7/27/2019 Protocoloiii Elisa Elias e Pedro

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GUIA DEL PROFESOR

REACTIVOS SUMINISTRADOS

REACTIVOS CANTIDAD

ANTIGENNO 1 VIAL

ANTICUERPO PRIMARIO 1VIAL

SUSTRATO DE LA ENZIMAHRP(TEMB) 1BOTELLA

FOSFATO SALIO TAMPO(PBS)X10 1BOTELLA

TWEEN 20 10% I1BOTELLA

PASO 1:PREPARAR TAMPN

Pipeteamos 10ml de PBSx10 Lo pasamos al matraz de 100ml Enrasamos el matraz con agua destilada

TAMPON DE LAVADO

Medimos 90 ml de PBSx10 con unha probeta Lo pasamos a un matraz de un litro Cogemos con una pipeta 4.5ml de tween 20 10% Lo pasamos al matraz Enrasamos con agua destilada

PASO2:Rehidratar el antgeno ,los anticuerpos primarios y secundarios liofilizados.

Aadimos al antgeno con una micropeta 0.5ml de PBSx1(preparada en el paso1)

Aadimos al anticuerpo primario con una micropipeta 0.5ml de PBSx1(preparada en el paso1)

Aadimos al anticuerpo secundario con una micropipeta 0.5ml de PBSx1(preparada en el

paso1)

Retiramos con cuidado los tapones de los tres reactivos liofilizado, y usamos para adair una

punta de micropepeta nueva cada vez que aadimos los 0. 5ml de PBS.Cerramos los tapones yagitamos.Estas soluciones esta concentradas as 50x(reactivos stock)

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PASO3:DILUIR X50 LOS REACTIVOS DEL STOCK

Etiquetar una botella de 30 para cada una de las disoluciones que vamos a realizar.Utilizar una

punta de micro pipeta nueva cada vez que aadamos los diluciones madre de los reactivos

stock

ANTIGENO X1:etiquetamos una botella de 30ml aadimos con una probeta 24.5ml de PBSX1

aadimos con un micro pipeta (utilizando una punta de pipeta nueva),0.5ml de de antgeno

x50, cerramos y homogeneizamos.

SERUM X1:etiquetamos una botella de 30ml aadimos con una probeta 24.5ml dePBSX1 ,aadimos con un micro pipeta (utilizando una punta de pipeta nueva),0.5ml de

de antgeno x50, cerramos y homogeneizamos

ANTICUERPO SECUNDARIOX1:etiquetamos una botella de 30ml, aadimos con unaprobeta 24.5ml de PBSX1,aadimos con un micro pipeta (utilizando una punta de

pipeta nueva),0.5ml de de antgeno x50, cerramos y homogeneizamos,tenemos que

prepara la dilucin al menos 24h antes de la realizacin de la practica.

PASO CUATRO

Dispensar reactivos para los grupos de trabajo de los estudiantes

GUIA DEL ESTUDIANTE

1)Etiquetar de la siguiente forma:

Violeta azul muestra A muestra B

2) Usaremos una punta de pipeta fresa y dispensaremos 50 l de antingeno purificado (AG)

en los pozillos con que sea necesario.

Antgeno purificado

Esperaremos 5 minutos

despus de dispensar

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3) Aplicaremos un lavado en la tiras que sea necesario , haciendo esto de manera

automatica , simplemente utilizando la disolucin de lavado y introduciendo las tiras en la

maquina de lavado que ya se encarga de todo el proceso.

Violeta Azul Muestra A Muestra B

4) Usaremos una punta de pipeta fresa y dispensaremos 50 l de control o suero en los

pozillos con que sea necesario.

5) Aplicaremos un lavado en la tiras que sea necesario , haciendo esto de manera

automatica , simplemente utilizando la disolucin de lavado y introduciendo las tiras en la

maquina de lavado que ya se encarga de todo el proceso.

En este caso haremos dos lavados , pasaremos las tiras dos veces por la maquina de lavado.

WASH 2x

Violeta Azul Muestra A Muestra B

6) Usaremos una punta de pipeta fresa y dispensaremos 50 l de anticuerpo secundario en

los pozillos con que sea necesario.

Control del suero

Esperaremos 5 minutos

despus de dispensar

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7) Aplicaremos un lavado en la tiras que sea necesario , haciendo esto de manera

automatica , simplemente utilizando la disolucin de lavado y introduciendo las tiras en la

maquina de lavado que ya se encarga de todo el proceso.

En este caso haremos dos lavados , pasaremos las tiras tres veces por la maquina de lavado.

WASH 3x

Violeta Azul Muestra A Muestra B

8) Usaremos una punta de pipeta fresa y dispensaremos 50 l de encima del sustrato en los

pozillos con que sea necesario.

9) Ahora simplemente observaremos y registramos los resultados.

Anticuerpo secundario

Esperaremos 5 minutos

despus de dispensar

Encima del sustrato

Esperaremos 5 minutos

despus de dispensar