reazione di polimerizzazione a catena del dna (pcr)€¦ · reazione di polimerizzazione a catena...
TRANSCRIPT
![Page 1: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/1.jpg)
Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)
![Page 2: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/2.jpg)
Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione
![Page 3: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/3.jpg)
AGGCATTCCA
CACGTTGAGTC 3’
5’
5’
3’
Supponiamo di voler amplificare una specifica regione del DNA
Si puo’ fare con la PCR
![Page 4: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/4.jpg)
AGGCATTCCA
CACGTTGAGTC 3’
5’
5’
3’
Supponiamo di voler amplificare una specifica regione del DNA
È necessario conoscere la sequenza nucleotidica della regione da amplificare
Sintesi dei primers
![Page 5: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/5.jpg)
AGGCATTCCA
CACGTTGAGTC 3’
5’
5’
3’
Supponiamo di voler amplificare una specifica regione di DNA
È necessario conoscere la sequenza nucleotidica della regione da amplificare
Sintesi dei primers
5’-TCCGTAAGGT-3’
3’-GTGCAACTCAG-5’
![Page 6: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/6.jpg)
Le 3 fasi della PCR
1. Denaturazione2.Annealing dei primers3.Elongazione
Ciclo di PCR
![Page 7: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/7.jpg)
I protagonisti della PCR
-DNA da amplificare
- primers (devono avere una lunghezza di circa 21nucleotidi)
-Taq polimerasi è una DNA polimerasi, provenientedall'organismo termofilo Thermus aquaticus. Ha unatemperatura ottimale di 75-80 °C.
![Page 8: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/8.jpg)
AGGCATTCCA
CACGTTGAGTC 3’
5’
5’
3’
1.Denaturazione
90°C
i 2 filamenti del DNA si separano
![Page 9: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/9.jpg)
2. Annealing
50°C – 62°C
AGGCATTCCA
CACGTTGAGTC3’
5’
5’
3’
TCCGTAAGGT
GTGCAACTCAG
5’
5’
Ogni primer si lega alla regione complementare del DNA
![Page 10: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/10.jpg)
Elongazione
72°C
la Taq polimerasi sintetizza il nuovo filamento a partiredal primer
AGGCATTCCA
CACGTTGAGTC3’
5’
5’
3’
TCCGTAAGGT
GTGCAACTCAG
5’
5’
Fine del primo ciclo di PCR
![Page 11: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/11.jpg)
AGGCATTCCA
CACGTTGAGTC
5’
5’
3’
1. Denaturazione
TCCGTAAGGT
GTGCAACTCAG
5’
5’
CACGTTGAGTC
AGGCATTCCA
2° ciclo di PCR
![Page 12: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/12.jpg)
AGGCATTCCA
CACGTTGAGTC
5’
5’
3’
2. Annealing
TCCGTAAGGT
GTGCAACTCAG
5’
5’
CACGTTGAGTC
AGGCATTCCA
TCCGTAAGGT
TCCGTAAGGT
GTGCAACTCAG
GTGCAACTCAG
5’
5’
5’
5’
2° ciclo di PCR
![Page 13: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/13.jpg)
AGGCATTCCA
CACGTTGAGTC
5’
5’
3’
3. Elongazione
TCCGTAAGGT
GTGCAACTCAG
5’
5’
CACGTTGAGTC
AGGCATTCCA
TCCGTAAGGT
TCCGTAAGGT
GTGCAACTCAG
GTGCAACTCAG
5’
5’
5’
5’
GTGCAACTCAG5’
5’TCCGTAAGGT
PRODOTTO FINALE
2° ciclo di PCR
![Page 14: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/14.jpg)
Taq-polimerasi: a 100° è parzialmente denaturata ma reversibilmente
![Page 15: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/15.jpg)
PCR machine
![Page 16: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/16.jpg)
![Page 17: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/17.jpg)
![Page 18: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/18.jpg)
Polymerase Chain Reaction
• Resa teorica: 2n
P=(2)n Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n)
Lo
g[D
NA
]
N° cicli PCR
Esponenziale
Lineare
Plateau
Prodotto
variabile
![Page 19: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/19.jpg)
Polymerase Chain Reaction
Resa effettiva: effetto plateau
Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, è limitato da:
- attività della Taq polimerasi
- quantità dei reagenti (primers, deossiribonucleotidi)
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti
![Page 20: Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR)€¦ · Reazione di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) Una caratteristica peculiare del DNA: denaturazione e rinaturazione](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022071603/613ee658c500cf75ab362f01/html5/thumbnails/20.jpg)
Analisi del prodotto di PCR
Bromuro di etidio