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Réarrangements du gène ALK dans les cancers du poumon non à petites cellulesALK gene rearrangement in non-small-cell lung carcinomaSylvie Lantuejoul*, Lénaïg Mescam-Mancini*,**, Anne McLeer-Florin**

* Département de pathologie, pôle de biologie et de pathologie, hôpital Albert-Michallon ; Inserm U823, institut Albert-Bonniot, université Joseph-Fourier, Grenoble.** Plateforme de génétique moléculaire des cancers, pôle de biologie et de pathologie, hôpital Albert-Michallon, UMR-S 1036-CEA, Grenoble, université Joseph-Fourier, Grenoble.

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» Depuis 2004, la prise en charge des cancers du poumon a subi une véritable révolution grâce à la découverte d’anomalies génétiques pouvant être ciblées par des agents thérapeutiques. Ainsi, dans les adénocarcinomes, après la mise en évidence des mutations activatrices du gène de l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), la découverte de translocations du gène ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) fait espérer une amélioration du pronostic de ces tumeurs. En effet, les cellules présentant un réarrangement d’ALK sont dépendantes de l’activation de la kinase ALK, et une réponse favorable après traitement par une petite molécule inhibitrice, le crizotinib, a été rapportée dans des essais cliniques. Les patients ALK positifs sont le plus souvent non fumeurs ou de petits fumeurs (moins de 10 paquets-année) et porteurs d’un adénocarcinome d’architecture solide et acinaire, souvent avec des massifs cribriformes riches en cellules mucipares en bague à chaton exprimant le TTF1. Trois techniques peuvent être utilisées pour la mise en évidence d’un réarrangement d’ALK dans les cellules tumorales : l’immunohistochimie, la RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) et la FISH (hybridation in situ en fluorescence). La détection de ces réarrangements est proposée en France par l’Institut national du cancer (INCa) au sein des plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers et s’inscrit dans un algorithme de diagnostic décisionnel en cours de validation aux niveaux national et international.

Mots-clés : Carcinome – Poumon – ALK – Immunohistochimie – FISH – RT-PCR.

Since the discovery in 2004 of EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) mutations, responsible for a specific sensitivity of mutated tumors to tyrosine kinase inhibitors, the prognosis of non-small-cell lung carcinoma (NSCLC) has improved dramatically along with the development of targeted therapies. In 2007, Soda et al. described a rearrangement of the ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) gene in a subset of lung adenocarcinomas, leading to a permanent activation of the ALK kinase, specifically targeted by a small molecule raised against ALK and MET, crizotinib. ALK gene rearrangements are observed mainly in adenocarcinomas with solid and acinar histology, rich in TTF1 positive signet-ring cells, which arise in non or light smokers (< 10 pack year), with advanced stage disease at diagnosis. Three diagnostic techniques can be used: immunohistochemistry, RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) and FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), the latter being the reference technique recommended by the Institut national du cancer (INCa) program in France. However, several national and international studies are ongoing in order to determine a diagnostic algorithm for a large-scale screening.

Keywords: Carcinoma – Lung – ALK – Immunohistochemistry – FISH – RT-PCR.

L e cancer du poumon reste la première cause de décès par cancer dans le monde, et est responsable de plus de 1,2 million de décès par an (1). Sur le plan

clinique, histologique et thérapeutique, les cancers du poumon se divisent en 2 grands groupes : les carcinomes à petites cellules, dont l’incidence est en diminution, et les carcinomes bronchiques non à petites cellules (CBNPC), constitués principalement des adénocarcinomes, qui représentent environ 50 % des cancers du poumon, et des carcinomes malpighiens (environ 30 %). Le pronostic des cancers non à petites cellules reste redoutable, avec

une survie globale tous stades confondus n’excédant pas 5 % à 5 ans. La principale raison en est que, au moment du diagnostic, 75 % de ces cancers sont métastatiques et donc non opérables. Si la majorité des cancers du poumon sont associés à une consommation tabagique, 15 % des cancers chez les hommes et 53 % des cancers du poumon chez les femmes surviennent chez des non-fumeurs ; il s’agit surtout d’adénocarcinomes, dont 20 % ne sont pas liés au tabac. Ces tumeurs présentent une carcinogenèse à part, souvent marquée par une véritable addiction à une muta-tion, une translocation ou une amplification activatrice

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Réarrangements du gène ALK dans les cancers du poumon non à petites cellules

d’un oncogène (2, 3). Ainsi, en 2004 le rôle des mutations activatrices (4) du récepteur à l’EGF (Epidermal Growth Factor) a été démontré dans certains adénocarcinomes, conférant à ces tumeurs une sensibilité aux inhibiteurs de tyrosine kinase. L’intérêt est que ces oncogènes activent des voies de signalisation stimulant la croissance cellulaire et la résistance à l’apoptose des cellules tumorales uni-

quement, si bien que, lorsqu’une protéine oncogénique est ciblée par une molécule inhibitrice, seules les cellules malignes sont atteintes, et non les cellules normales (2).En 2007, une autre anomalie génétique concernant le gène codant pour la kinase ALK a été décrite par M. Soda et al. dans les CBNPC ; cette anomalie procède d’une translo-cation entre 2 gènes, le gène ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) en 2p23 et le gène EML4 (Echinoderm Microtubule associated protein Like 4) en 2p21 (5). Cette altération résulte en fait d’une inversion au niveau du bras court du chromo-some 2 et d’une fusion de la région codant pour la tyrosine kinase (TK) ALK avec différentes portions N-terminales plus ou moins tronquées du gène EML4 (figure 1). Ces réarran-gements sont responsables d’une activité tyrosine kinase permanente via la dimérisation du domaine TK, indé-pendante de toute fixation à un ligand ; cette activation constante est responsable de la prolifération des cellules tumorales, de changements dans leur cytosquelette, de leur migration et de leur survie (6). Comme pour les muta-tions d’EGFR, les cellules qui présentent ce réarrangement sont dépendantes de l’activation de la kinase ALK (7). De multiples variants ont été décrits (environ 15 actuellement) [8]. Ces variants impliquent l’exon 20 du gène ALK qui code pour le domaine TK intracytoplasmique et la région d’EML4 qui code pour le domaine coiled coil aminoterminal d’EML4 nécessaire à l’activation d’ALK ; les variants EML4-ALK les plus fréquents sont E13;A20 et E6a/b;A20, observés dans 33 et 29 % des cas (9). D’autres partenaires qu’EML4 ont été rapportés, tels que TFG (TRK-fused gene), KIF5B (kine-sin family member 5B) et, plus récemment, KLC1 (kinesin light chain 1) [figure 2] (10-12). Ils seraient responsables

Figure 1. Schéma de la translocation EML4-ALK, illustrant l’inversion de la partie aminoterminale d’EML4 et sa fusion avec la partie du gène ALK codant pour le domaine tyrosine kinase.

EML4

KINASE

EML4

EML4-ALK variant 1

EML4-ALK variant 1

ALK

ALK

1

1

1 496

496

981

1 059

1 6201 058

Domaine transmembranaire

Exon 21 Exon 13

Figure 2. Schéma des différents variants actuellement recensés du réarrangement du gène ALK avec ses différents partenaires.

EML4 ALK

ALK

ALK

ALK

ALK

ALK

ALK

ALK

ALK

EML4

EML4

EML4

EML4

EML4

EML4

EML4

Domaine tyrosine kinase

KLC1, TGF ou KiF5B

EML4-ALK

Variant 1 (33 %) - E13;A20

Variant 3a/b (29 %) - E6;A20

Variant 2 (9 %) - E20;A20

Variant 4’ et 7 (3 %) - E14;A20

Variant 5’ (2 %) - E18;A20

Variant 4 (2 %) - E15;A20

Variant 5 a/b (2 %) - E2;A20

E17;A20

KLC1, TFG ou KiF5B-ALK

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Réarrangements du gène ALK dans les cancers du poumon non à petites cellules

d’une activation de la kinase ALK similaire à celle issue des variants EML4-ALK, avec une sensibilité potentielle aux inhibiteurs d’ALK.

Données anatomocliniques

Les réarrangements du gène ALK sont observés dans 3 à 13 % des CBNPC selon les séries, avec une inci-dence aux alentours des 5 % dans les études sur des populations non sélectionnées. La plupart des patients porteurs de ce réarrangement sont plus jeunes que les autres patients atteints de cancer du poumon, et sont de petits (< 10 paquets-année) fumeurs ou des non-fumeurs (5, 7, 13). Du point de vue histologique, les carcinomes ALK réarrangés sont majoritairement des adénocarcinomes, d’architecture solide et acinaire, souvent avec des massifs cribriformes riches en cellules mucipares en bague à chaton TTF1 positives (figure 3A) ; certains adénocarcinomes papillaires ALK réarrangés ont également été décrits, ainsi que d’exceptionnels carcinomes malpighiens ou des adénosquameux (10, 13, 14). Une réponse favorable après traitement par une petite molécule inhibitrice d’ALK et de MET, le crizotinib (PF-02341066), a été rapportée en essai de phase I ; 2 essais de phase II et III sont en cours, notamment en première et deuxième lignes par comparaison avec la chimiothérapie, et en troisième ligne et au-delà en phase II. En France, le crizotinib est disponible en autori-sation temporaire d’utilisation (ATU) après échec d’une chimiothérapie (15, 16).

Tests diagnostiques

La mise en évidence d’un réarrangement d’ALK dans les cellules tumorales peut être effectuée par diffé-rentes méthodes : l’immunohistochimie met en évi-dence une expression aberrante du domaine kinase intracytoplasmique de la protéine, la RT-PCR permet la détection des différents transcrits de fusion grâce à l’utilisation d’amorces spécifiques, et les techniques d’hybridation in situ permettent la mise en évidence directe du réarrangement.

ImmunohistochimieLe clone ALK1 est classiquement utilisé pour le dia-gnostic des lymphomes anaplasiques à grandes cel-lules ; il présenterait une sensibilité de 90,0 % et une spécificité de 97,8 % (17) pour le diagnostic des adéno-carcinomes ALK réarrangés ; cependant, sa sensibilité paraît inférieure à celle des 2 autres clones actuelle-

ment utilisés dans la littérature pour le diagnostic de ces adénocarcinomes (10) : il s’agit du clone 5A4, capable de détecter les protéines de fusion issues des variants EML4-ALK v1, v2, v3, v6 et v7 et du variant KiF5B-ALK, et du clone D5F3, présentant tous 2 une sensibilité de 100 % et une spécificité de 99 % (9, 10, 18-21). Le marquage observé est souvent intense, cytoplasmique et diffus (figure 3, C et D), mais, dans de rares cas, il peut être faible et focal [18, 21].

RT-PCRLa mise en évidence par RT-PCR des différents transcrits de fusion d’ALK nécessite l’utilisation d’une technique “multiplex” utilisant une amorce commune pour la mise en évidence de l’exon 20 d’ALK et des amorces spécifiques variées pour la mise en évidence du par-tenaire de fusion. Cette technique est très sensible, mais la longueur des fragments amplifiés pouvant être supérieure à 1 000 paires de bases, il est néces-saire de disposer de matériel congelé ; c’est rarement le cas (5). Des kits de détection par RT-PCR ont ainsi été développés (ALK Fusion TaqMan® Gene expression assays, Life Technologies), permettant la détection des variants les plus fréquents (E6a/b;A20, E13;A20, E20;A20, E17;A20 et E18;A20) à partir d’ARN extraits de tissus fixés et inclus en paraffine. Environ soixante-dix pour cent des variants EML4-ALK peuvent ainsi être mis en

Figure 3. A. Histologie classique solide et acinaire riche en cellules en bague à chaton des adénocarcinomes ALK réarrangés. B. FISH ALK (sonde break-apart) montrant une séparation (ou split) des sondes marquées en rouge et en vert (situées de part et d’autre du point de cassure localisé dans l’exon 20 du domaine kinase d’ALK) et témoignant d’un réarrangement du gène ALK. C et D. Immunohistochimie anti-ALK (clone 5A4).

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évidence par cette technique, mais une confirmation par une autre technique (IHC ou FISH) est nécessaire, en particulier dans le cas de l’absence de variant, afin d’éliminer tout risque de faux négatif.

FISHLa FISH est la technique de référence pour la mise en évidence des réarrangements d’ALK dans les CBNPC, la présence en FISH d’un réarrangement d’ALK dans plus de 15 % des cellules tumorales étant le test dia-gnostique utilisé pour l’inclusion des patients dans un protocole de traitement par crizotinib à ce jour (22). L’utilisation de sondes break-apart (ou split) permet la mise en évidence d’un réarrangement d’ALK quel que soit son partenaire (figure 3, B, p. 109), mais l’interpré-tation du résultat est parfois difficile, surtout pour les réarrangements intrachromosomiques conduisant à une séparation des signaux FISH (indiquant un réar-rangement) parfois ténue. Les sondes dites de fusion, spécifiques de 2 partenaires connus, permettent d’iden-tifier le partenaire de fusion d’ALK.

Conclusion : algorithme diagnostique

Les mutations d’EGFR et de KRAS et les réarrangements du gène ALK étant considérées comme mutuellement exclusives, l’INCa a privilégié dans ses programmes de 2011 et de 2012 le testing ALK des adénocarci-nomes métastatiques sans mutation d’EGFR ni de KRAS ; cependant, cet algorithme diagnostique est actuellement discuté, car plusieurs cas d’adénocarci-nomes à la fois mutés pour EGFR et réarrangés pour ALK ont été rapportés. La technique de référence choisie dans ces programmes de l’INCa était la FISH, mais, pour des raisons financières et de facilité d’uti-lisation, la possibilité d’un screening à grande échelle par immunohistochimie, dès le diagnostic histolo-gique, est envisagée, avec la nécessité de confirmer les cas positifs ou douteux par la FISH ou la RT-PCR. Une étude nationale et plusieurs études internationales de validation d’un tel algorithme diagnostique sont en cours et devraient assez rapidement permettre de statuer sur sa faisabilité. ■

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