ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTENAS

Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de pollo

PARTE I. EXTRACCIN Y PRECIPITACIN POR SALADO.

Las protenas se purifican mediante mtodos de fraccionamiento que sonuna serie de etapas independientes basadas en las diversas propiedadesfisicoqumicas de la protena de inters y que se usan para separarlasde manera progresiva de otras molculas.

Para qu queremos purificar protenas?

Conocer secuencias de aminocidos.

Establecer relaciones evolutivas.

Investigar la funcin biolgica.

Establecer relaciones estructura-funcin.

Aplicaciones teraputicas o biotecnolgicas

GUA PARA PURIFICAR UNA PROTENA

Definir los objetivos de la purificacin

Pureza, actividad y cantidad.

Definir las propiedades de la protena de inters e impurezas.PM, pI, solubilidad, estabilidad. Componentes que puedan daar a las protenas (ej proteasas).

Seleccionar la fuente de protena.

Organismo, tejido, localizacin celular.

Desarrollar una tcnica de anlisis.

Para una deteccin rpida de la pureza, actividad y/ o contenido total de la protena de inters.

Minimizar el manejo de la muestra. Evitar procedimientos largos para evitar perder actividad biolgica.

Minimizar el uso de aditivos.

Usar lo mnimo necesario.

Eliminar los contaminantes.

Por ejemplo, las proteasas.

Usar una tcnica diferente en cada paso.

Con el fin de aprovechar al mximo las caractersticas de la muestra en el proceso de separacin.

Reducir el nmero de pasos. Los pasos extra reducen el rendimiento e incrementan el tiempo de purificacin.

Seleccionar la fuente de protenaLa eleccin de la procedencia de la protena debe basarse en criterios tales como:

a) la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se asla la protena

b) la cantidad de la protena de inters en el tejido y c) cualquier propiedad peculiar de la protena de inters, que ayudar en su

estabilizacin y su aislamiento.

Definir las Propiedades de la Protena de Inters

La informacin es til para detectar la protena a travs de SDS-PAGE, tambin es importante cuando seleccionamos un mtodode filtracin en gel.

Masa Molecular

El conocer el valor del pI puede ser utilizado con diferentes propsitos: precipitacin isoelctrica, seleccin de columna de intercambio inico, pH de trabajo.

Punto Isoelctrico

Afectada por temperatura, pH, fuerza inica. Esto debe ser considerado para evitar la agregacin y precipitacin de la protena. Tambin til para separacin.

Solubilidad

Hidrofobicidad e hidrofilicidad de la muestra, para elegir una columna de interaccin hidrofbica.Polaridad

Ligandos tiles para separar la protena por cromatografa de afinidad.Unin Especfica

En trminos de actividad, agregacin y composicin de subunidades. Las caractersticas fsicas y qumicas de la protena son importantes a lo largo del proceso.

Estabilidad

Caractersticas Procedimiento

Solubilidad 1. Salting in2. Salting out

Carga inica 1. Cromatografia de intercambio inico

2. Electroforesis

Polaridad 1. Cromatografa de adsorcin2. Cromatografa en papel3. Cromatografa en fase reversa4. Cromatografa interaccin

hidrfoba

Tamao molecular 1. Dialisis y ultrafiltracin2. Electroforesis en gel3. Cromatografa de filtracin en gel4. Ultracentrifugacin

Especificidad de unin 1. Cromatografa de afinidad

Tcnicas de purificacin/separacin de acuerdo a laspropiedades de las protenas

Fases de la Purificacin1. Fase I o fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y

estabilizar la protena de inters. Se deben de eliminar loscontaminantes crticos que comprometan la estabilidad dela protena. (Homogenizacin, centrifugacin)

2. Fase II o fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayorade las impurezas como otras protenas, cidos nuclicos,endotoxinas y virus. (Precipitacin selectiva)

3. Fase III o fase de perfeccionamiento, la mayora de lasimpurezas ya han sido removidas excepto aquellas queestn muy relacionadas con la protena de inters y que seencuentran en cantidades muy pequeas. El objetivo eslogar la mayor pureza posible. (Mtodos cromatogrficos)

FASE II.

Mtodos de

baja resolucin

Precipitacin con sales, solventes,

temperatura o pH

FASE III. Mtodos

de alta

resolucin

Mtodos cromatogrficos:filtracin en gel, intercambio inico,

afinidad

Mtodos electroforticos:electroforesis no desnaturalizante,

desnaturalizante

FASE I.

Mtodos de

baja resolucin

Homogenizacin, filtracin,

centrifugacin

Ruptura de la ClulaQu Propiedad de la Protena es Importante? ESTABILIDAD

Las protenas se desnaturalizan fcilmente a temperaturas elevadas, aunquealgunas se pueden desnaturalizar a 25C. La purificacin de las protenas debellevarse a cabo a 0C o temperaturas cercanas.

Suaves:Lisis celular (choque osmtico)Digestin enzimtica (lisozima)Lisis qumica (detergentes)Homogenizacin manualMolienda

Menos agresivos, previenen desnaturalizacin de la protena, pero no aseguran su liberacin celular.

MTODOS

Moderados:Homogenizacin con cuchillasMolienda abrasivaCongelamiento

Vigorosos:UltrasonicacinHomogenizador Manton-GaulinPrensa francesa

Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar protenas.

MTODOS

Ruptura de la ClulaQu Propiedad de la Protena es Importante? ESTABILIDAD

Buffer de Lisis

Debe mantener las condiciones apropiadas para mantener e incluso mejorar la estabilidad de la protena.

pH

Mantener un pH en el cual la protena es estable y se previene la precipitacin isoelctrica.

Fuerza Inica

Mantener una concentracin de sales adecuada para reducir las prdidas por precipitacin

Aditivos

Son componentes queprevienen la degradaciny mejoran la estabilidad.Se deben agregar solo sies necesario.

Aditivos

Fraccionamiento Celular: Centrifugacin Diferencial Eliminar contaminantes o clarificar la muestra

Separacin de los componentes con base en las diferencias en densidad, tamao y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada protena es diferente.

Partculas ms grandes y pesadas migran ms rpido.

Homogenizacin del tejido

Baja velocidad de centrifugacin

(1 000 g, 10)Baja velocidad de centrifugacin

(1 000 g, 10)

Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugacin

media

(20 000 g, 20)

Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugacin

alta

(80 000 g, 1 h)

Sobrenadante sujeto

a velocidad de

centrifugacin

muy alta

(150 000 g, 3 h)

Sobrenadante

contiene protenas

solubles

Tejido homogenado

Pellet, contiene

clulas completas,

ncleos, membranas

plasmticas

Pellet, contiene

mitocondrias,

lisosomas,

peroxisomas

Pellet, contiene microsomas

(fragmentos de RE), vesculas

pequeas

Pellet, contiene ribosomas, macromolculas

grandes

Centrifugacin Diferencial

Remover contaminantes y/o concentrar la muestraDespus de romper las clulas y estabilizar las protenas, elsiguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentesmtodos:

Ultrafiltracin

Precipitacin selectiva

Precipitacin selectivaQu propiedad de la protena es importante? SOLUBILIDAD Debido a que la protena contiene varios grupos cargados, la solubilidad es

sensible a la temperatura, el pH, la fuerza inica.

Si afectamos alguna de stos factores podemos disminuir o incrementar la solubilidad de la protena.

El mtodo ms comnmente empleado es la precipitacin por salado con (NH4)2SO4.

Sin embargo, tambin hay otros mtodosPrecipitacin con solventes orgnicos.Precipitacin isoelctrica.Precipitacin trmica.

PrecipitacinQu propiedad de la protena es importante? SOLUBILIDAD

Fuerza Inica

Log

(S/S

)

Precipitacin por saladoSolubilidad

Capa de

Hidratacin Salting in

Salting out

Concentracin de sal

Salting in: La solubilidad de una protena, a una concentracin baja de iones, aumenta a medida que se incrementa la concentracin de la sal.

Salting out: Las interacciones protena-protena se hacen ms fuertes que las interacciones protena-disolvente y la protena precipita.

La concentracin de sales requerida para alcanzar el efecto de salting out vara de acuerdo a las caractersticas de la protena

Precipitacin por salado

Precipitacin por salado

Concentracin final de sulfato de amonio (%)C

on

cen

trac

in

inic

ial d

e su

lfat

o d

e am

on

io (

%)

Gramos de sulfato de amonio que hay que aadir a 1 L de solucin

En la prcticaPurificacin de la lactato deshidrogenasa 1.1.1.27

Investigar:Propiedades de LDH de Gallus gallus

LDH A LDH BNmero de aminocidos

Peso molecular (Da)

Punto isoelctrico

Promedio general de

hidropaticidad (GRAVY)

Localizacin celular

Forma activa

Superfamilia

Tipo de enzima

Cofactor

Cmo vamos a purificar a la LDH de Gallus gallus?

Importante: Anotar los volmenes de las fracciones

Homogenizacin

1) 100 g de pechuga de pollo troceado (sin grasa ni tejido conectivo)2) Licuar en fro (3 Vol de Amortiguador por gramo de tejido, 3 pulsos/3 seg.)3) Filtrar mezcla en gasa. Tomar fraccin cero (F0)4) Centrifugar a 7,000 rpm 4 C 10 min. 5) Decantar sobrenadante y tomar fraccin 1 mL (F1)6) Guardar fracciones a -20C

Precipitacin por salado

1) 25 mL del sobrenadante en vaso de pp. 2) Agitar en hielo y aadir lentamente 8.15 g de sulfato de amonio (55 % de

saturacin)3) Centrifugar a 4C a 10,000 rpm 10 min. 4) Registrar volumen y tomar 1 mL fraccin 2 (F2) Guardar a -20C5) Realizar segunda precipitacin para llegar a 75 %, repetir pasos 2 y 36) Descartar el sobrenadante 7) Resuspender botn o pellet en 1 mL de agua8) Distribuir en 3 tubos, uno de ellos con 1 mL. Guardar a -20C