracelular depende de la dinámica y organización de las vías/redes
Las escalas temporales de las respuestas dependen de
la complejidad de las vías intracelulares involucradas.
Alberts et al, BMC 2008
La duración o persistencia de una señal depende de su tasa de recambio o “turnover” en la célula
100 molec/seg 1000 10 1000 + 100 - 1000 = 100
señal ↑producción/↓degradación cción total (molec/cel) duración (seg) cambio 1 seg posterior
10 molec/seg 1000 100 1000 + 10 - 100 = 910
x10 ↑
1000 + 100 – 10 = 1090
1000 + 1000 – 100 = 1900
x10 ↑
x10 ↓
x10 ↓
tasa de magnitud del
El tiempo de recambio o “turnover” de
las señales puede influir sobre la
rapidez, magnitud y persistencia de la
respuesta.
tiempo de recambio
↑ indica incremento en la síntesis/generación; ↓ indica incremento en la degradación/inactivación de la señal
La combinación de señales extracelulares determina la respuesta celular
Alberts et al, BMC 2002
Cada tipo celular expresa una
combinación de receptores específica,
que determina el rango de señales (A,
B, C, etc) capaces de sensar.
Los sistemas de señalización celulares muestran un comportamiento análogo a compuertas lógicas (“logic gates”)
Las compuertas lógicas especifican una respuesta (“output”)
binaria dependiendo de la combinación de 2 estímulos (“inputs”).
Ejemplo: Promotores pueden integrar señales de múltiples vías/redes de señalización
En linfocitos T activados por células presentadoras de antígenos, una respuesta importante de la señalización
de TCRs (“T-Cell Receptors”) es la activación del promotor de la citoquina IL-2. IL-2 promueve supervivencia y
proliferación de los linfocitos T activos. El promotor de IL-2 actúa como una compuerta “AND” integrando
señalización de 2 vías distintas que activan factores de transcripción diferentes.
NFAT: Nuclear Factor of Activated T cells
AP-1: Activator Protein-1
Diferentes señales extracelulares pueden converger en la activación de vías de señalización intracelulares comunes
(= Adrenalina, secretada por la gl. adrenal)(secretada por el páncreas)
(secretada por la hipófisis)
“mensajero secundario”
“mensajero primario”
Los receptores para cada hormona son diferentes pero actúan a través de mecanismos
de señalización intracelular similares: ej. activando proteínas G Adenilato ciclasa.
Una señal puede desencadenar respuestas diferentes dependiendo de los receptores estimulados y la maquinaria molecular asociada
Alberts et al, BMC 2002
acetilcolina, molécula señal
síntesis: choline
acetyltransferase
degradación:
acetylcholine esterase
contracción
receptores
nicotínicos(ion channels)
↑Na+ in
Na+ acetilcolina
célula muscular
esquelética
↑Ca2+
contracción
célula muscular lisa
Gq-Ca2+
relajación
Gβ - ↑K+out
célula muscular
cardíaca
secreción
Gq-Ca2+
célula de glándula salival
acetilcolina
acetilcolina
mismo tipo de receptores muscarínicos (GPCRs)
El número y afinidad de los receptores celulares pueden cuantificarse de curvas de saturación
Las células exhiben una capacidad de unir al ligando saturable (unión total, A); la unión del ligando a sitios inespecíficos no
es saturable dentro del mismo rango de concentración (C). La unión específica (B) resulta de restar la unión inespecífica a la
unión total (A) – (C). De la curva B se puede determinar el número de receptores por célula y su afinidad o fuerza de unión por
el ligando (Kd). El valor de Kd equivale a la concentración de ligando que satura el 50% de los receptores en el equilibrio. El
valor de Kd refleja la afinidad de un receptor por el ligando. A menor valor de Kd mayor afinidad.
Kd =[L-R]
[L] x [R]
Los receptores son proteínas que se unen específicamente a la
molécula señal (= ligando) e inician una respuesta en la célula blanco.
constante de
disociación en
el equilibrio:
Lodish et al 5Ed
L + R L-R
(L)
(L-R
)
La especificidad es una propiedad
relativa y dependiente del contexto.
Interacción péptido-dominio proteico
Superficies complementarias de interacción
La afinidad es una propiedad absoluta e intrínseca a
la fuerza de unión entre las moléculas involucradas.
En general la afinidad
correlaciona positivamente
con el área de interacción.
Involucra interacciones
electrostáticas, puente de
hidrógeno, hidrofóbicas)
Por ej. para un anticuerpo anti-fosfotirosina:
Análisis cuantitativo del estímulo-respuesta
Brent FEBS Lett 2009
agregado de
la feromona
(señal extracelular)
Sistema de señalización asociado
al comportamiento de apareamiento
de S. cerevisiae
curva 1. reclutamiento de la proteína “scaffold” Ste5 a la membrana
curva 2. activación de MAPK Fus3
curva 3. activación del factor de transcripción Ste12
curva 4. expresión de un gen blanco de Ste12 (ej. Fus3)
Lodish et al 5Ed
(1 nM)
En muchos casos la respuesta fisiológica máxima no requiere
de la saturación de los receptores. En el ejemplo debajo ~ el
80% de la respuesta máxima ocurre a una concentración de
ligando equivalente al Kd
Los experimentos muestran que la propagación de la señal desde la membrana
al núcleo ocurre en pocos minutos. También revelan un comportamiento
dinámico similar en las distintas etapas de la señalización (ver hoja 13).
La respuesta al estímulo puede ser gradual o abrupta
Las respuestas biológicas
ultra-sensibles ignoran o
filtran estímulos por debajo
de un valor umbral ( ).
hyperbolic
curvesigmoidal
curve
Diversos mecanismos
producen una respuesta
ultrasensible. Por ejemplo
la unión cooperativa de
múltiples ligandos para
activar a una molécula.
unión
cooperativa
unión
cooperativa
Retroalimentación positiva: Sistemas biestables
inactivo
Retroalimentación positiva (transición G1/S)
activo
fosforilación
+ +duplicación
del ADN
estimulación
Los sistemas biestables generan una
respuesta (on) sostenida (“memoria”)
ante estímulos o señales transitorias.
Retroalimentación positiva. CAM kinase II
off
onsistema biestable
Retroalimentación negativa: Adaptación y comportamientos oscilatorios
phosphorylation
activates the
phosphatase
respuesta
oscilatoria
respuesta de
atenuación
El feedback negativo atenúa la
magnitud de la respuesta
(adaptación) y en ciertas
condiciones genera respuestas
oscilatorias.
Mecanismos de desensibilización o adaptación a diferentes escalas
Las células tienen la capacidad de adaptarse o desensibilizarse (disminución de la respuesta) ante la
exposición prolongada a un estímulo. Diversos mecanismos pueden participar en la respuesta adaptativa.
Mol Biol Cell 2008
La agregación de receptores es un mecanismo que controla la sensibilidad, el tipo y la magnitud de la respuesta
La oligomerización de los receptores de Fc y TCR inducida por la unión al ligando induce la partición de los
receptores en rafts lipídicos (1) donde son fosforilados por kinasas (2). A su vez los receptores fosforilados reclutan
kinasas citosólicas adicionales (ej. Syk, ZAP) (3) que fosforilan proteínas adaptadoras (ej. LAT) (4) y amplifican la
señal.
Secuencia que muestra la formación de una sinapsis inmunológica.
péptido-MHC (verde) y la molécula de adhesión ICAM (rojo).
Grakoui et al Science 1999
mast cell
La agregación de receptores restringe su
difusión en la membrana y facilita la
activación simultanea de múltiples
moléculas de señalización intracelulares.
Simons & Toomre, NRMCB2000
macrophage or
dendritic cell
T cell
La agregación de integrinas refuerza la adhesión y la señalización
Agregados de integrinas en las
adhesiones focales (verde, flechas).
Acumulación de fosfotirosina
en las adhesiones (flechas).
umbralumbral
Ta
ma
ño
de
ad
he
sió
n
Activa
ció
n d
e Y
AP
Adaptado de Elosegui-Artola et al Nature Cell Biol 2016
El tamaño de las adhesiones y la actividad del factor de tranascripción
YAP muestran una respuesta hipersensible a la rigidez del substrato.
ligando multivalentes, fuerzas
señalización
kinasa inactiva
kinasa activa
Fosforilación,
mecanotransducción
La agregación de receptores de acetilcolina en las placas neuromusculares maximizan la transmisión de la señal en la sinapsis motora
Durante el desarrollo, los terminales nerviosos de las motoneuronas
secretan el proteoglicano agrina, el cual contribuye a la agregación
de los receptores de acetilcolina (puntos rojos) en las fibras musculares.
Terminales axonales de motoneuronas y
agregación de receptores de acetilcolina (flechas)
en las placas neuromusculares.
La agregación de quimioreceptores de motilidad y mecanismos de cooperatividad aumentan la sensibilidad de la respuesta
La vía de señalización de la quimiotaxis en E. coli amplifica el
estímulo ~ 50 veces (ej. 1% de cambio en la ocupación de los
receptores induce un 50% de variación en el sentido de
rotación del flagelo. En el ej. se muestra una reducción en la
actividad de CheA cuando el estímulo es un atractante.
Hazelbauer et al TIBs 2007
(Atractante, Serina, mM)
Activid
ad
de
qu
ina
sa
Che
A
Sourjik & Berg, Nature 2004
Las distintas curvas
representan cepas que
expresan distintos
niveles de receptores.
Note que pequeñas
variaciones en el rango
de ~ 0,1 mM inducen
grandes variaciones en
la respuesta.
Los receptores pueden localizarse en la superficie o en el interior celular
Alberts et al, BMC 2008
Ejemplos: receptores de hormonas esteroideas,
tiroideas, retinoides, vitamina D, óxido nítrico
(NO), fitocromos, etc.
Ejemplos: receptores de adhesión (integrinas, caderinas, etc),
de factores de crecimiento (EGFR, PDGFR, etc),
hormonas (insulina, glucagón, etc), citoquinas (interferon,
interleuquinas, etc)
Los receptores de hormonas esteroideas son intracelulares
Los receptores poseen una estructura modular y en ausencia de ligando interaccionan con proteínas
inhibidoras. La unión de la hormona al receptor desplaza las proteínas inhibidoras y el receptor en
combinación con proteínas co-activadoras regulan la transcripción de numerosos genes blanco.
Lodish et al MCB 2004
AD: activation domain
DBD: DNA Binding Domain
LBD: Ligand Binding Domain
cortisol
Las hormonas esteroideas
son sintetizadas a partir de
colesterol, son moléculas
hidrofóbicas que difunden
a través de la membrana
plasmática.
Hormonas esteroideas (cortisol, retinoides, vitamina D, hormonas sexuales)
Los receptores de glucocorticoides (GR), mineralocorticoides (MR), progesterona
(PR) y andrógenos (AR) comparten una estructura de dominios similar.
El receptor del óxido nítrico es una enzima intracelular
El NO es sintetizado a partir de arginina. El NO es una molécula
pequeña que difunde a través de la membrana plasmática.
↑cGMP PKG ↓Ca++
↓Ca++
Alberts et al, BMC 2008
↓MLCPLC
señalización parácrina
El receptor de NO es
una guanilato ciclasa
soluble.
L-Arginine
NOS NOS
Los receptores de superficie difieren en estructura y en los mecanismos de transducción de la señal intracelular
cambio en el potencial
de la membrana
integrinas EGFR
Src/FAK
Rho/Rac/Cdc42
GTPasas
citoesqueleto
de actina
Grb2
Ras
Erk
ciclinas D, c-myc
Las células integran señalización de múltiples receptores de superficie
La complejidad de los procesos regulatorios depende de la organización y dinámica de los componentes involucrados.
Vía de
señalización
(varios pasos)respuesta
rápida
(seg, min)
respuesta
lenta
(horas, días)
respuesta
rápida
(seg, min)
IR
PI3K
AktGlut4
exocitosis
Glut4
(min)
20min
+
pax/p130Cas
Glucosa
redistribución de Glut4
rab
Las señales intracelulares se propagan empleando diferentes mecanismos
Alberts et al., MBC 2008; Lodish et al MCB 2004
- modificaciones covalentes
- cambios conformacionales
- interacciones moleculares
- cambios de localización
La fosforilación de fosfoinosítidos induce la
formación de complejos de señalización.
propagación
de la señal
inactive enzymes
PLCras
ras
ligand
bound
active
kinase
La fosforilación de
receptores induce la
formación de complejos
de señalización.
propagación
de la señal
Cambios alostéricos/interacciones
Modificaciones covalentes
RafRas
Lodish et al MCB 2004
Los mecanismos moleculares involucrados en la transmisión de señales no son mutuamente excluyentes,
por ej. las modificaciones covalentes y las interacciones moleculares inducen cambios conformacionales.
Cambio alostérico: cambio estructural inducido
por la interacción con otra molécula.
milisegundos
Las señales intracelulares se propagan empleando diferentes mecanismos
Interruptores moleculares actúan como compuertas lógicas (“gates”)en las vías de señalización
Las moléculas que funcionan como interruptores moleculares alternan entre dos estados o conformaciones:
activo, en el cual transmiten la señal a efectores, e inactivo, en el cual no transmiten la señal.
interruptores moleculares
Alberts et al, BMC 2002
(GEFs) (GAPs)
Lodish et al MCB 2004
Cambios conformacionales de las GTPasas. Ejemplo: Ras
Las GTPasas presentan partes móviles o “switches” que interaccionan con GDP o GTP. (a) En la forma
inactiva de la GTPasa Ras, el GDP interacciona solo con el switch I. (b) Los GEFs aceleran la disociación
del GDP. Por ej. una alfa hélice (naranja) del GEF Sos desplaza el switch I y facilita la liberación del GDP.
(c) El GTP interacciona simultaneamente con los switches I y II y estabiliza la conformación activa de Ras.
GDP
Las variaciones espacio-temporales de la actividad de las GTPasas pueden visualizarse por FRET
max
min
FRET
GTPasa Rho
excitación
emisión
emisión
del aceptor
excitación
del donor
Rho RBD
GTPasa inactiva (GDP)
Rho RBD
La interacción entre Rho-GTP y
el dominio de unión a Rho (RBD)
acercan al donor y aceptor
permitiendo detectar FRET.
GDP
GTP
Las GTPasas de la familia de
Rho se anclan y activan en la
membrana plasmática. Los
sensores de FRET
monitorean la actividad
relativa de GEFs y GAPs.
Los efectores son proteínas que
solo interaccionan con la forma
activa de la GTPasa. La
interacción modula su actividad.
biosensor
de Rho
La propagación de la señalización intracelular depende de la función de diversas proteínas modulares: adaptadores
Alberts et al, BMC 2008
Módulo o dominio refiere a una secuencia polipeptídica que se pliega independientemente en una
unidad funcional, típicamente de 35-250 aminoácidos. Uno o varios dominios pueden estar presentes
en las proteínas; aquellas involucradas en señalización usualmente contienen varios dominios.
Proteínas modulares con dominios de reconocimiento
Pawson & Nash, TICB 2001
Pawson & Scott, Science 1997
SH2 y PTB reconocen péptidos
conteniendo fosfotirosina.
Secuencias adyacentes
“downstream” o “upstream”
determinan la especificidad,
respectivamente.
Los dominios de interacción reconocen secuencias peptídicas
cortas, y en ciertos casos, con modificaciones pos-traducción
(por ej. fosforiladas, P). hy: indica residuos hidrofóbicos
Los dominios SH2 y PTB se unen específicamente a secuencias cortas que contienen fosfotirosina
El dominio SH2 de Src participa
de interacciones intra- e inter-
moleculares.
Receptores activos fosforilados en tirosina reclutan
proteínas de señalización conteniendo dominios SH2
Existen ~ 115 dominios SH2
(~ 100 aa) en el proteoma humano.
quinasa
inactiva
quinasa
activa
SH2
Kraskouskaya et al, 2013
Dos bolsillos del SH2
determinan la afinidad y
especificidad de la
interacción. La unión al pY
contribuye 50% de la
energía total de la unión.
pY-x-x-x
affinityselectivity
Pawson & Nash, Genes Dev 2000
pYEEI
pYIIPLPD
pYVNV
La afinidad del dominio SH2 está determinada por la pTyr y la especificidad por la secuencia contexto
Superficies de interacción de los dominios SH2 de
PLC, Src y Grb2 (mostradas en azul) y los péptidos
fosforilados (en amarillo). La fosfo-tirosina se localiza a
la derecha (flecha) e interacciona con residuos básicos
del SH2. Los SH2 difieren en la especificidad de los
fosfopéptidos que unen.
El reemplazo de Cys por Tyr en el dominio SH2 de la PLC
cambia la especificidad de reconocimiento, haciéndose similar
a la del dominio SH2 de Src. El reemplazo Thr Trp en SH2-Src
cambia la especificidad haciéndose similar a la de SH2 de Grb2.
Thr
Trp
Tyr
Cys
PLC: Fosfolipasa C
Src: quinasa de tirosina
Grb2: proteína adaptadora
fosfopéptido
fosfopéptido
fosfopéptido
La afinidad de la unión SH2/péptidos-pY es ~ 100 nM
Los dominios SH3 reconocen secuencias cortas ricas en prolinas
Aproximadamente 600 dominios SH3 (~ 60 residuos de longitud) existen en el proteoma humano.
El péptido ligando del tipo (PxxPxR/K) adopta una conformación de a-hélice triangular.
Otros dominios, denominados WW
(~ 40 aa) y EVH (~110 aa) también
reconocen motivos ricos en prolina
en secuencias específicas
diferentes a las de los SH3.
Li Biochem J. 2005
E
Modelo que ilustra la interacción del péptido
PPPALPPK del GEF C3G (en azul) y el SH3
de la proteína adaptadora Crk. Residuos
aromáticos en el SH3 (violeta) acomodan un
dipéptido XP. Un surco adyacente con
aminoácidos ácidos determina la especificidad,
acomodando la lisina/arginina del péptido.
La afinidad de la unión
SH3/péptidos es baja
~ 10 µM
(FPPPP)
Ejemplos de proteínas que
contienen péptidos que unen EVH1
son vinculina, zixina, ActA, etc
Ejemplos de proteínas con EVH
son ENA/VASP, Mena, etc
Ejemplos de proteínas
que contienen SH3 son
Src, Grb2, p130Cas
Los dominios PDZ reconocen péptidos del terminal carboxilo en numerosos receptores
Lodish et al MCB2004
Los dominios PDZ (~90 aminoácidos) se encuentran en más de 600 proteínas. Reconocen secuencias
cortas (~ 3-5 aa) del terminal carboxilo y que terminan en un residuo hidrofóbico. Algunos dominios
PDZ reconocen la secuencia Ser/Thr-X-F, donde F es el residuo hidrofóbico del terminal carboxilo.
PDZ: acrónimo de las primeras letras de las proteínas PSD-95, DlgA y ZO-1, donde se descubrió el dominio PDZ.
Superficie del dominio PDZ de la
proteína“scaffold” PSD-95 y el péptido
KQTSV (representado con varillas). Las
regiones de la superficie que contactan
con el péptido se muestran en colores.
P0 corresponde a la posición del residuo
crítico del terminal carboxilo.
Los dominios PH interaccionan con fosfoinosítidos fosforilados
Relocalización de GFP fusionada al dominio PH de la kinasa Akt. La estimulación con
insulina activa la enzima PI3K y aumenta el nivel de PIP3,4,5 en la membrana, el cual
induce la relocalización de GFP-PH a la superficie (flecha). Este efecto es bloqueado
por Wortmanina, un inhibidor de PI3K.
Los dominios PH (~120 aa) se encuentran en ~ 300 proteínas en humanos. Se unen específicamente
fosfoinosítidos fosforilados (PIPs) en la membrana plasmática y en otros compartimientos. Algunos PH
reconocen selectivamente PIP3,4 y PIP3,4,5, que son productos de la enzima PI3K. Las proteínas con
estos dominios PH selectivos cambian de localización en respuesta a estímulos que activan PI3K.
A B
PH: Plectrin Homology
Britton et al Dev Cell 2002
capa de
fosfatos
capa de
cadenas
hidrocarbonadas
capa de
grupos polares
PIP
PH
Las proteínas adaptadoras contienen diferentes dominios de interacción y facilitan el ensamble de complejos de señalización específicos
Grb2 es una proteína adaptadora que acopla el
EGFR activo con el GEF de ras Sos y la vía de
señalización que activa la MAPK. Grb2
posee un dominio SH2 y dos dominios SH3.
ras
GDP
GTP
GDP
ras
activación
de MAPK
Signaling
enzymes
vía 1
vía 2
Proteínas adaptadoras y “scaffold” suelen usarse como
sinónimos, ambas carecen de actividad enzimática y poseen
una estructura modular con múltiples dominios de interacción.
Algunos autores reservan el término “scaffold” para proteínas
que actúan como plataformas de interacción estables, y que
facilitan la señalización en una región subcelular relativamente
definida. Por ej. PSD95 en la sinapsis neuronal.
Esquema de funcionamiento de una proteína adaptadora
Proteínas “scaffold” compartimentalizan la señalización
Good et al., Science 2011
Los “scaffold” controlan espacialmente el flujo de la señalización y aseguran la propagación
eficiente de las señales intracelulares minimizando interacciones inespecíficas.
AKAPs son “scaffolds” que organizan la señalización dependiente de PKAen compartimientos específicos
AKAP79 facilita la transmisión sináptica en el hipocampo
y asocia las enzimas PKA y PKC con los receptores de
glutamato y adrenalina en la membrana plasmática.
cAMP
cAMP
(AMPAR)
adrenalina
Regulación del calcio en el cardiomiocito
AKAPS: A-Kinase Anchoring Proteins
membrana plasmática
PKA
Múltiples AKAPs facilitan la señalización
dependiente de PKA en cardiomiocitos. La PKA
regula diversos canales de calcio en la membrana
plasmática y en el retículo sarcoplásmico.
Axina y APC son scaffolds que secuestran a b-catenina
Las quinasas GSK-3b y CK1 fosforilan a β-catenina en el complejo con Axina y APC, marcándola para su
ubiquitinación y degradación en el proteosoma. El factor extracelular Wnt estimula una vía de señalización
que secuestra e inhibe a las proteínas scaffold, permitiendo la acumulación de b-catenina y su
translocación al núcleo donde se asocia a factores de transcripción LEF/TCF y regula la expresión génica.
Mol Biol Cell, 2008
UbL: Ubiquitina Ligasas
PSD-95 es un scaffold que facilita una eficiente transmisión sináptica
SV, vesículas sinápticas; VGCC, canales de calcio activados por voltaje;
NMDAR, AMPAR, mGluR, son receptores de glutamato en la postsinapsis.
La proteína scaffold PSD-95 emplea varios dominios de interacción (PDZ, SH3, GK) para anclar
y acumular receptores de neurotransmisores en los complejos post-sinápticos.
Li & Sheng, NRMCB 2003
pre-sinapsis
post-sinapsis
(espina sináptica)
SV
VGCC
anti-PSD95 y actina
Neuronas en cultivo
dendrita con spinas sinápticas
En levaduras las proteínas scaffold Ste5 y Pbs2 ensamblan
vías de señalización que controlan la respuesta al
apareamiento y al estrés hiperosmótico, respectivamente.
“Scaffolds” estabilizan complejos que activan MAPKs en vías de señalización específicas
Pawson & Nash Genes Dev 2000
Lodish et al MCB 2000
(MAPK)
En células de mamíferos las proteínas
scaffold JIP y Ksr ensamblan complejos
que activan a las MAP kinasas JNK y Erk,
respectivamente.
fosforilación de c-jun
y activación de la
respuesta al estrés.
activación por estrés (ej. ER),
citoquinas (TNF), etc.
(MAPK)
(MAPK)
MAPKKK
programa
transcripcional
que activa el
apareamimento.
programa
transcripcional
de respuesta al
estrés hiperosmótico.
MAPKK
Raf
MEK
Erk
Ksr
(MAPK)
fosforilación de Rsk
y TCF. Activación de
genes asociados a
la proliferación.
activación por factores
de crecimiento (ej. EGF).
RECEPTORES ACOPLADOS A
PROTEÍNAS G Y SUS EFECTORES
Los receptores acoplados a proteínas G constituyen la familia más numerosa de receptores, con
~ 800 genes en el genoma humano. Son activadas por moléculas diversas (péptidos, proteínas,
lípidos, aminoácidos). Comparten una estructura similar y activan una gran variedad de
proteínas G en el genoma humano, con 27 subunidades Ga, 5 Gb y 13 G.
as estimula la adenilato ciclasa
ai inhibe la adenilato ciclasa
aq activa la fosfolipasa Cb
a12/13 regula canales de Na+/K+
proteínas G heterotriméricas
subunidad a
subunidad β
subunidad
Bases estructurales del mecanismo de señalización del receptor
https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/.../2012/advanced-chemistryprize2012
Receptor β-adrenérgico inactivo (izquierda) y activo, unido al ligando (derecha). Cambios en la red de interacciones mantenida
entre hélices de trans-membrana, producidos por la unión del ligando (marrón), se propagan en cambios estructurales de
mayor magnitud en el dominio citoplasmático, exponiendo regiones hidrofóbicas que interaccionan con la proteína G.
intracelular
sitios hidrofóbicos
ligando
Proteínas G diferentes regulan la actividad de diversas proteínas efectorasy la concentración de segundos mensajeros
* A given Ga may be associated with more than one effector protein. To date, only one major Gsa has been identified, but multiple Gqa and Gia proteins have been described. In some cases (not indicated in this table) effector proteins are regulated by coincident binding to Ga and Gb.KEY: = stimulation; ? = inhibition. IP3 = inositol 1,4,5-trisphosphate; DAG = 1,2-diacylglycerol.
cAMPAdenylyl cyclase
IP3, DAGPhospholipase CGb
cGMPcGMP phosphodiesterase
Gt
Ca2+Ca2+ channel
IP3, DAGPhospholipase CGo
IP3, DAGPhospholipase CGq
Ca2+Ca2+ channel
Change in membrane potential
K+ channel
cAMPAdenylyl cyclaseGi
Change in membrane potential
Na+ channel
Ca2+Ca2+ channel
cAMPAdenylyl cyclaseGs
2nd MessengerAssociated Effector Protein
EffectGa Subclass*
* A given Ga may be associated with more than one effector protein. To date, only one major Gsa has been identified, but multiple Gqa and Gia proteins have been described. In some cases (not indicated in this table) effector proteins are regulated by coincident binding to Ga and Gb.KEY: = stimulation; ? = inhibition. IP3 = inositol 1,4,5-trisphosphate; DAG = 1,2-diacylglycerol.
cAMPAdenylyl cyclase
IP3, DAGPhospholipase CGb
cGMPcGMP phosphodiesterase
Gt
Ca2+Ca2+ channel
IP3, DAGPhospholipase CGo
IP3, DAGPhospholipase CGq
Ca2+Ca2+ channel
Change in membrane potential
K+ channel
cAMPAdenylyl cyclaseGi
Change in membrane potential
Na+ channel
Ca2+Ca2+ channel
cAMPAdenylyl cyclaseGs
2nd MessengerAssociated Effector Protein
EffectGa Subclass*
b
b
b
(activación)
(inhibición)
G subclass* Effect Effector 2nd messenger/effect
α subunit
* A given Ga may be associated with more than one effector protein. To date, only one major Gsa has been identified, but multiple Gqa and Gia proteins have been described. In some cases (not indicated in this table) effector proteins are regulated by coincident binding to Ga and Gb.KEY: = stimulation; ? = inhibition. IP3 = inositol 1,4,5-trisphosphate; DAG = 1,2-diacylglycerol.
cAMPAdenylyl cyclase
IP3, DAGPhospholipase CGb
cGMPcGMP phosphodiesterase
Gt
Ca2+Ca2+ channel
IP3, DAGPhospholipase CGo
IP3, DAGPhospholipase CGq
Ca2+Ca2+ channel
Change in membrane potential
K+ channel
cAMPAdenylyl cyclaseGi
Change in membrane potential
Na+ channel
Ca2+Ca2+ channel
cAMPAdenylyl cyclaseGs
2nd MessengerAssociated Effector Protein
EffectGa Subclass*
* A given Ga may be associated with more than one effector protein. To date, only one major Gsa has been identified, but multiple Gqa and Gia proteins have been described. In some cases (not indicated in this table) effector proteins are regulated by coincident binding to Ga and Gb.KEY: = stimulation; ? = inhibition. IP3 = inositol 1,4,5-trisphosphate; DAG = 1,2-diacylglycerol.
cAMPAdenylyl cyclase
IP3, DAGPhospholipase CGb
cGMPcGMP phosphodiesterase
Gt
Ca2+Ca2+ channel
IP3, DAGPhospholipase CGo
IP3, DAGPhospholipase CGq
Ca2+Ca2+ channel
Change in membrane potential
K+ channel
cAMPAdenylyl cyclaseGi
Change in membrane potential
Na+ channel
Ca2+Ca2+ channel
cAMPAdenylyl cyclaseGs
2nd MessengerAssociated Effector Protein
EffectGa Subclass*
K+ channels membrane potencial
Lodish et al MCB2004
La estimulación del receptor activa una proteína G específica que modula la actividad de efectores
Tipos de segundos mensajeros involucrados en señalización por GPCRs
La unión del ligando (primer mensajero) al receptor acoplado a proteínas G (GPCRs) promueve el incremento
(o disminución) en la concentración de moléculas de vida media corta denominados segundos mensajeros.
Ca 2+
activa PKA activa PKG y abre
canales catiónicos
en bastones de la retina
activa PKC abre canales de
calcio en el RE
controla la actividad
de quinasas, fosfatasas
GPCRs: G-Protein Coupled Receptors
La adenilato ciclasa es una proteína de membrana multipaso
La subunidad Gas activa la adenilato ciclasa y estimula la síntesisde cAMP a partir de ATP
síntesis del cAMP
Fosfodiesterasas específicas degradan el AMPc y
por lo tanto controlan el rango espacial y temporal de
la señalización dependiente de AMPc.
La adenil ciclasa interacciona con la alfa hélice
del switch II de la subunidad Gas-GTP.
3
5
La adenil ciclasa puede ser modulada positiva y negativamenteen la misma célula
La actividad relativa de subunidades Ga estimuladoras e inhibidoras
determinan los niveles del segundo mensajero cAMP.
Lodish et al MCB2004
Toxinas bacterianas inhiben irreversiblemente las proteínas G que activan la Adenilato Ciclasa (ej. toxina del cólera)
En células intestinales
produce una pérdida de
Na+ and Cl-
Cholera toxin
Gas
Adenilato
cyclase
cAMP
PKA
CFTR
CFTR: Cystic Fibrosis Transmembrane
Conductance Regulator
CFTR es un canal de Cl- que se expresa
en intestino y en otros órganos. La PKA
fosforila el dominio regulador (R) de CFTR
e incrementa la permeabilidad al Cl-.
Algunas respuestas mediadas por la estimulación de la subunidad Gsy el incremento en AMPc
Algunos tipos celulares desencadenan la misma respuesta al incremento de AMPc independientemente
de la naturaleza de la señal extracelular, por ej. la degradación de triglicéridoses en células adiposas es
inducida por cuatro hormonas diferentes.
El segundo mensajero cAMP activa la proteína-quinasa A (PKA)
La actividad de fosfodiesterasas que degradan el AMPc regulan negativamente la activación de PKA.
Alberts et al, BMC 2002
R
R C
C
Las subunidades reguladoras (R) inhiben a las subunidades catalíticas (C) de la enzima. Los dominios R además
interaccionan con proteínas scaffold (AKAPs), que restringen espacialmente la actividad de PKA. La unión del cAMP
(ligando activador) a las subunidades R es cooperativa e induce la disociación y activación de las subunidades catalíticas.
La PKA exhibe una respuesta hipersensible (abrupta).
AKAPs: A-Kinase Anchoring Proteins
cAMP
AMP/ATP
Hardie et al Biochem J 1999
La translocación de las subunidades catalíticas de PKA al núcleo estimulan la transcripción de múltiples genes
Los genes regulados por vías de señalización
dependiente de cAMP poseen en su promotor
un sitio CRE. PKA fosforila el factor de
transcripción CREB nuclear, promoviendo su
asociación con el coactivador CBP/P300 y la
regulación de la expresión de genes blanco
(ej. somatostatina, glucagón, insulina, etc).
CREB es defosforilado por la fosfatasa PP-1.
CRE: c-AMP Response Element
CREB: CRE Binding
CBP: CREB Binding Protein Lodish et al MCB2004
La subunidad C activa es pequeña y se
transloca al núcleo por difusión. La actividad
de PKA en el núcleo finaliza por la unión de
un inhibidor que la exporta al citosol.
Cinética de la activación transcripcional
CREB
dephosphorylation
En el citosol, la PKA regula diferentes procesos bioquímicos(ej. catabolismo del glucógeno en hepatocitos y miocitos)
active
activeglicógeno
sintasa inactive
Lodish et al MCB2004
glucagón
GCPR
AC
cAMP
PKA
El glucagón es una hormona peptídica
secretada por el páncreas que promueve
el incremento de glucosa sanguínea
oponiéndose al efecto de la insulina.
La vía de señalización AC-cAMP-PKA amplifica la señal extracelular inicial en varios órdenes de magnitud
Lodish et al MCB2004
(adrenalina)
Respuesta celular del biosensor. La droga (Fsk) activa la vía adenil ciclasa cAMP PKA.
Esta activación es abolida cuando la serina del substrato de PKA se reemplaza por alanina (S475A).
La activación de la PKA puede visualizarse en la célula viva mediante FRET
Zhang et al PNAS 2001
El biosensor de FRET consta de la YFP,
un péptido substrato de la PKA, un dominio de
unión al substrato fosforilado en serina (14-3-3),
y la CFP. Para medir FRET, las células se
iluminan con luz que excita a la CFP (433 nm) y
se registra la emisión de luz de la YFP (527 nm).
FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer
escala que representa
los valores de FRET
con diferentes colores.
excitación
433 nm emisiónemisión
FRETno FRET
S
Arg/Lys-rich site
emission
476 nm
excitación
433 nm
PKA
La PKA fosforila residuos Ser/Thr dentro de la
secuencia consenso: X-Arg-(Arg/Lys)-X-(Ser/Thr)-F.
Las AKAPs (A-kinase anchoring proteins) son una familia de proteínas “scaffold” que anclan la PKA a
subcompartimientos celulares específicos, restringiendo espacialmente la actividad de la enzima. La
concentración de cAMP y la activación de PKA es limitada por la acción de fosfodiesterasas (PDE).
La actividad de PKA es restringida espacialmente por proteínas “scaffold” denominadas AKAPs
Representación de un complejo de señalización
formado por una AKAP típica. Una región de la
AKAP (1) interacciona con las subunidades
R de la PKA, otro dominio (2) retiene
el complejo a una estructura citoplasmática
específica (ej. centrosoma, membrana del Golgi,
etc) y otros sitios (3) se asocian con fosfatasas
o kinasas implicadas en la vía de señalización.
AKAP asociada a membranas de endosomas y Golgi
La subunidad Gaq activa la enzima fosfolipasa C, isoforma b, que hidroliza el PIP2 y produce los mensajeros secundarios IP3 y DAG
Marchant & Taylor, CB 1997; Alberts et al, BMC 2008
IP3: Inositol 1,4,5-triphosphate
DAG: diacyl glycerol
La estimulación de los receptores de IP3
exhibe una respuesta ultrasensible.
antagonista
Reacción catalizada por la enzima PLCb y
Alberts et al, BMC 2002
1 4
5
PLC
La fosfolipasa C se asocia a membrana plasmática mediante dominios de unión a lípidos como PH y C2. La isoforma
de la PLC se asocia a receptores tirosina-quinasa de transmembrana activos (ej. EGFR) mediante dominios SH2.
La PLCb/ cataliza la hidrólisis de PIP2 produciendo IP3 y DAG.
El DAG y el calcio son requeridos para activar la PKC
El dominio C2 de la PKC requiere de calcio para su interacción con los fosfolípidos de la membrana.
En la membrana los dominios C1 de PKC interaccionan con el DAG causando un cambio
conformacional que desplaza el pseudo-substrato inhibidor del sitio catalítico y activa la enzima.
Existen numerosas isoformas de PKC implicadas en la regulación de diversos procesos celulares. La PKC
fosforila e inhibe receptores acoplados a proteínas G, al EGFR, otras isoformas activan la vía de la MAPK, etc.
catalytic site
dominio C2
Ca2+
Mecanismos de retroalimentación positiva y negativa generan fluctuaciones de Ca2+ en el citoplasma
Dubicella et al Sem CellDevBiol 2006; Alberts et al, BMC 2006
La fertilización del ovocito
por el espermatozoide
activa la vía de
PLC->IP3->Ca+2
El incremento de Ca2+ en el citosol induce
la apertura de más canales de Ca+2 en el
ER (retroalimentación positiva).
Superado un umbral de concentración de
Ca2+ en el citosol se induce el cierre de
canales de Ca+2 en el ER
(retroalimentación negativa).
El Ca2+ regula la apertura
de los canales
dependientes de IP3 de
manera bifásica, niveles
bajos promueven la
apertura mientras que
niveles altos la inhiben
probablemente por unión
del calcio a sitios de baja
afinidad.
5 15 25 35minutos
El incremento en los niveles de calcio citosólico inducido por señalización es rápidamente revertido
La concentración basal de Ca2+ en el citosol es ~200 nM debido a la actividad de
proteínas transportadoras de calcio de la membrana plasmática, RE y mitocondrias.
Alberts et al MBC 2008
medio extracelular
citosol citosol
Las variaciones espacio-temporales de la concentración de calcio intracelular pueden visualizarse en células vivas
Biochemistry, Berg, Tymoczko, Stryer,
MBC 2008
La secuencia muestra la propagación de un pico de calcio intracelular en
respuesta a la estimulación de receptores acoplados a proteínas Gaq. Los
máximos niveles de calcio se muestran en anaranjado y los mínimos en azul.
El compuesto fluorescente Fura-2 permite
determinar los niveles de calcio intracelular.
La unión a Ca2+ incrementa la excitación de
la molécula a 340 nm. El gráfico muestra el
incremento de la fluorescencia de excitación
en el rango de Ca2+ entre 0 y 1,35 mM.
Gradiente de concentración de calcio
(rojo max., azul mín) en dendritas de
una neurona de Purkinje estimulada.
axón
soma
dendritas
Vasopresina induce patrones de
oscilación de Ca2+ en hepatocitos. La
frecuencia de picos es proporcional a
la concentración de hormona.
espectro de excitación de Fura-2
Flu
ore
sc
en
ce
Calmodulina es una proteína citosólica reguladora activada por calcio
El aumento de Ca2+ >500 nM induce su unión cooperativa a calmodulina, 4 iones Ca2+ se unen por molécula
de calmodulina e inducen la conformación activa que le permite interaccionar y activar diversas enzimas.
calmodulina
Varias enzimas son activadas por complejos calmodulina-calcio. Ej:
- MLCK MLC contracción actino-miosina
- fosforilasa kinasa glucogenólisis
-CaM-KII tyrosine hydroxylase catecolaminas (Adrenalina, DA, etc)
- cAMP fosfodiesterasa 5´- AMP
- Ca2+ -ATPasa disminución del Ca2+ citosólico
- calcineurina NFAT (Nuclear Factor Activated in T cells)
- NO sintasa NO (nitric oxide)
La activación inicial de CaM-KII
depende de Ca2+/calmodulina.
Una vez activa se autofosforila
y activa otras moléculas en un
proceso que ya no depende de
Ca2+/calmodulina .
(retroalimentación positiva)
autofosforilación
activación de
CaM-KII
Ca2+/calmodulina estimula la NO sintasa y la producción de NO
El óxido nítrico (NO) es un gas que actúa como mediador local (acción paracrina).
Difunde a través de la membrana y se une y activa proteínas receptoras intracelulares
con actividad de guanilato ciclasa. El cGMP formado activa la PKG y esta inhibe la
interacción actina-miosina promoviendo la relajación de la célula muscular lisa.
Lodish et al MCB2004
La subunidad Gat activa una fosfodiesterasa de cGMP en fotoreceptores
Transducina o Gat participa del mecanismo de transducción de la señal lumínica en bastones y conos de la retina.
Lodish et al MCB
En obscuridad, cGMP abre canales catiónicos
produciendo la depolarización de la membrana
y la generación de una corriente. La activación
de rodopsina induce la degradación del cGMP,
el cierre de los canales catiónicos y la
hiperpolarización de la membrana.
Gat
rodopsin
(opsin + retinal)
Na+
Na+
dark current
hiperpolarización
trans-retinal
cis-retinal
cromóforo
eventos 2 y 4 amplifican la propagación de la señal.
(glutamate)
Las subunidades Gb regulan canales de potasio en el músculo cardíaco
La acetilcolina se une a receptores muscarínicos, los cuales activan una proteína G. En células de
músculo cardíaco el complejo Gβ se une y regula la apertura de canales de potasio provocando la
hiperpolarización de la membrana plasmática y la relajación de la célula.
Lodish et al MCB2004
A. músculo cardíaco
Relajación
hiperpolarización
hiperpolarización
Las arrestinas y las proteínas RGS regulan la sensibilidad de los receptores acoplados a proteínas G
GPCR: G-Protein Coupled Receptors
GRK: GPCR-coupled Receptor Kinases
Los GPCRs pueden desensibilizarse por:
• fosforilación (PKA, PKC, GRK) reversible
• internalización (b-arrestinas) reversible
• degradación en lisosomas irreversible
Las arrestinas se unen a los
receptores fosforilados por
GRKs y bloquean la asociación
y activación de la proteína G.
Otros mecanismos que terminan la señalización iniciada por las proteínas G son: la hidrólisis del GTP en la proteína G, evento
que es acelerado por los mismos efectores o por proteínas RGS (Regulator of G protein Signaling) que actúan como GAPs.
GRKs son quinasas que interaccionan con GPCR activos. Producto
de la interacción se activan y fosforilan a los GPCRs activos. Los
receptores también pueden ser fosforilados por otras quinasas
como PKA y PKC en condiciones de estimulación prolongada.
Las Beta arrestinas son proteínas scaffold que facilitan el ensamble de componentes involucrados en la endocitosis y señalización
Las b-arrestinas interaccionan con AP2 y clatrina promoviendo la endocitosis y la disminución del
número de receptores en la superficie. Los receptores internalizados pueden ser defosforilados y
reciclados a la superficie o degradados en los lisosomas. Algunos receptores endocitados unidos a
arrestinas activan vías de señalización dependientes de quinasas citosólicas como Src y JNK.
Lodish et al MCB2004
RECEPTORES ASOCIADOS A
QUINASAS CITOSÓLICAS
receptores de citoquinas (interferón, eritropoietina, interleukinas)
receptores de adhesión (caderinas, integrinas, CAMs)
receptores de células T (TCR)
Receptores de citoquinas activan tirosina-quinasas citosólicas: JAK
JAK: JAnus Kinase o Just Another KinaseLodish et al MCB2004
(Ej. EpoR, prolactin R)
citoquinas: son una familia de proteínas extracelulares que regulan el crecimiento y
diferenciación de tipos celulares específicos, particularmente del sistema hematopoyético
e inmune. Ej. Eritropoietina maduración de eritrocitos; IL2 proliferación de células T.
Las JAKs constituyen una familia de tirosina quinasas citosólicas asociadas constitutivamente a receptores de citoquinas (1).
En ausencia de estimulación JAK es inactiva. La estimulación de los receptores induce cambios conformacionales en los
segmentos citoplasmáticos que favorecen la autofosforilación y activación de la JAK asociada (2), la cual fosforila tirosinas en
el dominio citosólico del receptor (3).
inactive active JAK
Lodish et al MCB2004
Las STATs permanecen latentes en el citosol hasta su
activación, la cual ocurre cuando se unen al receptor
fosforilado, a través de su dominio SH2, y son
fosforiladas por JAK. STATs fosforiladas se disocian
del receptor, y dimerizan mediante interacciones SH2-
fosfotirosina recíprocas. Los dímeros STATs exponen
NLS y se translocan al núcleo donde activan la
transcripción de numerosos genes blanco.
STAT: Signal Transducers and Activators of Transcription
JAKs fosforilan a los factores de transcripción STATs
Lodish et al MCB2004
La estimulación de receptores de citoquinas activavarias vías de señalización paralelas
La estimulación de varios receptores de citoquinas, incluído el de eritropoyetina (EpoR) activa vías de
señalización paralelas que regulan la transcripción de diferentes grupos de genes. La consecuencia de
la señalización de EpoR es la amplificación y diferenciación de precursores de eritrocitos.
(adaptadores)
(F. de transcripción)
(enzima)
(enzima)
Todas estas proteínas se asocian
al receptor fosforilado en tirosina
mediante sus dominios SH2
FOXOAkt
FOXO: Forkhead Box O, transcription factor
Transcription of genes
that inhibit survival,
proliferation and growth.
Fosfatasas y SOCS terminan la señalización de citoquinas
Mecanismos rápidos (defosforilación) y lentos (síntesis de SOCS) controlan
la duración de la señalización intracelular inducida por citoquinas.
Dentro del repertorio de genes blanco activados por
STATs están los que codifican para proteínas SOCS.
Mediante dominios SH2 las proteínas SOCS se unen
a las JAKs y a receptores fosforilados. Las proteínas
SOCS interaccionan con E3 ubiquitina ligasas y
promueven la ubiquitinación y degradación de JAKs y
los receptores en los proteosomas.
SHP1 es una fosfatasa de tirosina que en condiciones
basales está autoinhibida en el citosol. Interacciona con
el receptor fosforilado mediante dominios SH2, evento
que induce su activación y defosforilación de JAK. Otras
fosfatasas también defosforilan a JAK y STATs.
SOCS: Suppresor Of Cytokine Signaling Lodish et al MCB2004
integrinasEGFR
Src/FAK
Rho/Rac/Cdc42
GTPasas
citoesqueleto
de actina
Grb2
Ras
Erk
ciclinas D, c-myc
pax/p130Cas
Src y FAK se autofosforilan y activan en
respuesta a la estimulación y agregación
de integrinas. Src y FAK fosforilan
adaptadores que propagan la señal por
vías que promueven: 1) proliferación a
través de la vía de Ras y MAPK; 2)
inhiben la apoptosis a través de la vía de
PI3K y AKT; y 3) promueven la migración
celular a través de la activación de rho
GTPasas (rho, rac y Cdc42). La
señalización de integrinas sinergiza con
la de ciertos receptores de factores de
crecimiento, por ej. el EGFR.
Receptores de adhesión activan tirosina-quinasas citosólicas
PI-3K
Akt
Varias fosfatasas (PTPs), ej.
SHP2 defosforilan e inactivan
a Src y FAK, respectivamente.
PTPs
SH2SH3
SH2
SH2/3
La estimulación de FcR y TCR en el sistema inmune induce la activación de tirosina quinasas
La estimulación de los receptores de Fc (FcR) en mastocitos y de los TCR en células T induce su partición en
rafts lipídicos (1) y su fosforilación por tirosina-quinasas de la familia de Src (Lyn, Lck, Fyn) (2), Syk y
ZAP70 (3). Todas estas quinasas poseen dominios SH2 que reconocen secuencias fosforiladas (ITAM:
Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) y contribuyen a la propagación de la señal intracelular.
Simons & Toomre, NRMCB2000
↑PLC ↑Ca2+ histamine secretion
PLC
SH2pY
PLC
SH2pY
T cell
↑PLC ↑Ca2+ Calcineurin NFAT
DAG GEF Ras-MAPK AP-1
PKC NF-B
RECEPTORES CON ACTIVIDAD
ENZIMATICA INTRINSECA
receptores con actividad de tirosina quinasa (ej. EGF, NGF, Ephr)
receptores con actividad de Ser/Thr quinasa (ej. TGFb)
Los receptores con actividad de quinasa tienen un dominio extracelular que une
el ligando y un dominio intracelular con actividad catalítica. Los ligandos son
péptidos o proteínas solubles o asociados a la membrana plasmática.
Hunter, Nature 2001
El genoma humano codifica para ~ 60 receptores de transmembrana con actividad tirosina-quinasa distintos, agrupados en 20 familias
La unión del ligando al dominio extracelular induce la activación yautofosforilación del dominio tirosina-quinasa citosólico
Lodish et al MCB2004
Los receptores no estimulados poseen una actividad de tirosina-quinasa basal (1). La unión del ligando provoca la
dimerización y autofosforilación del receptor (2), eventos que activan el dominio catalítico y promueven la fosforilación de
varias tirosinas del dominio citosólico, generando sitios de unión para proteínas de señalización con dominios SH2 o PTB (3).
K
Mg ++
fosforilación de
tirosinas adicionales
dimerización y auto-
fosforilación de Tyr
del dominio catalítico
La activación del dominio catalítico
involucra cambios conformacionales que
promueven la unión del ATP y del substrato
aceptor del fosfato (Helix C, activation loop).
dominio
catalítico
El receptor activo es autofosforilado en varios sitios
El EGFR fosforilado en tirosina (pY) induce el reclutamiento de varias moléculas de señalización
del citoplasma y que contienen dominios SH2 y/o PTB. Por ejemplo, la fosfolipasa C, la
tirosina quinasa Abl, las proteínas adaptadoras Grb2 y Shc, y la ubiquitina ligasa Cbl.
membrana
dominio
extracelulardominio intracelular
EGFR
992 1068 1086 11731148
pY
PLC PLCGrb2 Grb2 Shc
1045
pY pYpY pY pYdominio
catalítico
pY
Cbl
Abl
Kholodenko et al J. Biol Chem 1999, Kovacs et al ARB 2015
Time (min)1 20
cinética de activación
del EGFR
Fosfatasas defosforilan y inactivan el receptor
membrana
EGFR
dominio
extracelular dominio intracelular
PTPs
Diferentes proteína tirosina-fosfatasas (PTPs) son reclutadas al receptor
fosforilado mediante dominios de interacción proteína-proteína específicos.
992 1068 1086 11731148
pY
1045
pY pYpY pY pYdominio
catalítico
pY
La endocitosis es un mecanismo de desensibilización de los receptores tirosina quinasas
En ausencia de ligando, el EGFR se endocita con una cinética 5-10 veces más lenta que cuando está unido
al EGF (ligando). Aproximadamente un 50% del complejo EGF-EGFR endocitado es derivado a lisosomas.
Cbl es una ubiquitina ligasa que agrega
una ubiquitina al EGFR endocitado
(monoubiquitinación), marcándolo para
su degradación en lisosomas. Este
mecanismo disminuye transitoriamente
la capacidad de las células para
responder al estímulo extracelular.
reciclado
degradación
Algunos RTK señalizan a través de la PLC
Cooper, Biol Cel. 2002
La fosfolipasa C se une varios RTKs fosforilados (ej. EGFR, PDGFR) mediante dominios SH2. El
receptor activo fosforila y activa la PLC promoviendo la síntesis de los segundos mensajeros IP3 y DAG
a partir de PIP2. El aumento de Ca2+ citosólico y el DAG activan la PKC, y el Ca2+ activa la calmodulina.
Estructura modular de la PLC
↑Ca2+
↑PKC
↑calmodulina
La PLC se encuentra
autoinhibida en el citosol. La
activación depende de su
relocalización a la
membrana, su fosforilación y
cambios conformacionales.
Varias RTKs activan la vía de PI3K
dominios
PH
PIPK PIPK
3 3 3
membrana
plasmática
En estado basal la PI3K se
encuentra autoinhibida en el
citosol. La interacción de los
dominios SH2 de la subunidad
reguladora p85 con receptores o
adaptadores fosforilados en la
membrana activan de manera
alostérica la enzima.
Las enzimas PI3K son heterodímeros compuestos por una subunidad reguladora (p85) unida no
covalentemente a una subunidad catalítica (p110). Genera fosfoinosítidos fosforilados en posición 3.
PI3K: Phospho Inositide 3-Kinase
Estructura modular
Los productos de PI3K son requeridos para activar Ser/Thr quinasas citosólicas
Akt (=PKB) es una Ser/Thr quinasa citosólica que en estado basal adopta una conformación inactiva,
estabilizada por la interacción del dominio PH con residuos del dominio catalítico. La síntesis de PIP3s
por PI3K promueve el reclutamiento y anclaje a la membrana de PKB y PDK1, mediado por sus
respectivos dominios PH. La interacción con la membrana induce cambios conformacionales en Akt que
sumados a la fosforilación por PDK1activan a la enzima. PTEN es una fosfatasa específica para PIP3s.
Lodish et al MCB2004
PTEN: Phosphatase and TENsin homologue
PI3K: Phosphoinositide-3 kinase
PDK1: Phoshoinositide-Dependent Kinase-1
PKB/Akt: Protein Kinase B/producto del oncogen v-akt
PH PH PHPI-3K PTEN
La vía de señalización de PI3K-AKT regula varios procesos
La activación de la vía PI-3K Akt promueve el crecimiento y supervivencia celular. La fosfatasa PTEN antagoniza el efecto de
PI3K y defosforila los lípidos fosforilados (PIP3s) productos de PI3K. Por lo tanto la actividad de PTEN inhibe la activación de Akt.
PTEN: Phosphatase and TENsin homologue
mTOR: Ser/Thr kinasa
Tsc: GAP de Rheb
Rheb: GTPasa activadora de mTOR
PI-3K: Phosphoinositide-3 kinase
PDK1: Phoshoinositide-Dependent Kinase-1
PKB/Akt: Protein Kinase B/producto del oncogen v-akt
BAD y BIM: SH3 only proteins (proapoptóticas) Alberts et al MBC 2000
Bcl2
Bcl2
PTEN(fosfatasa)
mutaciones de PTEN
promueven el desarrollo
de cáncer
Bcl2
PH PH
Cell
growth
active Akt
FOXO Activación de apoptosis
vía expresión de genes pro-
apoptóticos (ej. FasLR, BIM, etc)
inactivación de
proteínas proapoptóticas
mTOR es una Ser/Thr quinasa que promueve supervivencia y crecimiento
mTOR forma 2 complejos multiproteicos, mTORC1 y mTORC2,
los cuales integran señalización de diferentes procesos o “inputs”.
Laplante & Sabatini, Cell 2012
(↑Akt FOXO)
(Rho/Rac activity)
(S6K, eIF4
↑síntesis de
proteínas)
Por ejemplo, quinasas activadas por receptores de factores de crecimiento,
convergen en la activación de la GTPasa Rheb, la cual a su vez activa el
complejo mTORC1. La activación de los complejos mTORC1 y 2 regula la
función de numerosos substratos involucrados en el crecimiento y
supervivencia celular.
RTKs estimulan proliferación a través de adaptadores que conectan con la vía de Ras-Erk
Lodish et al MCB2004
La unión del ligando provoca la
dimerización y autofosforilación
de los receptores.
La unión de Grb2
al receptor activo
recluta a Sos a la
membrana.
Sos promueve el intercambio del
GDP por GTP en Ras.
Ras-GTP activo se disocia de Sos.
MAP quinasa
La GTPasa Ras es activada en la membrana plasmática
Ras es modificada post-traducción por el agregado de ácidos grasos que la anclan a la membrana
plasmática. Mutantes de Ras en las cisteínas modificadas son incapaces de activar al efector Raf.
Esto es en parte porque los GEFs de Ras activan a Ras en la membrana plasmática.
membrane
cytosol
Raf
cinética de activación de Ras
estimulando las células con EGF.
adaptado de Bidkhori et al PlosOne2012
10 20 30
Ras-G
TP
co
nce
ntr
atio
n
Time (min)
Ras activa una cascada de quinasas que incluye la MAP kinasa Erk
En organismos multicelulares existen 3 subfamilias de MAPKs
que son activadas por una cascada de quinasas:
- Erk ("Extracellular regulated kinases")
- JNK ("c-Jun N-terminus kinase")
- p38
Lodish et al MCB2004
1. En estado basal Ras asociada a la membrana es inactiva. La quinasa Raf
existe en una conformación inactiva en el citosol y no interacciona con Ras.
2. Raf se une a Ras-GTP en la membrana. Cambios conformacionales,
fosforilación y defosforilación de Raf activan la quinasa.
3. Raf fosforila y activa a la quinasa MEK.
4. MEK es una quinasa dual que fosforila y activa a la MAPK Erk.
GEF
La activación de la MAP quinasa requiere de la fosforilación dual de una treonina y una tirosina en el segmento activador
cinética de activación de Erk
estimulando las células con EGF.
adaptado de Bidkhori et al PlosOne2012
10 20 30Time (min)
40
Activity
Lodish et al MCB2004
N lobe
C lobe
activation
segment
segment
La fosforilación induce movimientos de los
lóbulos N y C, alineamiento de los residuos
catalíticos en posición óptima para la unión
del ATP y del substrato aceptor.
En levaduras las proteínas adaptadoras Ste5 y Pbs2 organizan vías
de señalización en respuesta a estímulos diferentes. Ste5 recluta una
combinación de proteínas involucradas en la respuesta de apareamiento
mientras que Pbs2 desencadena la respuesta al estrés hiperosmótico.
La localización y activación de MAP kinasas específicas depende de proteínas scaffold
Pawson & Nash Genes Dev 2000
Lodish et al MCB 2000
(MAPK)
En células de mamíferos las proteínas
adaptadoras JIP1 y Ksr coordinan la activación
de la MAP kinasa JNK y Erk, respectivamente.
fosforilación de c-jun
y activación de la
respuesta al estrés.
activación por estrés (ej. ER),
citoquinas (TNF), etc.
(MAPK)
(MAPK)
MAPKKK
programa
transcripcional
que activa el
apareamimento.
programa
transcripcional
de respuesta al
estrés hiperosmótico.
MAPKK
Raf
MEK
Erk
Ksr
(MAPK)
fosforilación de Rsk
y TCF. Activación de
la proliferación.
activación por factores
de crecimiento (ej. EGF).
Las MAPK activas fosforilan substratos en el citosol y en
el núcleo. Varios de los substratos nucleares son factores
de transcripción, por ej. TCF y SRF promoviendo la
formación de complejos triméricos que se unen a
secuencias promotoras y estimulan la expresión de genes
de expresión temprana como por ej. c-Fos y c-Jun.
MAPK activa se transloca al núcleo y fosforila factores de transcripción
TCF: Ternary Complex Factor
SRF: Serum Response Factor
La regulación extracelular de diferentes procesos fundamentales enS. cerevisiae es mediada por la activación de distintas MAP kinasas
Alberts et al MBC 2002
El NGF promueve la supervivencia
y el crecimiento axonal (diferenciación)
en neuronas simpáticas.
NGF: Nerve Growth Factor
LRD: Leucine Rich domain
Efrinas (ephrins) en la membrana de células gliales activan sus receptores
Eph (RTK) en axones y contribuyen a la conectividad del sistema nervioso.
Por ej. en el mapa retino-tectal del sistema visual axones de neuronas
nasales de la retina se conectan con neuronas del tectum posterior en el
cerebro y neuronas de la retina temporal con neuronas del tectum anterior.
RTKs decodifican señales inductoras de crecimiento, diferenciación y guía
+ NGF
- NGF
NGFR
EphR
PTK domain
nasal
temporal
posterior
anterior
tectum
nasal
temporal
Experimento in vitro que muestra la selectividad de crecimiento de los axones
de diferentes regiones de la retina sobre membranas del tectum. Se
generaron bandas o calles con fracciones de membranas del tectum posterior
(P) y anterior (A). Sobre estos substratos se sembraron neuronas de la retina
temporal (a la izquierda) y neuronas de la retina nasal (a la derecha).
La unión de ciertas efrinas a sus
receptores Eph activa un GEF de la
GTPAsa Rho. Rho activa promueve
la contracción de actina-miosina y el
colapso del cono de crecimiento.
Eph decodifican señales o moléculas guía durante la conectividad neuronal
Ephexin es un
GEF de RhoA
neuronas temporales neuronas nasales
Saltiel & Kahn Nature 2001
Los RTK usualmente activan diversas vías de señalización paralelas
IRS: Insulin Receptor Substrate
proliferation
El receptor de insulina es un RTK que se autofosforila en respuesta a la estimulación con insulina. Posteriormente, diversas
proteínas adaptadoras con dominios SH2 y PTB, como CAP, IRS y Grb2, a su vez reclutan y activan componentes de diferentes
vías relacionadas a distintas respuestas biológicas (internalización de glucosa y metabolismo, crecimiento celular y proliferación.
Alberts et al MBC 2008, modific
Quinasas y GTPasas integran señales de distintos receptores
proliferación, apoptosis, diferenciación, metabolismo, motilidad, etc
PD: phosphodiesterase
PD
FAK
Src
ECM
integrins
Rho/Rac
MLCK
Los receptores de TGF-b poseen un dominio de Ser/Thr-kinasaen su dominio intracelular
TGF: Transforming Growth Factor; SARA: Smad Anchor for Receptor Activation
TGF-β es una familia de ~ 40 proteínas
diméricas secretadas, que actúan generalmente
de manera parácrina, y regulan proliferación,
apoptosis y diferenciación. La unión de TGF-b a
los receptores RI y RII induce la fosforilación y
activación de RI por RII. RI activo une y fosforila
factores de transcripción inactivos asociados a
la membrana denominados R-Smads 2 y 3. Los
R-Smads fosforilados se disocian de los
receptores, forman complejos con Co-Smads
(ej. Smad4) y se translocan al núcleo donde
junto a factores de transcripción adicionales
regulan la transcripción de genes blanco.
Alberts MBC, 2008
La proteína “scaffold” SARA asociada a la
membrana plasmática interacciona con los
receptores y las R-Smad, facilitando la
fosforilación de las R-Smad.
MH2
MH1
Expresión de genes anti-proliferativos (inhibidores de
proteasas, inhibidores de Cdks como p21, p27. p57),
supresión de c-myc.
SARA
Las flechas naranjas indican la
activación del receptor. Los
complejos de TGF-β/RI/RII activos
se endocitan por 2 vías, una
dependiente de clatrina (en verde)
que facilita la translocación nuclear
de R-Smad, y otra dependiente de
caveolina (marrón) que promueve
la ubiquitinación y degradación.
Las flechas violetas indican
transporte nucleo-citoplasmático.
Los grupos fosfatos y la ubiquitina
se representan por círculos verdes
y rojos, respectivamente.
Flujos de componentes de señalización de la vía de TGF-b
Genes activados por Smads codifican para Smads inhibidoras o I-Smads. Las I-Smads compiten
con las R-Smads por la unión al receptor activo, interaccionan con factores de ubiquitinación
Smurf, promoviendo la degradación de receptores y Smads en proteosomas, y también reclutan
fosfatasas que defosforilan a los receptores y Smads.
Smurf: Smad ubiquitination regulatory factors)
Ciertos receptores modulan la proteólisis regulada de inhibidores citoplasmáticos.
El NF-B es un factor de transcripción heterodimérico expresado en la mayoría de las células y que en condiciones
basales es secuestrado en el citosol por el inhibidor I-Ba. Citoquinas inflamatorias como el TNFa e interleukina-1
estimulan receptores que activan una cascada de quinasas citosólicas (TAK1 IKK) que fosforilan al inhibidor I-Ba
en sitios (fosfodegrones) reconocidos por E3 ubiquitina ligasas que lo marcan para su degradación en proteasomas. El
NF-B libre expone una NLS que le permite translocarse al núcleo y regular numerosos genes.
Lodish et al MCB2004
(IKK)
El inhibidor I-Ba
enmascara una
NLS en NF-B.
TAK1: TGFβ-Activating Kinase-1
Ghosh & Hayden, Immunol Rev 2012
Los factores NF-B son reguladores centrales de respuestas transcripcionales a una gran variedad de estímulos
La vía de señalización de Wnt inhibe la proteólisis de b-catenina
En ausencia de estimulación b-catenina es reclutada a un complejo con axina y APC donde es fosforilada por las quinasas
casein kinasa I y GSK-3b. El residuo fosforilado es reconocido por una E3 ubiquitina ligasa que marca la b-catenina para su
degradación en el proteosoma. El factor extracelular Wnt estimula al receptor frizzled (B), y activa una vía que inhibe la
formación del complejo, permitiendo la acumulación de b-catenina en el citosol y su translocación al núcleo donde regula la
expresión de numerosos genes involucrados en proliferación y diferenciación.
El co-receptor LRP forma un complejo con
Wnt/Frizzled y recluta a CK1 y GSK3. La
fosforilación de LRP es requerida para
reclutar las proteínas “scaffold”
Dishevelled, axin y APC y su inactivación.
Delta-Notch regulan diferenciación neural
Notch y Delta son proteínas de transmembrana involucradas en un mecanismo de diferenciación celular denominado
“inhibición lateral”. En Drosophila este mecanismo controla la diferenciación de neuronas sensoriales en la epidermis. La
expresión del ligando Delta en la superficie de precursores neuronales se une al receptor Notch en las células adyacentes,
induciendo la proteólisis de Notch y la generación de un fragmento intracelular que se transloca al núcleo e inactiva la
expresión de genes proneurales y promueve la diferenciación epitelial.
Lodish et al MCB2004; MBC Alberts et al 2002
Parte del tórax de Drosophila mostrando
un grupo de células mutantes con Delta
inactivado. Por lo tanto la inhibición
lateral no ocurre y todas las células
del grupo se diferencian en neuronas
sensoriales.
no diferenciado diferenciado
Sistema de señalización en plantas Respuesta al etileno
El etileno es un gas que actúa como un importante factor regulador del crecimiento y mecanismo de defensa en plantas. Los
receptores de etileno son proteínas de transmembrana localizadas en el retículo endoplásmico. En ausencia de etileno los
dominios citosólicos de los receptores interaccionan y activan una quinasa de Ser/Thr denominada CTR. CTR fosforila y promueve
la degradación de factores de transcripción (EIN) que activan la respuesta transcripcional al etileno. La unión del etileno al receptor
inhibe la activación de CTR, lo cual permite que los factores EIN se acumulen y regulen la expresión/represión de cientos de genes
controlados por etileno. La deleción de EIN produce un fenotipo insensible al etileno (Ethylene Insensitive).
Triple respuesta mediada por el etileno
en el crecimiento de plántulas. La
obstrucción (barra amarilla) induce la
generación de etileno el cual estimula
el 1) acortamiento, 2) engrosamiento, y
3) curvatura del tallo o raíz, protegiendo
el tejido de crecimiento apical.
Los receptores regulan
negativamente la vía de
señalización
CTR: Constitutive Triple Response
EIN: Ethylene INsensitive
Sistema de señalización por auxinas
auxina: ácido indolacético
ARF: Auxin Response Factor
Auxina es una hormona que promueve la
elongación de las células vegetales. En ausencia
de auxina el factor de transcripción ARF es
inhibido por proteínas represoras (Aux/IAA) que
suprimen su actividad. La auxina interacciona con
receptores nucleares que inducen la degradación
del represor en proteosomas.
Los fitocromos son Ser/Thr-kinasas diméricas que se activan con luz
roja (650-670nm) y se inactivan con luz roja lejana (705-740 nm). La
activación resulta de su autofosforilación. Los fitocromos activos se
translocan al núcleo donde interaccionan con proteínas reguladoras de la
transcripción. Los criptocromos y fototropinas son otros fotosensores
proteicos que responden a la luz azul (320-500 nm).
Los fitocromos median el crecimiento y desarrollo
de las plantas en respuesta a luz roja.
Las fototropinas regulan el fototropismo, apertura
de estomas y localización de cloroplastos. Son
Ser/Thr kinasas asociadas a membranas, los
dominios LOV sensan la luz a través de flavin
mononucleótidos (FMN). La absorción de luz induce
cambios conformacionales que activan la kinasa.
Kimura & Kagawa, COPB 2006
Sistema de señalización en plantas Sensado de luz