lineamientos para la vigilancia epidemiológica de difteria ... - … · en el área de vigilancia...

Dirección General de Epidemiología

Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos“Dr. Manuel Martínez Báez”

lineamientos para la vigilancia epidemiológicade difteria por laboratorio

P á g i n a 1/61 Difteria-RNLSP

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA

DE DIFTERIA POR LABORATORIO

DGE-InDRE–RNLSP

2015

Fotografía de la portada propiedad de HKS Arquitectos


PRIMERA EDICIÓN, 2015

DIFTERIA-RNLSP

ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE

CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL PARA LA

VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE).

TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY

© INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD

SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS

PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE DIFTERIA POR LABORATORIO” VERSIÓN NO. 01.

INDRE, 2015.

COLECCIÓN PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE:

ISBN: EN PROCESO

INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICO DR. MANUEL MARTÍNEZ

BÁEZ.

FRANCISCO DE P. MIRANDA 177, COL. UNIDAD LOMAS DE PLATEROS DEL. ÁLVARO

OBREGÓN C.P. 01480, MÉXICO, DISTRITO FEDERAL, TEL. (55)53-42-75-50

WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX

LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ

EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ

IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO

http://www.indre.salud.gob.mx/


SECRETARÍA DE SALUD

DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ

SECRETARIA DE SALUD

DR. EDUARDO GONZÁLEZ PIER SUBSECRETARIO DE INTEGRACIÓN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD

DR. PABLO ANTONIO KURI MORALES

SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD

LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZÁLEZ SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIÓN Y FINANZAS

DR. GABRIEL O´SHEA CUEVAS

COMISIONADO NACIONAL DE PROTECCIÓN SOCIAL EN SALUD

LIC. MIKEL ARRIOLA PEÑALOZA COMISIONADO FEDERAL DE PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS

DR. JOSÉ MELJEM MOCTEZUMA

COMISIONADO NACIONAL DE ARBITRAJE MÉDICO

DR. GUILLERMO MIGUEL RUIZ-PALACIOS Y SANTOS TITULAR DE LA COMISIÓN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y

HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD

LIC. RODRIGO REINA LICEAGA TITULAR DE LA UNIDAD COORDINADORA DE VINCULACIÓN Y PARTICIPACIÓN SOCIAL

DR. NELLY AGUILERA ABURTO

TITULAR DE LA UNIDAD DE ANÁLISIS ECONÓMICO

LIC. CARLOS SANDOVAL LEYVA DIRECTOR GENERAL DE COMUNICACIÓN SOCIAL

DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDAN

DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL

DE ENFERMEDADES

DR. EDUARDO JARAMILLO NAVARRETE DIRECTOR GENERAL DE PROMOCIÓN DE LA SALUD

DR. CUITLÁHUAC RUIZ MATUS

DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA


LIC. JUAN CARLOS REYES OROPEZA DIRECTOR GENERAL DE INFORMACIÓN EN SALUD


INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. MANUEL MARTÍNEZ BÁEZ

DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS

DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO

LIC. ADRIANA CASTRO CABRERA SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN

M EN C. BELÉN TORRES LONGORIA

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA

QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS

M. EN C. JUAN CARLOS CARPIO PEDROZA JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA

DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA

M. EN C. JUDITH ESTEVEZ RAMÍREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS

DR. JOSÉ ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE TÉCNICAS

BIOL. NORMA ANGÉLICA MONTES COLIMA JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA

DRA. LUCIA ÁLVAREZ HERNÁNDEZ

JEFA DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y

PERTUSSIS COORDINADORA DE LA RED PARA EL DIAGNÓSTICO DE DIFTERIA


GRUPO DE TRABAJO

DRA. LUCIA ÁLVAREZ HERNÁNDEZ

JEFA DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y

PERTUSSIS

QBP. MÓNICA GUADALUPE VIVEROS TERRAZAS

COORDINADORA TÉCNICA DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS

BACTERIANAS Y PERTUSSIS

COORDINADORA DE LABORATORIO EN SIREVA II

IBI. PATRICIA GABINO NORIEGA

QBP. MARÍA DEL CARMEN HERRERA BAUTISTA

QPB. SUGEI JEANNETTE GÁMEZ CONTRERAS

IMI. JORGE MACEDO ESPAÑA

QBP. SUSANA JIMÉNEZ MORENO

TÉC. LAB. ENRIQUE HERRERA GONZÁLEZ

ADSCRITOS AL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y

PERTUSSIS

BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

DR. HUGO MARTÍNEZ ROJANO

ASESOR TÉCNICO DE LA DIRECCIÓN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL

DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO


LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA

EPIDEMIOLÓGICA DE DIFTERIA POR

LABORATORIO

DGE-InDRE–RNLSP

2015


Contenido

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 9

ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA ..................................................................................................................... 9

ANTECEDENTES DE LA PARA EL DIAGNÓSTICO DE DIFTERIA ...................... 10

MARCO LEGAL DEL LABORATORIO ..................................................................... 12

DEFINICIONES OPERATIVAS ................................................................................ 13

OBJETIVOS ............................................................................................................... 15

RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA DIFTERIA ................................................................................................................................... 16

ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE DIFTERIA .. 17

TOMA, MANEJO, Y ENVÍO DE MUESTRAS .......................................................... 19

ESTÁNDARES DE CALIDAD ................................................................................... 29

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 32

ANEXO I: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ................................................................... 34

ANEXO II. PRUEBAS DIFERENCIALES DE CATALASA Y OXIDASA .................. 48

ANEXO III. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS PARA MÉTODOS BACTERIOLÓGICOS ............................................................................. 50


INTRODUCCIÓN

La difteria es una enfermedad infectocontagiosa, que afecta exclusivamente al

hombre, causada por los efectos de una toxina que produce y libera

Corynebacterium diphtheriae, la puerta de entrada de este microorganismo es por

vía aérea. Clínicamente la sintomatología se presenta de 2 a 7 días después de la

infección, manifestándose en vías respiratorias altas; faringe, nasofaringe y con

menos frecuencia en piel, conjuntivas, órganos genitales y heridas. La toxina tiene

la característica de que se puede diseminar por vía sanguínea, se caracteriza por la

presencia en faringe de una o varias placas de tipo membranoso, color gris y

adherentes, con inflamación a su alrededor que se extiende a nasofaringe y la

tráquea provocando problemas obstructivos. Las corinebacterias son

microorganismos ampliamente distribuidos en el medio ambiente como son el

suelo, agua, piel y mucosas de otros mamíferos, además del hombre. Por lo tanto es

relativamente frecuente la presencia de cepas de Corynebacterium diphtheriae no

toxigénicas y aún toxigénicas en individuos sanos. Es por ello que la confirmación

por laboratorio de un caso con sospecha clínica de difteria no se puede limitar solo

al aislamiento del bacilo con características morfológicas y aún bioquímicas

compatibles con las corinebacterias, se requiere además la demostración de la

capacidad toxigénica de la cepa aislada.

El bacilo diftérico es resistente a la desecación y sobrevive por semanas en

superficies contaminadas por secreciones o gotas de saliva de los enfermos. Se

establece fácilmente en las vías respiratorias de individuos, incluso de los que

presentan inmunidad natural o artificial a la toxina.

Por otra parte la infección por el microorganismo puede ser atípica, por lo que se

recomienda la búsqueda de portadores de C. diphtheriae entre los contactos

cercanos del paciente, así como el muestreo de ropas de cama del enfermo para

confirmar la presencia de bacilos toxigénicos. Esto es especialmente crítico cuando

debido a la gravedad del paciente, el clínico no puede retrasar el tratamiento con

antimicrobianos, lo cual puede dificultar el diagnóstico bacteriológico del caso.

El propósito del siguiente lineamiento es el de establecer las directrices para la

toma, manejo y envió de muestras para el diagnóstico por laboratorio de difteria de

una forma estandarizada, estableciendo los flujos de información adecuados de los

datos generados por el laboratorio en apoyo a la vigilancia epidemiológica.

ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE

SALUD PÚBLICA

La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) es el conjunto de

laboratorios de vigilancia epidemiológica con objetivos específicos que le han

permitido unificar métodos de diagnóstico, criterios de interpretación de

resultados, transferencia tecnológica, generación de conocimiento y formación de


recursos humanos. Es el soporte técnico-científico útil para la vigilancia

epidemiológica y que genera información de calidad para la toma oportuna de

decisiones a través de la confirmación de diagnósticos mediante estudios de

laboratorio en muestras biológicas.

La RNLSP depende de la Secretaría de Salud y es el Instituto de Diagnóstico y

Referencia Epidemiológicos “Dr. Manuel Martínez Báez” (InDRE) su órgano rector

en el área de vigilancia epidemiológica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial

Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica y está

conformada por 31 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) de las 32

entidades federativas del país (el Distrito Federal envía sus muestras al InDRE).

El Marco Analítico Básico de la RNLSP consta de 27 diagnósticos, distribuidos en

16 redes de vigilancia específica.

ANTECEDENTES DE LA RNALSP PARA EL DIAGNÓSTICO DE

DIFTERIA

El Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas (IRAB) y Pertussis,

inició desde hace 3 décadas, como parte de su marco analítico instrumentó el

diagnóstico de la difteria en México a partir del estudio de casos probables de

difteria y sus contactos, hace aproximadamente 33 años.

Hoy en día la RNLSP en coordinación con el laboratorio de IRAB y Pertusis está

capacitada para la toma y manejo de muestras para el diagnóstico de difteria y

solo están capacitados para realizar el cultivo bacteriológico; Guanajuato e

Hidalgo.

El InDRE lleva a cabo el diagnóstico bacteriológico, así como abastecimiento del

medio de transporte de PAI a los laboratorios de la red ante la sospecha de un caso

probable o en situación de brotes, y les proporciona los reactivos y materiales

necesarios para el diagnóstico y la toma de muestra cuando así sea requerida.

Todas las cepas sospechosas de Corynebacterium diphtheriae aisladas en los

laboratorios a través de la red se envían al laboratorio de IRAB y Pertusis del

InDRE como referencia.

Brotes de difteria estudiados por el InDRE

Desde la década de 1980 en el país se han presentado casos de difteria con una

periodicidad anual. El laboratorio de IRAB y Pertussis del departamento de

bacteriología del InDRE en coordinación con la Dirección General de

Epidemiología, confirmaron más de una decena de brotes ocurridos entre 1985 y

1991, los casos se presentaron principalmente en zonas con clima tropical y

subtropical.


LA DIFTERIA EN MEXICO de 1985 al 2010

Brotes de difteria estudiados por el INDRE

1985-2010

En el siguiente cuadro se presentan las zonas y las fechas de los brotes de difteria

que fueron estudiados por el InDRE durante el periodo de 1985 a 2010.

Figura 1.- Brotes de difteria estudiados por el InDRE (1985-2010). Tomado de “La Difteria en México: Epidemiología y Diagnóstico .Publicación técnica del INDRE

No. 17


Cuadro 1.- Brotes de Difteria estudiados por el INDRE durante el periodo 1985-

2010

MARCO LEGAL DEL LABORATORIO

1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF

05/02/1917, Última Reforma D.O.F. 15/02/2012.

2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139

y 141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012.

3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia

epidemiológica. DOF: 19/02/2013.

4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección

ambiental-salud ambiental-residuos peligrosos biológico-infecciosos-

clasificación y especificaciones de manejo.

5. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las

características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados

de los residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006.

6. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011, Para la organización y

funcionamiento de los laboratorios clínicos.

Casos Contactos Total

YUCATAN AGOSTO, 1985 4 82 1 1 2

SINALOA Y NAYARIT SEPTIEMBRE, 1986 12 194 2 4 6

SINALOA Y NAYARIT ENERO, 1987 1 92 1 4 5

GUERRERO AGOSTO, 1987 1 129 1 2 3

SINALOA FEBRERO, 1988 1 8 1 0 1

CD. VALLES SLP SEPTIEMBRE, 1988 1 30 1 0 1

CD. VALLES SLP MAYO, 1989 1 31 1 0 1

B. APIZA MICHOACAN MAYO, 1989 1 309 0 6 6

EL ROSARIO, SINALOA JULIO , 1989 1 112 0 0 0

ARTEAGA, CAMPECHEAGOSTO, 1989 1 129 0 0 0

TAMAZUNCHALE, SLP 0CTUBRE, 1991 1 68 0 0 0

LAZARO CARDENAS, MICH.0CTUBRE, 1991 1 371 1 5 6

CAMPECHE FEBRERO, 2004 2 0 0 0 0

EDO. MEXICO MARZO, 2004 1 75 0 0 0

QUERETARO JUNIO, 2004 1 0 0 0 0

CD. VALLES, SLP FEBRERO, 2010 1 10 0 0 0

CHETUMAL, Q .ROO MARZO, 2010 1 10 0 0 0

PACHUCA, HGO JUNIO, 2010 1 8 0 1 1

SAN LUIS POTOSI JULIO, 2010 1 25 0 0 0

TEPIC, NAYARIT SEPTIEMBRE,2010 1 5 0 0 0

CONTACTO POSITIVO A Corynebacterium ulcerans toxigénico

Cepas toxigénicas aisladasNo. De Casos

No. De

ContactosLUGAR FECHA


7. Norma Oficial Mexicana, NOM-031-SSA2-1999, Para la atención a la salud

del niño.

8. Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, publicado en el Diario Oficial

de la Federación el 19 de enero de 2004, última reforma publicada DOF 10

de enero de 2011.

9. Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial

de la Federación DOF: 12/12/2013.

10. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federación,

DOF: 20/05/2013, www.dof.gob.mx.

11. Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema

Nacional de Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014.

12. Lineamientos para los Programas de Evaluación Externa del Desempeño de

la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública DGE-InDRE-RNLSP,

2014.

13. Manual para la toma, envío y recepción de muestras para Diagnóstico. DGE-

InDRE-RNLSP, 2014.

14. Manual de la Evaluación del Desempeño “Caminando a la Excelencia”,

México, DGE-InDRE-RNLSP, 2014.

15. Lineamientos del Sistema de Reconocimiento a la Competencia Técnica de

Laboratorios que apoyan a la Vigilancia Epidemiológica. DGE-InDRE-

RNLSP, 2014.

16. Lineamientos para la Gestión de Riesgo Biológico. DGE-InDRE-RNLSP,

2014.

17. Criterios de Operación para la Red Nacional de Laboratorios de Salud

Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2014.

DEFINICIONES OPERATIVAS

Definición operativa de caso

Definición clínica: Paciente que presenta una enfermedad aguda de las

amígdalas, faringe, nariz y se caracteriza por una o varias placas grisáceas

adherentes confluentes e invasoras, con una zona inflamatoria circundante de color

rojo mate, dolor de garganta, aumento de volumen del cuello, fiebre, cefalea y

grado variable de compromiso del estado general. La enfermedad puede afectar

otras localizaciones como mucosas y piel.

Caso sospechoso de difteria: Toda persona de cualquier edad que presente

algún proceso infeccioso de vías aéreas superiores, o bien, lesiones de cualquier

tipo en piel.

Esta definición se utiliza exclusivamente durante la búsqueda de casos en un brote

o el estudio epidemiológico de un caso probable o confirmado. No deben ser

notificados a menos que pasen a la clasificación de probable o portador.

http://www.dof.gob.mx/


Caso probable de difteria: Todo caso sospechoso de cualquier edad que

presente infección de vías aéreas con presencia de placas blanco-grisáceas con dos

o más de las siguientes características: borde hiperémico, consistencia dura,

adherentes, fácilmente sangrantes, fétidas y dos o más de los siguientes síntomas:

Adenomegalias cervicales (cuello de toro)

Disfagia, odinofagia y/o disnea.

Fiebre

Malestar general

Estado tóxico infeccioso

Nota: Esta definición es el detonador del sistema de vigilancia, se utiliza ante el

reporte de casos, defunciones o durante la búsqueda activa de casos en las Redes de

Notificación; deberá ser aplicada también a todo cuadro con diagnóstico de difteria,

o bien, de angina de Vincent, mononucleosis infecciosa, candidiasis y estreptococia

o absceso peri-amigdalino grave.

Estos casos deben ser notificados de inmediato y realizar los estudios clínico y

epidemiológico correspondientes así como la toma de muestras del caso, sus

contactos y convivientes.

Caso confirmado de difteria: Todo caso probable al que se le agregue lo

siguiente:

Aislamiento de Corynebacterium diphtheriae cepa toxigénica.

Aislamiento de Corynebacterium diphtheriae toxigénico a partir de

convivientes, contactos, o personas con asociación epidemiológica con el

caso.

Asociación epidemiológica con otro caso confirmado.

Caso compatible de difteria: Todo caso probable de difteria en el que no se

logra identificar la etiología o que fallece o que se pierde durante su seguimiento y

no se dispone de estudios de laboratorio.

La clasificación de un caso como compatible representa una falla en la vigilancia

epidemiológica del evento.

Caso de difteria cutánea: Toda persona de la cual se aísle Corynebacterium

diphtheriae toxigénica de alguna lesión en la piel, en ausencia de infección

aparente en vías aéreas u otro sitio, y tenga o no manifestaciones de la enfermedad.

Portador asintomático: Toda persona en la que se identifique Corynebacterium

diphtheriae toxigénica y no presenta signos o síntomas de la enfermedad.

Caso descartado de difteria: Todo caso probable en el cual se demuestra otra

etiología, o bien todo caso probable en el cual las muestras de laboratorio son

negativas para Corynebacterium diphtheriae toxigénica y los resultados de sus

convivientes, contactos y personas con asociación epidemiológica son también

negativos.


OBJETIVOS

Objetivo general

Establecer las directrices para realizar la toma, manejo y envió de muestras para el

diagnóstico por laboratorio de difteria de una forma estandarizada, estableciendo

los flujos de información adecuados de los datos generados por el laboratorio en

apoyo a la vigilancia epidemiológica.

Objetivos específicos:

Generar y difundir los datos de laboratorio que contribuyan a la prevención

y control epidemiológico de la difteria.

Realizar el diagnóstico, control de calidad y referencia de C. diphtheriae y

otras corinebacterias toxigénicas mediante las técnicas de cultivo

bacteriológico.

Emitir los lineamientos para la operación de la toma de muestras y envío al

Laboratorio Estatal de Salud Pública (LESP) (Guanajuato e Hidalgo) o al

InDRE.

Desarrollar y evaluar la competencia técnica de los laboratorios de la RNLSP


RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA DIFTERIA

Figura 2.- Estados con metodología implementada para la toma y manejo de

muestras para el diagnóstico por laboratorio de difteria.


Flujo de trabajo de la red nacional de laboratorios para el diagnóstico de la difteria

ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE DIFTERIA

Funciones de los integrantes de la red nacional

Nivel nacional

El InDRE a través del Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas

y Pertusis es la institución de referencia para el estudio de la difteria al nivel

nacional y desempeña las siguientes funciones:

Llevar a cabo actividades de diagnóstico de difteria y diversos análisis, en

muestras de seres humanos, en apoyo a la vigilancia epidemiológica.

Participar en el desarrollo, estandarización, adaptación y validación de

técnicas y procedimientos de laboratorio, para las pruebas mínimas,

generales y especializadas.

InDRE (Nivel I)

Diagnóstico, referencia y vigilancia epidemiológica

Envío de información a Epidemiología

Control de calidad y Referencia Internacional CDC de Atlanta

Prueba de pirazinamidasa para la detección de cepas toxigénicas

Laboratorio estatal de salud pública (LESP)

(nivel II)

Toma de muestras y primo aislamiento para la búsqueda de colonias sospechosas

Corynebacterium diphtheriae

Envió del aislamiento al InDRE para su identificación final (referencia)

Tomar muestra de sangre (sueros pareados) para la determinación de anticuerpos y realizar diagnóstico

diferencial con otras patologías

Envió de las muestras en red fría con la información correspondiente al LESP

Unidad de salud de primer nivel

(Centros de Salud, J.S. Hospitales de

1er y 2° nivel) (Nivel II)

Toma de muestras en medio de transporte PAI o Loeffler, o AMIES

Toma de tejidos (pseudomembranas o biopsia de piel) en solución salina fisiológica estéril en tubo o contenedor

estéril


Participar en el diseño de programas de vigilancia epidemiológica y

diagnóstico de la difteria a nivel nacional.

Realizar investigaciones seroepidemiológicas y bacteriológicas que permitan

conocer directa o indirectamente la prevalencia de la difteria en las

diferentes regiones del país.

Establecer el uso de las pruebas estandarizadas y validadas por el InDRE, en

apoyo a la vigilancia epidemiológica de la difteria.

Capacitar al personal de los LESP (químicos, laboratoristas y auxiliares de

laboratorio), así como a los epidemiólogos en las diferentes técnicas,

procedimientos, toma y manejo de las respectivas muestras biológicas, para

el diagnóstico por laboratorio de difteria.

Establecer programas de supervisión para la red de laboratorios.

Elaborar y mantener actualizados los lineamientos, manuales de

procedimientos y técnicas de laboratorio para el diagnóstico por laboratorio

de difteria.

Organizar y participar en las reuniones científicas en las que se aborden

temas relacionados con el diagnóstico de difteria.

Coordinar el flujo de información de la RNLSP y notificar al órgano

normativo de vigilancia epidemiológica correspondiente, los casos

confirmados de difteria.

Nivel estatal

Está constituido por todos los LESP y sus funciones son las siguientes:

Participar en actividades de vigilancia epidemiológica mediante la

realización de pruebas mínimas y generales en el diagnóstico por laboratorio

de difteria.

Ser el centro de referencia de la red estatal de laboratorios locales de salud

pública.

Coordinar, asesorar y supervisar el procedimiento adecuado de la toma de

muestras, para el diagnóstico por laboratorio de difteria.

Participar en el diseño de los programas de vigilancia epidemiológica y de

diagnóstico por laboratorio a nivel estatal. Diseñar programas de capacitación para el personal de la red de laboratorios

locales concernientes a la toma, conservación y envió de las muestras

biológicas para el diagnóstico por laboratorio de difteria.

Notificar al órgano normativo correspondiente los casos sospechosos de

difteria.


Nivel local

Los laboratorios locales tienen las siguientes funciones:

Realizar la toma, manejo y transporte de muestras biológicas para el

diagnóstico por laboratorio de difteria.

Realizar las pruebas mínimas para el diagnóstico por laboratorio de difteria

en muestras humanas, que solo requieran de equipo básico para laboratorio.

Referir las muestras biológicas al LESP correspondiente.

Llevar a cabo la toma de muestras de los contactos de un caso probable o

sospechoso de difteria.

Notificar al órgano normativo jurisdiccional correspondiente los casos

confirmados de difteria.

TOMA, MANEJO, Y ENVÍO DE MUESTRAS

Toma de muestras, condiciones de transporte, conservación y envío al

laboratorio estatal o nacional.

Las muestras sugeridas para el diagnóstico y búsqueda de C. diphtheriae son las

siguientes:

Exudado faríngeo

Exudado nasofaríngeo

Biopsia de pseudomembrana faríngea

Lesiones de la piel

Hemocultivo

Suero

Toma de muestra

Exudado nasofaríngeo

Introducir las tres cuartas partes del mango del hisopo, por la fosa nasal,

hasta topar con la nasofaringe, rotar suavemente el hisopo y sacarlo

lentamente, posteriormente depositarlo en el medio de transporte PAI,

Loeffler o AMIES.

Exudado faríngeo

Es una de las muestras recomendadas para el diagnóstico por cultivo de C.

diphtheriae, se sugiere tomar una parte de la pseudomembrana, si es que se

encuentra presente y debe ser depositada en el medio de transporte de PAI,

Loeffler o AMIES y si el transporte no excede de 24 horas, el tejido de la

pseudomembrana puede ser depositada en un vaso estéril con solución

salina fisiológica estéril, y posterior a ello sellarla perfectamente.


Biopsia de pseudomembrana faríngea

Es una de las muestras recomendadas para el diagnóstico por cultivo de

Corynebacterium diphtheriae. Se recomienda tomar una parte de la

pseudomembrana, si es que se encuentra presente. La pseudomembrana

debe ser depositada en cualquiera de los siguientes medios de transporte:

PAI, AMIES con carbón activado o medio de transporte de Loeffler o si el

transporte de la muestra no excede de 24 horas, el tejido de la

pseudomembrana puede ser depositada en un recipiente estéril con solución

salina fisiológica y sellarse perfectamente.

Biopsias

Las muestras para cultivo de tejidos se remiten de inmediato al laboratorio,

en un recipiente estéril con tapa adecuada.

Para la conservación y transporte de estas muestras se recomienda el medio

de PAI o de Loeffler, que son medios sólidos en tubo e inclinados.

Las muestras conservadas en formol no son adecuadas para el cultivo.

Lesión de la piel

Previo a la toma, se debe realizar una limpieza de la lesión con solución

salina estéril, si hay material endurecido o costra remover antes de la toma.

Presionar con firmeza el hisopo en el interior de la lesión e introducirlo en el

medio de transporte.

Para el diagnóstico de difteria cutánea, se toma una muestra de la lesión

cutánea y se deposita en solución fisiológica estéril, en medio de transporte

de PAI o de Loeffler.

El contenedor con la muestra se envía en red fría, sellado y rotulado, con la

especificación del tipo de muestra y de la localización.

Suero

La muestra de sangre se debe tomar antes del tratamiento con anti-toxina

diftérica o gammaglobulina.

Para obtener la sangre se debe de utilizar los tubos apropiados, pueden ser

tubos con tapones de gel, que permita separar los componentes de la sangre

después de la centrifugación.

No se debe de utilizar anticoagulante para la obtención de suero.

Después de la centrifugación realizar alícuotas del suero y conservarlas en

congelación a -20 °C.

Mantener una alícuota de las muestras que se procesarán a corto plazo, en

refrigeración hasta por ocho días. Si el proceso de la muestra excede de los


ocho días, estas deben congelarse. Es muy importante minimizar los ciclos

de congelación y descongelación de las muestras serológicas para evitar el

deterioro de los anticuerpos.

Las muestras de suero deben de venir perfectamente etiquetadas, así como

acompañadas con la información requerida en el Formato de estudio

epidemiológico de difteria.

Es muy importante que la primer muestra serológica sea tomada a partir de

las dos semanas de haber iniciado los síntomas y previo al tratamiento con

antitoxina diftérica, y la segunda muestra a las dos semanas de haberse

tomado la primera muestra.

Las muestras deben ser enviadas con la solicitud de estudio, resumen clínico

del paciente, así como los estudios de laboratorio que le hayan efectuado.

La falta de alguno de los documentos antes mencionados o las condiciones

inadecuadas de la muestra, causará el rechazo de la misma, y se notificará al

responsable del envío.

Manejo y envío

Transporte y conservación de las muestras:

a. El transporte de las muestras debe ser tan rápido como sea posible, en las

condiciones y temperatura adecuada, así como en los medios de transporte

apropiados.

b. Los medios de transporte sugeridos son: el medio de transporte de PAI o de

Loeffler, sin embargo también se puede emplear el medio de transporte de

AMIES que es un medio semisólido con carbón, aunque este último se

recomienda más para el transporte de cepas sospechosas de C. diphtheriae u

otras corinebacterias toxigénicas.

c. Una vez que la muestra se ha tomado e inoculado en los medios de

transporte de PAl o Loeffler el tiempo óptimo de transporte es de 6 a 8 horas

a temperatura ambiente, si el tiempo de transporte es mayor, entonces la

muestra debe ser transportada entre 2 a 8 °C, ya que después de este tiempo

las proteínas digeridas por esta bacteria, permiten el desarrollo de la flora

acompañante dificultando su aislamiento.

d. Si se utiliza el medio de AMIES, la muestra debe ser transportada entre 2 a 8

°C hasta su recepción en el laboratorio. Si el tiempo de transporte excede las

24 horas se sugiere que estos hisopos sean resguardados en empaques

especiales que contengan silica gel, se tienen reportes de recuperación de C.

diphtheriae, después de 9 semanas de haber sido tomada la muestra.

e. Las muestras serológicas deben transportarse en red fría, si el tiempo no

excede las 24 horas, pero si el tiempo de transporte es mayor debe de

enviarse en congelación.


Estas muestras se procesarán de acuerdo a los algoritmos mostrados en las figuras

3 y 4.

Información requerida:

La muestra debe de enviarse perfectamente etiquetada, señalando si es la primera o

segunda toma, en el caso de muestras serológicas se debe de enviar con el formato

único de envío de muestras del InDRE, resumen de la historia clínica y oficio de

solicitud de estudio.

La información mínima requerida se menciona a continuación y debe ser

recopilada durante la toma de la(s) muestra(s) y conforme se realiza el estudio

epidemiológico de caso:

Datos del paciente: Nombre completo, edad, género, lugar de residencia,

hospital de procedencia, nombre del médico tratante.

Datos de laboratorio: Tipo de muestra, fecha de la toma, tiempo de

transporte, etc.

Datos clínicos; síntomas, fecha de inicio, tratamiento con antibióticos,

antitoxina diftérica o gammaglobulina, fechas de inicio de los tratamientos

suministrados al paciente.

Datos epidemiológicos: Clasificación de caso, especificar si se trata de un

caso sospechoso, contacto o portador, historial de inmunización, datos de

asociación epidemiológica, contacto con granjas, animales de granjas, o

consumo de leche o derivados lácteos no pasteurizados, estos dos últimos

datos son requeridos si se sospecha de infección por C. ulcerans o C.

pseudotuberculosis; también se requiere de un listado de contactos

muestreados, toda esta información debe venir concentrada en el formato de

Estudio Epidemiológico de Difteria.

La falta de alguno de estos documentos o las condiciones inadecuadas de la

muestra son causa de rechazo temporal. El cual se le notificará al usuario y contará

con un periodo de siete días, para enviar la documentación complementaria o la

nueva muestra en las condiciones adecuadas, de no ocurrir así, se rechazará

definitivamente y se notificará al usuario responsable del envío.

Envío de los aislamientos sospechosos de C. diphtheriae y otras cepas

toxigénicas al laboratorio de referencia nacional.

Todos los aislamientos en los que se sospecha la presencia de corinebacterias

potencialmente toxigénicas; C. diphtheriae, C. ulceras o C. pseudotuberculosis,

aisladas del tracto respiratorio o de sitios cutáneos deben remitirse al Laboratorio

de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas y Pertussis del InDRE, para su

confirmación y para realizar las pruebas de toxigenicidad.1


Para la confirmación del diagnóstico de difteria por serología se deben enviar

muestras pareadas del suero del paciente, con una diferencia entre cada toma de

dos semanas, indicando la fecha de la toma de cada una de las muestras.

1 El Sistema Básico de Triple Embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está

contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia,

suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermético para

evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o número de

muestra del paciente. El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel

absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan

varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material

absorbente para evitar algún derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera)

tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 °C, si el tipo de muestra y

ensayo lo requiere. Los recipientes secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico y señal de

orientación del recipiente, a su vez el recipiente secundario deberá ir contenido en un paquete externo de envío

(caja de cartón o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado

con los datos del remitente, destinatario y señal de orientación. La documentación que se integre al triple

embalaje deberá colocarse en la parte interior del paquete.

Material:

Los materiales requeridos para la toma y manejo de las muestras son:

a. Equipo de protección personal: bata, guantes, cubrebocas, lentes de

seguridad o goggles

b. Bolsas de plástico

c. Gradilla para colocar los tubos de ensayo

d. Hisopos de alginato de calcio, rayón o dacrón estériles, con mango flexible

de aluminio para los menores de 6 años y con mango de plástico, para

adolescentes y adultos.

e. Tubos con medio de transporte de PAI, Loeffler o AMIES.

Cuadro 2. Condiciones para la toma, manejo y envío de muestras para el

diagnóstico por cultivo y serología de la difteria.

Principales

entidades

clínicas Difteria Estreptococcia

Mononucleosis

infecciosa Candidiasis

Principales

agentes

etiológicos

Corynebacterium

diphtheriae

toxigénico,

raramente C.

ulcerans

Estreptococo

beta-hemolítico Virus del Epstein

Bar

Candida

albicans y

Candida no

albicans


Tipo de

muestra

requerida

Exudado faríngeo,

nasofaríngeo,

pseudomembrana,

tejido, hisopado de

lesión cutánea,

muestras pareadas

de suero

Exudado faríngeo,

nasofaríngeo,

pseudomembrana,

tejido, hisopado

de lesión cutánea,

muestras

pareadas de suero

Muestra pareada

de suero, con

diferencia de 15

días

Exudado

faríngeo

Material para

la toma de

muestra

Hisopos de

algodón, rayón o

dacrón, recipientes

herméticos y

estériles

Hisopos de

algodón, rayón o

dacrón,

recipientes

herméticos y

estériles

Tubos para

extracción de

sangre

Hisopos de

algodón,

rayón o

dacrón,

recipientes

herméticos y

estériles

Medio de

transporte PAI, Loeffler,

AMIES AMIES, Stuart No se requiere

Solución

salina

fisiológica

estéril

Tiempo

óptimo para la

toma y

transporte de

la muestra

En la fase aguda de

la enfermedad,

previo al

tratamiento

antimicrobiano. El

tiempo óptimo de

transporte es hasta

6 horas

En la fase aguda

de la enfermedad,

previo al

tratamiento

antimicrobiano. El

tiempo óptimo de

transporte es 24

horas

En la fase aguda

de la enfermedad

De 1 a 3 días

posteriores al

inicio de

cuadro

clínico. El

tiempo

óptimo de

transporte es

24 horas

Temperatura

de transporte

Temperatura

ambiente hasta 6 h,

si el tiempo de

transporte es mayor

a 6 h en red fría

En red fría En red fría En red fría

Técnicas de

laboratorio

Cultivo,

identificación

bioquímica (API

CORYNE)

determinación de

toxigenicidad (in

vivo o in vitro)

Cultivo,

identificación

bioquímica (API

strep)

Determinación de

grupo y

determinación de

antiestreptolisinas

en muestras

pareadas

ELISA

Determinación

de IgM e IgG

Examen

microscópico

y cultivo

Tiempo de

proceso para 7 a 12 días 4 a 5 días 48 a 72 h

Examen

microscópico


diagnóstico

por el

laboratorio

y cultivo (24-

48 h)


ALGORITMOS DIAGNÓSTICOS

Estándar de servicio 15 días

Figura 3.- IRAB-M-10/0. Diagnóstico y Referencia de Corynebacterium

diphtheriae y otras especies e identificación de cepas toxigénicas a partir de

muestras clínicas.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DEY OTRAS

ESPECIES E IDENTIFICACIÓN DE CEPAS TOXIGÉNICAS

Corynebacterium diphtheriae

Primoaislamiento sugestivo deCorynebacterium diphtheriae

Identificación bioquímicapositiva a C. diphtheriae

Prueba tamiz de producción detoxina (pirazinamida negativa)

Conservación a -70°C encaldo-glicerol al 30%

Pruebas de toxigenicidad positivasIn vivo (conejo o cobayo)

In vitro Eleck (inmunodifusión)

Se reporta positivo aDifteria

Muestras de exudado nasofaríngeofaríngeo y membrana faringeo

Pruebas desensibilidad

CLAVE - 1B153300

CLAVE - 1B1533003


ALGORITMO DIAGNÓSTICO

Estándar de servicio 7 días

Figura 4.- IRAB-M-014. Demostración de anticuerpos anti-toxina diftérica o

tetánica por Hemaglutinación pasiva.


Figura 5.- Diagnóstico diferencial de difteria por el laboratorio


ESTÁNDARES DE CALIDAD

Con la finalidad de verificar el cumplimiento de los objetivos de la vigilancia por el

laboratorio el InDRE define los siguientes estándares:

Estándares de evaluación de la calidad

Indicador Estándar Cálculo Acción Evaluación

Calidad de las muestras

90% de las muestras cumplen con los criterios de aceptación

(Muestras aceptadas/muestras recibidas) x 100

La define el laboratorio local o estatal. Puede ser capacitación dirigida u oficio de notificación

Cumplimiento del envío de muestras

Envío de las muestras con sospecha de Corynebacterium diphtheriae y otros Corynebacterium spp.

Muestras aceptadas en el InDRE/muestras informadas en el sistema de información en salud x 100

El laboratorio de referencia nacional enviará oficio de notificación

Para asegurar el diagnóstico de la vigilancia epidemiológica de difteria se deberán

cumplir los siguientes estándares de servicio, iniciando desde la fase pre analítica;

toma y manejo de muestras, seguido de la fase analítica en donde el éxito del

diagnóstico radica en la aplicación de la técnica adecuada en función de la

evolución de la enfermedad del paciente y la fase post- analítica en el cumplimiento

de los estándares de servicio en tiempo y forma.

Criterios de aceptación

Se aceptarán las muestras que cumplan con las definiciones operacionales de caso

para el diagnóstico de difteria: caso probable, caso sospechoso, caso atípico y

contacto, los cuales deberán de cumplir los siguientes criterios:

Estar registradas en el InDRE.

Deben ser transportadas en los medios adecuados y perfectamente

etiquetadas.

Ser de contactos para búsqueda de portadores tomadas dentro de los diez

primeros días, después de haberse iniciado el estudio de caso probable o

sospechoso.

Estar almacenadas a temperatura de refrigeración 4 a 8 °C.

Las muestras deberán de no exceder las 48 horas de transporte.

Cumplir los lineamientos del manual de toma y envío, editado por el InDRE.


Criterios de rechazo

Se rechazarán las muestras que no cumplan con las definiciones operacionales de

caso para el diagnóstico de difteria: caso probable, caso sospechoso, caso atípico y

contacto.

Muestras sin oficio o sin alguno de los siguientes formatos: formato único de

envío de muestras biológicas del InDRE, copia del Formato de Estudio

Epidemiológico de caso de difteria.

Muestra de suero insuficiente (>200 microlitros), y que estén

indebidamente etiquetadas.

Muestras tomadas con un hisopo de algodón.

Muestras que excedan los dos días de tránsito.

Muestras derramadas.

Muestras que no estén etiquetadas.

Muestras enviadas a temperatura mayor de 8 °C.

Captura de datos y resultados

Captura de datos

Los datos que acompañan a la muestra en el formato único para el envío de

muestras biológicas del InDRE, en la historia clínica o en la solicitud

correspondiente son revisados y cotejados inicialmente por el personal del

departamento de recepción de muestras del InDRE.

En el caso de que las muestras o cepas enviadas no cumplan con las condiciones de

envío, se realiza el rechazo correspondiente, este dependerá de la calidad de la

muestra de acuerdo a lo estipulado en el formato de rechazo definitivo de muestras.

El formato de rechazo se entregará en el área de recepción de muestras, para que se

le informe al usuario, con la finalidad de que éste solucione el problema

administrativo o envíe otra muestra.

En el caso de que la muestra se aceptada se entrega al área correspondiente, para su

análisis.

Resultados

Los resultados emitidos por el InDRE deben cumplir con lo siguiente:

Ser legibles, sin errores de trascripción e informados a las personas

autorizadas para recibir y utilizar la información.

Tener anotado la fecha y hora de la toma de la muestra primaria, cuando

esté disponible y sea pertinente para el cuidado del paciente, así como la

hora de recepción en el laboratorio.

Fecha y hora de la liberación del informe, las cuales si no están en el

informe, deben de estar fácilmente accesibles cuando sea necesario.

Datos de identificación de la persona que autoriza la liberación del informe.


Si es pertinente, se proporcionarán los resultados originales y los corregidos.

Firma de la persona autorizada que verifica o libera el informe.


REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Diagnóstico Microbiológico, Texto y Atlas color. 5a ed. Ed Panamericana.

2003 pp. 416-424 y 651-664.

2. Efstratiou A, Engler KH, Mazurova IK, Glushkevich T, Vuopio-Varkila J and

Popovic T. Current Approaches to the Laboratory Diagnosis of Diphtheria. J

Infect Dis 2000; 181(Suppl 1):S138–45.

3. Efstratiou A, Roure C and Members of the European Laboratory Working

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Diphtheria: A Global Microbiologic Network. J Infect Dis 2000; 181(Suppl

1):S146–S151

4. Chima J. Ohuabunwo, MBBS, FWACP; Kristine M. Bisgard, DVM, MPH;

Popovic T; Wharton M, in VPD Surveillance Manual, Chapter 1, Diphtheria,

3 rd. Edition, Centers for Disease Control, 2002.

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difteria. Copenhague: Programa Ampliado de La inmunización en la Región

Europea de la OMS, 1994. (ICP/EPI038 (C)).

6. Efstratiou A, Jorge RC. Microbiología y epidemiología de la difteria. Rev

Med Microbiol 1996; 7: 31-42.

7. Efstratiou A, RC George. Laboratory guidelines for the diagnosis of

infections caused by Corynebacterium diphtheriae and C. ulcerans.

Commun Dis Public Health 1999: 2(4): 250-7.

8. Stephen J, Pietrowski RA. Diphtheria toxin. In: Bacterial toxins, 2d. Edition.

Washington DC: American Society for Microbiology, 1986 pp 25-30.

9. Frobisher, M Jr Cystine-tellurite agar for C. diphtheriae. J. infect Dis 1937,

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10. Inserto del Sistema de identificación de bacterias corineformes api®

Coryne, Referencia 20 900, bioMérieux SA. Año 2009/2010, español, pp 1-

4.

11. Secretaría de Salud. Manual de procedimientos estandarizados para la

Vigilancia Epidemiológica de la Enfermedades prevenibles por vacunación.

Secretaría de Salud, Subsecretaria de Prevención y Promoción a la Salud,

Dirección General Adjunta de Epidemiología Septiembre de 2012: 109-121.

12. Infecciones Respiratorias Agudas 2012., SINAVE/DGE/salud/notificación

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13. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal

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14. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement/Vol.

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15. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of

Infectious Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miller%20MJ%22%5BAuthor%5D

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17. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory

biorisk management standard. Brussels: CEN; 2011.

18. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual–3rd ed. Geneva:

WHO Press; 2004.


ANEXO I: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS

Técnicas para el aislamiento de Corynebacterium diphtheriae:

Cultivo

Para aislar C. diphtheriae se aprovecha su capacidad para crecer en medios de

cultivo a base de proteínas coaguladas como albúmina bovina, o de huevo, por lo

que se recomienda el empleo de este tipo de medios que favorecen el desarrollo de

las corinebacterias. Si la muestra sospechosa se inocula en medios como el de PAI y

de Loeffler y se incuba por 6 a 8 horas, la flora acompañante es inhibida,

facilitando la proliferación de C. diphtheriae, pero si se prolonga la incubación, esta

flora se multiplica rápidamente y dificulta el aislamiento del microorganismo.

Estos medios se emplean por lo general para el transporte de la muestra biológica.

Otra característica de las corinebacterias que puede facilitar su aislamiento es su

capacidad para reducir el telurito de potasio. C. diphtheriae crece en medios con

esta sal y forma colonias grises o negras. No es la única bacteria que lo hace pero sí

se reduce notablemente el número de especies que se desarrollan en estas

condiciones. Una vez recibida en el laboratorio se debe de resembrar en los medios

específicos y selectivos para el aislamiento como agar sangre cistina telurito, este

medio contiene 0.3% de telurito de potasio, que sirve para inhibir el desarrollo de

muchas especies bacterianas de la flora normal del tracto respiratorio superior.

También para el primo-aislamiento se puede utilizar el medio de Tinsdale que es

un medio selectivo para el crecimiento de Corynebacterium diphtheriae.

Identificación presuntiva de C. diphtheriae y C. ulcerans

Los medios mínimos necesarios para realizar una identificación presuntiva de

corinebacterias toxigénicas son agar sangre de carnero al 5% (ASC), agar sangre

telurito de potasio, medio de Tinsdale y pruebas bioquímicas para pirazinamidasa,

hidrólisis de la urea (ureasa) hidrólisis y la reducción del nitrato. En el laboratorio

los criterios que se deben de informar para un aislamiento presuntivo C.

diphtheriae y C. ulcerans son los siguientes:

Bacilos Gram positivos.

Catalasa positivo.

Urea negativo para C. diphtheriae, positivo para C. ulcerans.

Nitrato positivo excepto el biotipo var belfanti

Pirazinamidasa negativo.

Cistinasa negativo.

Las pruebas de pirazinamidasa y cistinasa son útiles para diferenciar entre

las especies potencialmente toxigénicas y otros corineformes.

Si no se dispone de pruebas de detección rápidas (enzimáticas), se recomienda

utilizar las pruebas bioquímicas convencionales.


Estos microorganismos, catalasa positiva, se someten a las pruebas de

fermentación de la glucosa, sacarosa, almidón y se determina su actividad

hemolítica para confirmar la especie C. diphtheriae y su variedad (ver cuadros 3 y

4). Para la fermentación de glucosa, sacarosa y almidón se utiliza el caldo rojo de

fenol o base de CTA, con los substratos al 1%.

Las características bioquímicas de las corinebacterias potencialmente toxigénicas

son cuatro biotipos: C. diphtheriae, C. ulcerans y C. pseudotuberculosis y otras

bacterias corineformes que pueden encontrarse en la garganta o en una herida. Las

características bioquímicas se describen en el cuadro 3. Las corinebacterias no

toxigénicas que se han encontrado con mayor frecuencia son C. amycolatum, C.

pseudodiphtheriticum y C. striatum.

Cuadro 3.- Identificación bioquímica de las corinebacterias de importancia clínica Especie CYS PYZ Nitrato Urea Glucosa Maltosa Sacarosa Glucógeno

C. diphtheriae Var gravis + - + - + + - + Var mitis + - + - + + - - Var intermedius + - + - + + - - Var belfanti + - - - + + - - C. ulcerans + - - + + + - + C. pseudotuberculosis + - - + + + - - C. amycolatum - + V V + V V - C. imitans - +/- - - + + +/- - C. pseudodiphtheriticum

- v + + - - - -

C. striatum - + + - + - V -


Cuadro 4.-Características de las variedades de Corynebacterium diphtheriae Existen equipos comerciales para la identificación de C. diphtheriae, C. ulcerans y

con una adecuada precisión. El API Coryne (BioMerieux, Francia) fue el primer kit

comercial que fue lanzado en el año de 1991 y está siendo utilizado periódicamente

por los laboratorios de Referencia Internacional como los del Reino Unido y del

CDC de Atlanta EEUU.

La identificación de C. diphtheriae, por este sistema es confiable y es una excelente

alternativa en caso de no contar con los métodos convencionales.

Pruebas de toxigenicidad de las cepas aisladas

Una vez aislado el microorganismo es necesario cultivarlo en un medio libre de

hierro para determinar la toxigenicidad de la cepa, ya que incluso bajas

concentraciones de este elemento son capaces de inhibir la producción de toxina.

La capacidad toxigénica de las cepas se puede determinar por dos tipos de pruebas

de laboratorio: una in vivo, de gran sensibilidad, que se puede realizar en conejo o

en cobayo y otra in vitro, que es en cultivo celular o en caja de Petri. La prueba in

vivo puede ensayarse con diversas variaciones, la recomendada es en conejo, el

cual se inocula por vía subcutánea con un extracto del cultivo en estudio.

Posteriormente es protegido con antitoxina diftérica endovenosa y de nuevo es

inoculado a los 20 a 30 minutos más tarde en un sitio cercano a la primera

inoculación. Se busca la presencia de una zona dermonecrótica en el lugar de la

primera inoculación, en contraste con el aspecto sano o no necrótico del segundo

sitio inoculado después de la aplicación de la antitoxina. Es recomendable que las

cepas ensayadas tengan más de 48 horas de incubación, ya que la toxina se produce

en la fase de crecimiento estacionario.


La prueba in vitro se basa en la formación de un precipitado de complejos antígeno

anticuerpo en un agar nutritivo sin hierro. El agar se vacía en una caja de Petri que

contiene una tira de papel filtro impregnada con antitoxina diftérica (500 UI/mL),

al solidificarse se siembra en la placa las cepas de manera transversal como se

colocó el papel con la antitoxina. Se incuba durante 72 horas a 37 °C y dos días más

en refrigeración. Se forman líneas visibles en un ángulo de 45° con respecto a la tira

de papel filtro y la estría de cultivo.

Figura 6. Diagrama de flujo para el aislamiento e identificación de

Corinebacterias toxigénicas.

Equipo y reactivos requeridos

Material

Asa bacteriológica

Mechero bunsen

Tira de papel filtro

Jeringa

Tijeras

Marcador de tinta indeleble

CT

ASC

Prueba de catalasa

A las colonias formadas

porbacilos Gram positivos

Inocular la muestra en agar

Sangre de carnero (ASC)

y agar cistina telurito (CT)

Exudado de faringe

Nasofaringe ó piel

Medios de transporte

de PAI, Loefflero AMIES

Tinción de Gram

Selección de colonias con base en su

Morfología colonial en medio

Cistina telurito

Purificar las

colonias

seleccionadas (de 5

a 10 de cada

morfotipo

diferente)

Pruebas bioquímicas

fermentación de:

Glucosa

Maltosa

Sacarosa

Almidón, Ureasa, y Red. NO3 Pruebas de toxigenicidad

In vivo (conejo)

In vitro (Eleck)cultivo en medio

con baja conc.

de Fe.

DIFERENCIACION DE ESPECIES

BIOQUIMICA CONVENCIONAL SISTEMA API CORYNE

Prueba de

pirazinamida

(4 horas)

Negativa Positiva

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE

Corynebacterium diphtheriae toxigénico


Portaobjetos

Hoja de resultados

Ficha técnica

Equipo

Incubadora con rango de temperatura de 35 a 38 °C

Refrigerador con un rango de temperatura de 4 a 6 °C

Cámaras de incubación

Reactivos

Antitoxina diftérica de 500 UI/mL

Caldo Infusión cerebro corazón más maltosa al 0.3%

Colorantes y reactivos para la tinción de Gram

Medio de Loeffler o PAI

Medio de agar sangre-cistina telurito al 0.03%

Medio de Elek

Tubos con 0.25 mL de pirazinamida

Galerías API Coryne

Ampollas API G Medium

Ampollas Suspensión Medium de 3mL

Programa informático de identificación API WEB™ Anywhere

NIT 1, + NIT 2

ZYM A

ZYM B

PYZ

Aceite de parafina

Peróxido de hidrógeno

DENSIMAT o Ampolla de McFarland tubo número 6

Peróxido de hidrógeno diluido 1:10 vol/vol

Sulfato ferroso de amonio al 20%

Procedimiento analítico

A. Aislamiento de Corynebacterium diphtheriae (Fig. 6)

1. Sembrar las muestras o cepas en medios de PAI o de Loeffler y se incuban a

temperatura ambiente durante 6 a 8 h. En estos medios la flora

acompañante retrasa su crecimiento favoreciendo el desarrollo de

Corynebacterium diphtheriae y otras Corinebacterias, pero si la incubación

se prolonga la flora se multiplica rápidamente dificultando el aislamiento de

la bacteria.


2. Resembrar el crecimiento obtenido en el medio de transporte, en agar

sangre-cistina telurito (ASCT) y agar sangre de carnero al 5% (ASC),

utilizando el método de estría cruzada para aislar colonias, incubar a 37 °C

durante 24 a 48 h, el microorganismo crece formando colonias de color gris

o negras en ASCT.

3. A partir de las colonias de color gris o negras de 1 a 3 mm de diámetro,

preparar un frotis y teñir por la técnica de Gram.

4. Si las colonias seleccionadas están formadas por bacilos Gram positivos

frecuentemente se observan en empalizada, realizar la prueba de catalasa,

(ver anexo II).

5. Las características bioquímicas de las variedades de C. diphtheriae que

pueden estar asociadas a casos de difteria se muestran en los cuadros 3 y 4.

Diferenciación de especies

Pruebas bioquímicas convencionales

Estos microorganismos catalasa positivos se someten a las pruebas de

fermentación de la glucosa, sacarosa, almidón y se determina su actividad

hemolítica para confirmar la especie C. diphtheriae y su variedad (ver cuadro 3).

Para la fermentación de glucosa, maltosa, sacarosa y almidón se usa caldo rojo de

fenol, con los carbohidratos al 1%.

1. Los medios se incuban en aerobiosis a 35 °C, se examinan diariamente y se

descartan si no hay cambio hasta las 72 horas.

2. Tomar una colonia sospechosa bien aislada e inocular de forma masiva en

una placa de ASC incubarla de 24 a 48 h a 37 °C.

3. Si se utilizan la galería API Coryne desarrollar el siguiente procedimiento.

Sistema api®Coryne (Fig. 6)

Preparación de la Galería

1. Colocar en la base de la cámara de incubación aproximadamente 5 mL de

agua destilada o desmineralizada, llenando todos los pozos de la cámara,

para crear una atmósfera húmeda.

2. Rotular la lengüeta de la parte lateral de la base de la cámara con el número

de registro de la cepa.

3. Sacar una galería de su envase individual y colocarla en la cámara de

incubación.


Preparación del inóculo

4. Abrir una ampolla de API Suspensión Medium.

5. Con ayuda de un hisopo de rayón o dacrón cosechar el crecimiento de la

placa de ASC; utilizar cultivos jóvenes de 24 a 48 horas de incubación.

6. Realizar una suspensión de turbidez mayor al tubo No. 6 del nefelómetro de

McFarland; la cuál debe ser utilizada inmediatamente después de su

preparación.

Inoculación de la galería

7. En las once primeras pruebas de la galería (desde NIT a GEL) repartir la

suspensión evitando la formación de burbujas, inclinando la cámara de

incubación hacia adelante y colocar la punta de la pipeta sobre el lateral de

la cúpula.

8. Se inoculan de 100 a 150 L de la suspensión desde las pruebas de NIT a

ESC Para la prueba de URE llenar únicamente el tubo.

Para la prueba de GEL llenar el tubo y la cúpula.

Para inocular las últimas nueve pruebas de la galería (pruebas desde 0 a

GLYG): Abrir una ampolla API GP Medium y transferir el resto de la

suspensión original (Aproximadamente 0.5 mL) y homogenizar bien.

Repartir esta nueva suspensión en los tubos únicamente.

9. Llenar las cúpulas de las pruebas marcadas con URE, 0 a GLYG con aceite

de parafina formando un menisco convexo.

10. Cerrar la cámara de incubación.

11. Incubar las galerías por 24 horas (± 2 horas) a 36 ± 2 °C en aerobiosis.

12. Después de la incubación, agregar los reactivos:

Prueba NIT: una gota de NIT 1 y una gota de NIT 2

Prueba PYZ: una gota de PYZ

Pruebas PyrA, PAL, βGUR, βGAL, αGLU, βNAG: Una gota de ZYMA

y ZYMB.

Lectura de la galería

13. Esperar 10 minutos y después leer todas las reacciones consultando el

cuadro 5.


NEGATIVO POSITIVO

incoloro

rosa muy pálido

rosa intenso

rojo

incoloro

marrón muy pálido

naranja muy pálido

marrón

naranja

incoloro

naranja pálido naranja

PAL 2-naftil-fosfato 0.0244 Fosfatasa Alcalina

incoloro

beige-púrpura pálido

naranja pálido

púrpura

βGURácido-naftol-ASBI-

glucurónico0.0548 β-GlucURonidasa

incoloro

gris pálido

beige pálido

azul

βGAL 2-naftil-βD-

galactopiranosida0.0312 β-GALlactosida

incoloro

beige-púrpura pálido púrpura

∝ GLU2-naftil-αD-

glugopiranosida0.0308 α-GLUcosidasa

incoloro


verde pálido

púrpura

βNAG1-naftil-N-acetil-βD-

Glucosaminida0.0348 N-Acetil-β-Glucosaminidasa

incoloro


marrón- pálido

gris pálido

marrón

ESCEsculina citrato

férrico

0.546

0.078β-Glucosidasa (ESCulina)

incoloro

grisnegro

URE urea 0.76 UREasaamarillo

naranja

rojo

rosa

GELgelatina (origen

bovino)0.6 Hidrolisis (GELatina)

sin difusión del

pigmento negro

difusión del pigmento

negroO Testigo negativo - Fermentación

GLU D-glucosa 1.56 Fermentación (GLUcosa)

RIB D-ribosa 1.4 Fermentación (RIBosa)

XYL D-xilosa 1.4 Fermentación (GILosa)

MAN D-manitol 1.36 Fermentación (MANitol)

MAL D-maltosa 1.4 Fermentación (MALtosa)

LACD-lactosa (origen

bovino1.4 Fermentación (LACtosa)

SAC D-sacarosa 1.32 Fermentación (SACarosa)

GLYG glicógeno 1.28 Fermentación (GLIcógeno)

ausencia de burbujas presencia de burbujas

TABLA DE IDENTIFICACIÓN

H2O2 (3 %) / 1 minCATalasa -(ensayo ESC o GEL )CAT

rojo amarillo

naranja amarillo-anaranjado

ZYM A + ZYM B(PyrA → βNAG) / 10 min

PYRAácido piroglutámico-

β-naftilamida0.0256 PIRolidonil Arilamidasa

NIT 1 + NIT 2 / 10 min

NIT nitrato potásico 0.136 reducción de NITratos

PYZ / 10 min

PYZ pirazina carboxamida 0.56 PiraZinamidasa

ENSAYOS COMPONENTES

ACTIVOS

CANT

(mg/cúp.)REACCIONES/ENZIMAS

RESULTADOS

Cuadro 5. Identificación api®Coryne

Si fuera necesario, exponer la galería bajo una lámpara de 1000 W durante 10

segundos para decolorar el exceso de reactivo en los tubos PyrA al βNAG.

Figura 7.- Pruebas positivas y negativas con cepas de referencia para las galerías

apiCoryne.


14. Anotar todas las reacciones en la hoja de resultados.

Figura 8.- Hoja de resultados del Sistema api®Coryne

15. Interpretación: la identificación se obtiene a partir del perfil numérico.

16. Determinación del perfil numérico:

En las hojas de resultados, las pruebas están separadas en grupos de

tres y se asigna para cada uno un valor 1, 2, o 4. Sumando en el

interior de cada grupo los números que corresponden a reacciones

positivas, se obtienen 7 cifras que constituyen el perfil numérico, a la

reacción de la catalasa que constituye el ensayo No. 21, le

asignaremos el valor 4, cuando resulte positiva.

17. Identificación. Se realiza a partir de la base de datos (V3.0).Esta se realiza

por medio de un software de identificación apiweb™.


18. Introducir manualmente con el teclado el perfil numérico de 7 cifras y

validar

Automáticamente el sistema arroja el resultado de la identificación con el

porcentaje de concordancia correspondiente.


Prueba de la pirazinamidasa (Fig. 6)

La prueba de pirazinamida es una prueba rápida que nos permite diferenciar las

corinebacterias patógenas (C. diphtheriae, C. pseudotuberculosis y C. ulcerans) de

otras especies de corinebacterias.

Procedimiento

1. Distribuir 0.25 mL de solución de pirazinamida en tres criotubos estériles.

2. Preparar una suspensión densa, a partir de un cultivo puro crecido en agar

sangre. Preparar suspensiones densas para los controles positivo y negativo

en los otros dos criotubos.

3. Incubar a 37 °C por 4 horas o toda la noche.

4. Después de la incubación adicionar una gota del reactivo PYZ (sulfato

ferroso de amonio 20%) a cada suspensión.

Pruebas de toxigenicidad (Fig. 6)

1. Para determinar la toxigenicidad, cultivar las colonias catalasa positivas en

un medio libre de iones fierro (BHI más maltosa al 0.3%), ya que, aún a

bajas concentraciones de este elemento pueden inhibir la producción de

toxina.

2. La producción de toxina se puede determinar por dos tipos de pruebas de

laboratorio: una in vivo que se realiza en conejo o en cobayo, y otra in vitro o

prueba de Eleck que se efectúa en caja de Petri.


Procedimiento in vivo.

1. A partir de un cultivo puro de Corynebacterium diphtheriae (muestra

problema) y dos cepas control (positivo y negativo), se inoculan estas por

separado en un tubo con 10 mL de caldo BHI más maltosa al 0.3% (pH 7.8 a

8.0) y se incuba a 35 °C por 72 h.

2. Rasurar el dorso y los flancos de un conejo blanco (Nueva Zelanda) o de un

cobayo de pelaje claro. Después de eliminar el pelo, se marcan en la piel

cuadros de 2 cm2 (mínimo 3 cuadros por ambos lados del dorso) con un

marcador de tinta indeleble.

3. Con una jeringa graduada en décimas de mililitro, y aguja de 1 cm, calibre

24, se toma de 1 a 2 mL del cultivo en caldo a probar.

4. Se inocula al animal con 0.2 mL de caldo por vía intracutánea en un cuadro

de cada lado. El cuadro siguiente al sitio de la inoculación, se utiliza para

inyecciones de los testigos positivo y negativo. Se mantienen refrigeradas las

jeringas que contienen el resto de las suspensiones en caldo.

5. Cinco horas después de las inoculaciones, se administran al animal 500 UI

de antitoxina diftérica por vía intraperitoneal si se usó cobayo, o en la vena

marginal de la oreja si fue un conejo.

6. Después de 30 minutos, con el contenido de la jeringa que se guardó en

refrigeración se inoculan 0.2 mL de caldo de cultivo por vía intracutánea en

el cuadro inmediatamente debajo del sitio de la prueba.

7. Las lecturas preliminares se hacen a las 48 h y las lecturas finales a las 96

horas.

Procedimiento in vitro (Prueba de Elek)

1. En 10 mL de agar virulencia KL (Difco), precalentado a 55 °C en baño maría,

se añaden 2 mL de suero estéril de conejo y 1 mL de telurito de potasio al

0.3%.

2. Con una pipeta, se transfieren 10 mL de medio a una placa de Petri y se

mezclan bien, rotándola unas 20 veces.

3. Antes de que el medio solidifique, se coloca una tira de papel de filtro de 1

por 8 cm saturada con antitoxina diftérica (diluida hasta contener 100

unidades de antitoxina/mL).

4. Se deja solidificar el medio y la placa se coloca en la incubadora con la tapa

entreabierta para que se evapore la humedad superficial.

5. La placa se inocula durante las primeras 2 h de haberse secado, con un

cultivo de 24 h de una cepa conocida de C. diphtheriae productora de toxina,

trazando con el asa una estría en forma perpendicular a la tira de antitoxina.

De igual modo se inocula una cepa control negativa.

6. Los cultivos problemas desconocidos se siembran igual en estrías paralelas a

las de los cultivos testigo.


7. Se incuba la placa durante 24 a 48 h a 35 °C.

Los resultados de la identificación bioquímica y de la producción de toxina se

anotan en la libreta de registro cepas varias.

Interpretación de resultados

Control de calidad

El control interno del método se realiza a través de ensayos de repetitividad y

reproducibilidad, utilizando cepas de referencia trazables a las de American Type

Culture Collection (ATCC).

En bacteriología se incluyen controles internos con cierta periodicidad

dependiendo de las siguientes situaciones:

Cuando se emplea un lote de nuevos reactivos, colorantes y medios de

cultivo.

Cuando se empleé un nuevo equipo o kit comercial con la frecuencia que

indique el fabricante y con los controles que proporcione el equipo o kit de

prueba.

Interferencias: Cantidad de microorganismos presentes en la muestra, y/o

pureza de la cepa.

Intervalo biológico de referencia: Negativo a C. diphtheriae, C. ulcerans o C.

pseudotuberculosis

Intervalo reportable: Presencia (positivo) o ausencia (negativo) de C.

diphtheriae, C. ulcerans o C. pseudotuberculosis.

Positivo: Desarrollo y confirmación bioquímica de C. diphtheriae, C. ulcerans o C.

pseudotuberculosis a partir de aislamientos de muestras clínicas o cultivos puros.

Negativo: Ausencia de desarrollo de C. diphtheriae, C. ulcerans o C.

pseudotuberculosis.

Cepa no viable: Aplica para aquellas cepas enviadas para control de calidad o

referencia, que no desarrollan en los medios de cultivos inoculados a las 72 horas

de incubación.

Valores de alerta críticos: Presencia de Corynebacterium diphtheriae

toxigénico


Interpretación por el laboratorio

Bacilo Gram positivo

Catalasa positiva.

Urea negativa para C. diphtheriae, positiva para C. ulcerans

Nitrato positivo (excepto el biotipo var belfanti).

Pirazinamidasa negativa.

Cistinasa negativos (ver cuadro 3).

En caso de no haber desarrollo de colonias sugestivas de C. diphtheriae, C.

ulcerans, posterior a 72 horas de incubación, el cultivo se considera como negativo.

Medidas de bioseguridad

Se procede con base en las reglas básicas de seguridad correspondientes al nivel II

de bioseguridad que se especifican en el Manual de Bioseguridad editado por el

InDRE. Uso de equipo de protección personal (GABI-P-20).

Descartar todo el material desechable de acuerdo al procedimiento de manejo

interno de RPBI (GABI-P-05) manejo de punzocortantes GABI-I-04 que forman

parte del manual de bioseguridad del InDRE.

Fuentes de variabilidad

Etapa pre analítica

o La toma inoportuna y el manejo inadecuado de muestras son fuentes

potenciales de variabilidad.

Etapa analítica

o Los medios de cultivo y reactivos son fuentes potenciales de

variabilidad por ello se lleva a cabo el control de calidad con cepas de

referencia.

o La inadecuada interpretación de las pruebas confirmatorias

observación de aglutinación pueden generar resultados falsos

positivos, lo cual está directamente relacionado con la experiencia y

pericia visual del analista.


ANEXO II. PRUEBAS DIFERENCIALES DE CATALASA Y OXIDASA

Catalasa

Principio

La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en

agua y oxígeno. Es una hemoproteína de estructura similar a la hemoglobina,

excepto porque los cuatro átomos de hierro de su molécula están en el estado

oxidado (Fe³) en lugar del estado reducido (Fe²). Excepto los estreptococos, la

mayor parte de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad

catalasa.

El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales de oxidación

del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se permite que se acumule,

resulta letal para las células bacterianas. La catalasa peróxido de hidrógeno en agua

y oxígeno según la siguiente reacción:

2 H2O2―――> 2 H2O + O2 (burbujas de gas)

La prueba de catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar miembros de la

familia Micrococcaceae de miembros de la familia Streptococcaceae.

Reactivos

Peróxido de hidrógeno al 3% almacenado en botellas color ámbar.

Un cultivo de 18 a 24 horas del microorganismo a probar.

Controles

El reactivo peróxido de hidrógeno se debe probar con microorganismos control

negativos y positivos, todos los días o inmediatamente después de probar bacterias

desconocidas.

Positivo: Staphylococcus aureus

Negativo: especies de Streptococcus ssp

Procedimiento

1. Con una aguja de inoculación o con un palillo de madera, transferir parte del

centro de una colonia a la superficie de un portaobjetos.

2. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% y observar la formación de

burbujas.

Interpretación

La aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia constituye una reacción

positiva. Debido a que algunas bacterias poseen enzimas distintas de la catalasa

que pueden descomponer el peróxido de hidrógeno, la observación de unas pocas

burbujas pequeñas después de 20 a 30 segundos no se considera un resultado

positivo. Además, los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual debe tener cuidado de

no tomar eritrocitos junto con el material de la colonia.


Oxidasa

Principio

La prueba de oxidasa determina la presencia de la enzima citocromo oxidasa, la

oxidasa cataliza la transferencia de iones de compuestos donadores a receptores,

generalmente oxígeno. El sustrato en esta prueba, para-fenilendiamina

dihidroclorada, actúa como un receptor artificial de iones, y cuando es oxidado,

forma un compuesto colorido, indofenol.

Empleando otro reactivo, el tetrametil, para- fenilendiamina dihidroclorada, que es

menos tóxico pero más caro, una pigmentación que varía del azul al morado.

Para-fenilendiamina dihidroclorada 0.1 g

Agua destilada 10 mL

Procedimiento:

1.-Tomar una asada del crecimiento bacteriano con asa de plástico o de platino o

con la punta de una pipeta Pasteur y colocarla en un papel filtro previamente

impregnado con el reactivo (dejar secar el papel antes de depositar el inóculo).

Usar como control positivo: Moraxella catarrhalis y como control negativo:

Escherichia coli

Observación:

No usar asa de níquel cromo para evitar un falso positivo

Lectura de la prueba: Una reacción positiva es cuando se desarrolla un color

púrpura en 10 segundos.


ANEXO III. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

PARA MÉTODOS BACTERIOLÓGICOS

Medios de cultivo

Agar sangre de carnero al 5%

Agar cistina telurito

Medio Elek

Medio de transporte de AMIES

Medio de transporte de PAI

Caldo BHI con maltosa al 0.3%

Base de Caldo Rojo de Fenol con carbohidratos al 1%

Medio de Movilidad–nitritos

Urea de Christensen

Caldo Mueller-Hinton con sangre lisada de caballo

Agar bilis esculina

Caldo maltosa al 0.3%

1. Agar Sangre de Carnero (ASC) al 5%

El agar sangre de carnero se utiliza como un medio general de agar sangre, y sirve

para el aislamiento, cultivo y detección de la actividad hemolítica de los

estreptococos y otros microorganismos exigentes.

Fórmula aproximada en gramos por litro

Base de agar sangre 40 g

Sangre desfibrinada de carnero estéril 50 mL


pH final de 7.3 +/- 0.2

Modo de Preparación:

1. Pesar 40 g de base de agar sangre (DIBICO) y disolver con 950 mL de agua

destilada como lo indican las instrucciones del fabricante y esterilizar a 15

libras de presión y 121 °C por 15 minutos.

2. Dejar enfriar el medio hasta aproximadamente 56 °C.

3. Adicionar 50 mL de sangre de carnero desfibrinada y mezclar.

4. Distribuir 25 mL del medio en placas Petri estériles de 15 mm x 100 mm.

5. Dejar solidificar a temperatura ambiente.

6. Incubar para prueba de esterilidad.

7. Almacenar en refrigeración hasta su uso.

Control de calidad


Pruebe con una cepa de referencia cada nuevo lote de placas de agar sangre

preparado fresco, para el crecimiento y la reacción hemolítica.

Microorganismo de

referencia

Incubación

Resultado Tiempo

Temperatura

°C

Atmósfe

ra

Streptococcus

pyogenes 18-24 h 35-37 Aeróbica

Crecimiento

con

hemólisis

Staphylococcus

aureus 18-24 h 35-37 Aeróbica Crecimiento

Almacenamiento y caducidad

Almacenar de 2-8 °C por 30 días, lejos de la luz directa, no utilizar si hay

señales de deterioro, contaminación o si la fecha de caducidad ha pasado. El

medio es sensible a la temperatura y a la luz, proteger de la humedad y el

congelamiento.

Precauciones

Es para uso diagnóstico, debe ser utilizado solamente por personal calificado y una

vez utilizado se descarta de acuerdo a la guía para manejo de los Residuos

Peligrosos Biológico Infecciosos (RPBI).

2. Agar Sangre Cistina Telurito (ACT)

Método para la preparación Agar Sangre Cistina Telurito empleado en el proceso

de aislamiento e identificación de Corynebacterium diphtheriae.

Fórmula por litro de agua destilada

Agar Infusión de cerebro y corazón 52 g

Telurito de potasio, solución al 0.3% 150 mL

L-Cistina 50 mg

Sangre de carnero 50 mL

Preparación del medio

1. Pesar 52 gramos de agar infusión cerebro y corazón y disolver con 800 mL

de agua destilada como lo indican las instrucciones del fabricante.

2. Esterilizar a 15 libras de presión, a 121 °C por 15 minutos.

3. Dejar enfriar entre 45 a 50 °C.

4. Mantener cuidadosamente esta temperatura mientras se realizan los

siguientes pasos.


Añadir en condiciones de asepsia la solución de telurito de potasio

(esterilizada antes en autoclave) y la sangre de carnero.

Mezclar y agregar la cistina en polvo, mezclar nuevamente y verter el medio

en placas de Petri estériles.

Nota: Agitar continuamente el matraz mientras se vierten en las placas de Petri ya

que la cistina no se incorpora totalmente a la solución.

Usos

El Agar Sangre Cistina-Telurito se utiliza para el aislamiento primario de

Corynebacterium diphtheriae. Posee ventajas en comparación con el medio de

Tinsdale, su preparación es sencilla y dura más. El telurito de potasio presente en el

medio inhibe el desarrollo de la mayoría de las bacterias que normalmente habitan

el tracto respiratorio superior, incluida la mayor parte de las cepas de

Staphylococcus y Streptococcus.

C. diphtheriae se desarrolla bien y produce colonias grisáceas o negras después de

24 a 48 horas de incubación. En forma ocasional las colonias de estafilococo no

inhibidas aparecen de color gris; sin embargo pueden diferenciarse con la

coloración de Gram.

Se distinguen tres biotipos de C. diphtheriae en agar sangre cistina-telurito.

Las colonias tipo gravis, son planas de color gris oscuro, con estrías radiales,

secas y de bordes irregulares

Las colonias del biotipo mitis son pequeñas, negras, brillantes, y convexas

con bordes lisos y aspecto húmedo

Las del biotipo intermedius son pequeñas planas, con centro negro y

elevado. El medio se inocula por el método de estría cruzada.

Control de calidad

Microorganismo

de referencia

Incubación

Resultado Tiempo

Temperatura

°C Atmósfera

Corynebacterium

diphtheriae 24-48 h 35-37 Aerobia

Colonias

negras


Las placas ya preparadas se pueden guardar a temperatura de 2 a 8 °C, lejos de la

luz directa, no utilizar si hay señales de deterioro, contaminación, proteger de la

humedad y el congelamiento.

Precauciones


vez utilizado se descarta como RPBI.


3. Medio de Elek

El medio de Elek se utiliza para determinar la toxicidad de Corynebacterium

diphtheriae in vitro.

Fórmula para preparar el medio base

Proteasa peptona 2.0 g

Agar bacteriológico 1.75 g

Cloruro de sodio Q. P. 0.25 g


Ajustar a pH = 7.8 y esterilizar a 15 lb/15 min

Fórmula aditivo o suplemento

Glicerina Q. P. 1.0 mL

Tween 80 1.0 mL

Bacto casaminoácidos 1.0 g


Preparación del medio

1. Mezclar el medio de cultivo en el agua destilada por agitación hasta perfecta

incorporación y esterilizar a 15 lb/15 min. Preparar una solución al 0.3% de

telurito de potasio y esterilizar a 15 lb/15 min.

2. Agregar el aditivo al 20% en el medio base y vaciar en placas de Petri, dejar

solidificar, colocar una tira de papel filtro impregnada con antitoxina

diftérica 500 UI, meter a prueba de esterilidad.

3. A veinte mililitros de aditivo se le agrega 80 mL de medio base, más 15 mL

de solución de telurito de potasio y por último se agrega un 1 mL de suero

fetal bovino al medio base.


Las placas ya preparadas se pueden guardar hasta por 7 días a temperatura de 2 a 8

°C y hasta por 30 días lejos de la luz directa, no utilizar si hay señales de deterioro,

contaminación o si la fecha de caducidad ha pasado, proteger de la humedad y el

congelamiento.

Precauciones


vez utilizado se debe de descarta como RPBI.

Preparación de tiras de papel filtro impregnadas con antitoxina diftérica

Procedimiento:

2. Recortar tiras de papel filtro de 8 cm x 0.5 cm.


3. Esterilizarlas en una caja Petri a 15 lb por 15 min.

4. Preparar una solución de antitoxina difteria a una concentración de 500

U.I/mL.

5. Impregnar con esta solución las tiras de papel filtro previamente

esterilizadas.

6. Dejar secar las mismas dentro de una caja Petri en la estufa.

7. Una vez secas sellar las cajas de Petri con parafilm

8. Guardar las tiras en refrigeración hasta el momento de su utilización.

4. Medio de transporte de Amies

Procedimiento:

1. Agregar 20 g del medio de transporte en 1000 mL de agua destilada.

2. Llevar a ebullición hasta la disolución completa del agar.

3. Distribuir 0.5 ml en tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca.

4. Agitar para mantener el carbón en suspensión homogénea.

5. Enroscar totalmente los tapones de los tubos ya llenos.

6. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

7. Agitar los tubos mientras se enfría para distribuir el carbón de forma

uniforme.

8. Conservarlos en un lugar fresco.

5. Medio de transporte de Amies con carbón activado en tubo con

hisopo de dacrón o rayón estéril integrado, con envoltura

individual.

EUROTUBO DATALAB

Este medio de transporte es proporcionado por el fabricante listo para utilizarse.

6. Medio de transporte de PAI

Huevo 500 mL

Agua destilada estéril 250 mL

Glicerol estéril 60 mL

Material requerido:

Dos vasos de precipitados de un litro estéril

Una varilla de vidrio estéril

Gasa estéril

Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca estéril

Huevos

1. Lavar el huevo con abundante agua y desinfectar con alcohol.


2. Abrir el huevo y depositar la yema y clara en un vaso de precipitados estéril.

Mezclar hasta homogenizar.

3. Colar el huevo a través de una gasa estéril y medir 500 mL de huevo.

4. Agregar en condiciones de esterilidad 250 mL agua destilada estéril, más 60

mL de glicerol y mezclar hasta homogenizar.

5. Distribuir 5 mL del medio en tubos de 16 x 150 mm estériles con tapón de

rosca.

6. Introducir los tubos al coagulador a una temperatura de 82 °C durante una

hora.

Nota: El coagulador se enciende desde un día antes para estabilizar la

temperatura entre 82 a 83 °C.


8. Almacenar en refrigeración hasta su uso. Si no es utilizado de inmediato el

medio ya preparado, colocarlo en bolsas de plástico y almacenarlo en

refrigeración por un tiempo máximo de 3 meses.

7. Caldo BHI con Maltosa al 0.3%

Caldo infusión cerebro corazón 37 g

Proteosa peptona 20 g

Maltosa 3 g


1. Pesar 37 g de infusión cerebro corazón, 20 g de proteosa peptona, 3 g de

maltosa y disolver todos los componentes con 1000 mL de agua destilada

como lo indican las instrucciones del fabricante y esterilizar 15 libras a 121°C

por 15 minutos.

2. Dejar enfriar al medio ambiente.

3. Distribuir 10 mL de medio en tubos de vidrio estériles con tapón de rosca de

16 x 100 mm.


5. Almacenar en refrigeración hasta su utilización.

Observación: Almacenarlo en refrigeración por un tiempo máximo de 2 meses.

8. Medio de movilidad nitritos

Los microorganismos pueden diferenciarse de acuerdo a su capacidad de

metabolizar ciertos sustratos. La capacidad de un microorganismo para reducir

los nitratos a nitritos es una característica importante que se utiliza para

identificar y diferenciar especies de muchos grupos; Neisseria, Moraxella,


bacilos Gram positivos aerobios, bacilos Gram negativos no fermentadores

entre otros.

Los microorganismos que reducen los nitratos tienen la capacidad de extraer

oxígeno de aquellos para formar nitritos y otros productos de reducción. La

presencia de nitritos en el medio de prueba se detecta por el agregado de α-

naftilamina y ácido sulfanílico, con formación de colorante rojo de diazonio,

el p-sulfobenzoato de α-naftiamina. La aparición de un color rosa a rojo

dentro de los 30 segundos después que se agregó un mililitro de los reactivos

A y B, indica la presencia de nitritos siendo la prueba positiva para la

reducción de nitratos. En caso de que no haya cambio de color agregar una

pequeñísima cantidad de polvo de zinc. La aparición de un color rosa a rojo

intenso indica que el nitrato ha sido reducido. En algunos casos el color

puede desaparecer de inmediato.

Uso

El medio de Movilidad-Nitratos se utiliza para la detección de motilidad y

reducción del nitrato.


Caldo nutritivo Extracto de carne

Peptona de caseína

3 g

5 g

Agar agar 3 g


Nitrato de potasio 1 g

pH final: 7.6 ± 0.1

Modo de Preparación

1. Disolver los ingredientes en 1000 mL de agua destilada y hervir hasta disolver.

2. Distribuir 3 mL del medio en tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca.

Esterilizar a 15 libras, 121 oC durante 15 minutos.

3. Dejar solidificar con los tubos en forma vertical a temperatura ambiente e

incubar para prueba de esterilidad.

4. Almacenar en refrigeración hasta su uso.

Control de calidad

Positivo: Escherichia coli, Moraxella catarrhalis

Negativo: Acinetobacter bawmannii, Streptococcus agalactiae



Los tubos preparados y bien sellados se pueden guardar en un refrigerador a

temperatura entre 2 a 8 °C, y lejos de la luz directa hasta por 6 meses, no

utilizar si hay señales de deterioro, contaminación o si la fecha de caducidad

ha pasado, proteger de la humedad y el congelamiento.

Ácido sulfanílico y alfa naftilamina para nitritos

Solución A

Ácido sulfanílico 0.8 g

Ácido acético 5N 100 mL

Disolver por calentamiento suave

Solución B

Alfa-naftilamina 0.5 g


Se puede utilizar también

NN, dimetil-1-naftilamina 0.6 g


Disolver por calentamiento suave

Precaución:

El alfa-naftilamina es carcinogénico y en el caso de NN, dimetil-1-naftilamina no se

ha demostrado tal efecto hasta el momento, es por ello que se deben de manejar

con cuidado, evitar formar aerosoles, pipetear o el contacto con la piel o mucosas.


Pruebas bioquímicas para determinar especie y variedad de C.

diphtheriae y otras especies

Fermentación de carbohidratos

1. Base de Caldo Rojo de Fenol

Peptona de caseína 10 g

Cloruro de sodio 5 g

Rojo de fenol 18 mg

Procedimiento:

1. Pesar 7.2 gramos de Base Caldo Rojo de Fenol y disolver en 540 mL de agua

destilada.

2. Calentar a ebullición hasta su disolución completa.

3. Dejar enfriar y ajustar el pH a 7.4 ± 0.2

4. Repartir el volumen total en seis matraces, conteniendo cada uno 90 mL.

5. Cerrar y esterilizar a 15 libras durante 15 minutos.

6. Sacar de la autoclave y dejar enfriar.

7. Agregar 10 mL de cada uno de los carbohidratos, previamente disueltos y

esterilizados por filtración, en cada uno de los 6 matraces que contienen la

base de caldo y homogeneizar.

8. Ya incorporados los carbohidratos mezclar y vaciar en tubos de ensaye

estériles un volumen de 3 mL.

Este procedimiento se repite para cada uno de los carbohidratos que se deseen

preparar

Nota: los carbohidratos deben estar a una concentración final del 1%

Preparación de la solución de carbohidratos:

Los carbohidratos utilizados para la diferenciación de especies del género

Corynebacterium spp son los siguientes:

Dextrosa, maltosa, sacarosa, manitol, lactosa, xilosa, ribosa y almidón.

1. Pesar un gramo de cada uno de los carbohidratos a probar.

2. Disolver en 10 mL de agua destilada.

3. Recoger el volumen con una jeringa de 10 mL.

4. Esterilizar por medio de filtración directamente en el matraz que tiene la

base de caldo rojo de fenol ya esterilizada.

5. Realizar el mismo procedimiento para cada uno de los carbohidratos.

Nefelómetro de Mc Farland

Organizar una serie de tubos de ensaye nuevos, con tapón de rosca, numerarlos de

la siguiente forma; 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Llenar los tubos con una solución


de Cloruro de bario anhidro al 1% en solución acuosa, y una solución fría de ácido

sulfúrico P. A. al 1%(v/v) según el siguiente cuadro.

Preparación de la escala de Mc Farland

Tubo # 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BaCl2 1%

(mL) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

H2SO4 1% (mL)

9.95 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0

Densidad Aproximada

de células (x 108/mL)

1.5 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

Densidad Aproximada

de células en

millones/mL

150 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000

Para utilizar la escala de Mc Farland, se debe agitar cada tubo previamente para

que el precipitado de sulfato de bario se resuspenda, promoviendo que la turbidez

sea homogénea.

Control de calidad:

Se debe verificar que la turbidez de cada uno de los tubos sea correcta, utilizando

un espectrofotómetro con una absorbancia de 625 nm.

La lectura del tubo No 0.5 de la escala de Mc Farland debe de encontrarse entre

0.08 a 0.10

Almacenamiento: mantener los tubos bien cerrados y sellados, con una cinta

adhesiva, a temperatura ambiente en un lugar oscuro y renovar cada 3 meses.

2. Agar bilis esculina

*Fórmula aproximada por litro. (DIFCO)

Extracto de res 3.0 g

Peptona 5.0 g

Esculina 1.0 g

Bilis de buey 40.0 g

Citrato férrico 0.5 g

Agar 15.0 g

*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.


Para uso de laboratorio

Al recibirlo, se debe guardar a temperatura entre 2 a 30 °C

Modo de preparación

1. Pesar y diluir según lo que indique el marbete; o hacer una relación de

acuerdo al volumen requerido.

2. Mezcle bien, y caliente hasta hervir por no más de un minuto, agitando con

frecuencia para disolver por completo el polvo, hay que evitar calentar

demasiado.

3. Ajustar el pH final a 6.6 ± 2.0

4. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Procedimiento de envasado requerido por el laboratorio:

Cuando el medio esté a una temperatura entre 40 °C hay que dosificarlo en

condiciones de esterilidad en un volumen de 3 mililitros en tubos de 13 x 100 mm.

Colocarlos con una inclinación de 20 a 30° hasta que solidifique.

3. Urea de Christensen


Peptona 1.0 g

Cloruro de sodio 5.0 g

Fosfato mono potásico 2.0 g

Urea 20.0 g

Rojo de fenol 12.0 mg

Agar 15 g


4. Ajustar el pH final a 6.8 ± 0.2

Algunas bacterias poseen la enzima ureasa que puede hidrolizar la urea con

producción de amoniaco de acuerdo a la siguiente reacción química:

Urea + 2H2O→CO2 + H2O +2NH3

El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio,

produciéndose alcalinización y aumento del pH del medio que se detecta por la

presencia de un indicador de pH en el medio.

Uso

El medio de urea se utiliza para determinar la capacidad de diferentes

microorganismos tanto Gram positivos y negativos para hidrolizar la urea debido a

la producción de la enzima ureasa.


Modo de preparación:

Siga las instrucciones del fabricante para la preparación del medio de urea.

1. Disolver 29 g del polvo en 100 mL de agua purificada, mezclar bien y

esterilizar por filtración.

2. Suspender 15 g de agar en 900 mL de agua purificada.

3. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

4. Después de esterilizada la base, mezclar bien y dispensar en tubos de ensaye

estériles y colocarlos inclinados hasta su solidificación.

Control de Calidad:

Positivo: Proteus spp

Negativo: Escherichia coli


Los tubos preparados y bien sellados se pueden guardar a temperatura entre

2 a 8 °C, y lejos de la luz directa hasta por 3 meses, no utilizar si hay señales

de deterioro, contaminación o si la fecha de caducidad ha pasado, proteger

de la humedad y el congelamiento.

Reactivos para la prueba de pirazinamidasa para

Corynebacterium spp por el método de colindal

1. Solución de pirazinamida

Sigma, número de catálogo 7136

Preparar una solución de 2 mg/mL en agua destilada

Esterilizar por filtración utilizando una membrana millipore de 0.45 µm

Dispensar un volumen de 0.25 mL en tubos estériles

Almacenar a -20 °C

Cepas Control

o Control positivo: Corynebacterium xerosis

o Control negativo: Corynebacterium ulcerans

2. Reactivo PYZ; Sulfato Ferroso de amonio

Preparar una solución al 20% peso/volumen en agua destilada estéril

Almacenar a -20 °C

lineamientos para la vigilancia epidemiológica de difteria ... - … · en el área de vigilancia...

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