Sesiones de Residentes

Julio’11 PROTEINOGRAMA

martes 12 de julio de 2011Daniel E. PleguezueloMIR InmunologíaServicio de Inmunología Clínica

@dawelian

Introducción

características físicas:

- TAMAÑO- FORMA (3D)

- CARGA- PUNTO ISOELÉCTRICO

El Proteinograma es el resultado de la aplicación de la técnica de electroforesis a una solución con proteínas. Electroforesis es un método para separar sustancias al aplicar un campo eléctrico dependiendo de su tamaño, forma, carga y punto isoeléctrico

¿Pero cómo se mueven?

FUENTE DE ALIMENTACIÓN

INTENSIDAD CAMPO ELÉCTRICO

CARGA IÓNICAVsFRICCIÓN (TAMAÑO y VISCOSIDAD)

MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA

VELOCIDAD

D

E

MIGRACIÓN

Las proteínas se separan en función de las características enumeradas anteriormente, y lo hacen así porque éstas definen una diferente velocidad de migración, que depende de la intensidad del campo eléctrico y de la movilidad electroforética. Esta última es directamente proporcional a la carga iónica que presente la proteína e inversamente proporcional a las fuerzas de fricción: tamaño y viscosidad.

Hardware

Para realizar la técnica se necesita un aparato que conste de un gel (medio en el que se moverán las proteínas), tampón o buffer (que proporciona los iones y el pH para la separacíón de las proteínas), fuente de alimentación con dos electrodos, uno positivo y otro negativo, un peine para fabricar los pocillos y estos pocillos, donde se depositarán las muestras.

Variantes de Electroforesis

NATIVO

SDS

ISOELECTROENFOQUE

CAPILAR

2D

Nativo

En la electroforesis nativa se aplica un campo eléctrico sobre un medio con un pH definido (básico). Las proteínas, depositadas en los pocillos, se desplazarán en función de sus características físicas anteriormente enumeradas y podrán ser diferenciadas gracias a una técnica de tinción.

SDS-PAGE

http://www.youtube.com/watch?v=IWZN_G_pC8U

SDS es un compuesto químico que destruye la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas, otorgando a las proteínas una carga negativa proporcional al tamaño de las mismas. Al aplicar el campo eléctrico, las proteínas se separarán por tamaño.

Electroforesis Capilar

En la electroforesis capilar el medio en el que se separan las proteínas no es un gel sino un capilar artificial. A él llega la muestra mediante fuerzas hidrostáticas y se separarán también en función de sus características físicas, a lo largo del capilar.

Isoelectroenfoque

pHdel medio

H+

H+

H+

H+H+

H+

H+

PUNTO ISOELÉCTRICO

Las proteínas pueden tener carga global positiva, negativa o cero. En el Isoelectroenfoque las proteínas se separan en función de su capacidad para adquirir protones, que serán incorporados a los residuos aminoacídicos. Esta capacidad para ganar protones en un medio con un gradiente de pH, hará que las proteínas se desplacen hasta un punto en el que la carga neta de cada proteína sea cero, lugar en el que detendrá su movimiento por haber alcanzado su punto de equilibrio eléctrico.

Isoelectroenfoque

pHdel medio

H+

H+

H+

H+H+

H+

H+

pH < pI Proteína +

pH > pI Proteína - PUNTO ISOELÉCTRICO

¿Hacia dónde se mueven las proteínas? Si el pH en el que se encuentra la proteína es inferior a su punto isoeléctrico, la proteína estará cargada positivamente y se desplazará perdiendo protones hasta equilibrar sus cargas y quedar fija en el punto isoeléctrico.Si el pH del medio es mayor que el que define el punto isoeléctrico, la proteína se cargará negativamente.

Isoelectroenfoque

Proteínas en el Suero

Bandas del espectroelectroforético (abajo) y representación gráfica (arriba). La primera banda por la izquierda corresponde a la fracción de albúminas. La segunda a la de Alfa1, la tercera a Alfa2, la cuarta y quinta a Beta1 y Beta2 y la última por la izquierda a la fracción gamma.

Proteínas en el Suero

Albúmina

Deshidratación

Enfermedades HepáticasSíndrome Nefrótico

EmbarazoMalnutriciónHemorragiasEnteropatíasMalabsorcion

LESQuemaduras

analbuminemia

• Albúmina• Pre-Albúmina

Fracción Alfa-1

Reacción de Fase AgudaInfección, Inflamación, Fiebre, Neoplasias

EmbarazoDéficit de Alfa-1 Antitripsina

Enfermedades Hepáticas

• Alfa-1 Antitripsina• Alfa-1 Glicoproteína Ácida• Alfa-1 Fetoproteína• Alfa-1 Lipoproteína (HDL)• Transcortina• Proteína Fijadora de Tiroxina

RFA, 90%

CHC

Fracción Alfa-2

Reacción de Fase AgudaInfección, Inflamación, Fiebre, Neoplásicas

Insuficiencia adrenalTratamiento con esteroides

DM avanzadaSíndrome Nefrótico

EII

MalnutriciónAnemia Megaloblástica

Enteropatías pierde-proteínasEnfermedades HepáticasEnfermedad de Wilson

• Haptoglobina• Alfa-2 Macroglobulina• Ceruloplasmina• Alfa-2 Lipoproteína (VLDL)• PCR*

Cu, RFA

SdNFoRFA

Fracción Beta-1 y 2

HipotiroidismoCBP

Ictericia ObstructivaDiabetes Mellitus

Enfermedad de CushingPAN

Transferrina: Anemia FerropénicaTransferrina: Embarazo (3T)

HipocolesterolemiaEnfermedades Renales(malnutrición proteica)

• Transferrina

• Hemopexina

• Beta- 1Lipopróteína

• C4

• Fibrinógeno• Beta-2 Microglobulina

• Beta-2 Glicoproteína

• Fibronectina

• C3• Lactógeno Placentario

↓HbHLA, IRn

RFA

RFA

SAF

SdNFo

RFA

Fracción Gamma

AmiloidosisInfecciones crónicas granulomatosas

LLCCirrosis

Enfermedad de HodgkinLinfomas

Mieloma MúltipleConectivopatías

Macroglobulinemia de Waldenstrom

AgammaglobulinemiaHipogammaglobulinemia

GAMMA-1:• IgA• IgA s• IgD

GAMMA-2:• IgM• IgG• IgE

Reacción Inflamatoria

Reacción Inflamatoria

Sd. Nefrótico & Cirrosis

Sd. Nefrótico & Cirrosis

Gammapatías

Monoclonal Policlonal

Gammapatías

Déficit Alfa-1 Antitripsina

Enfermedad de Wilson

Normal Enf. Wilson

Bisalbuminemia

Bisalbuminemia

Referencias

O’CONNELL T et Al. Understanding and Interpreting Serum Protein Electrophoresis. American Family Physician. January 1, 2005. Volume 71, Number 1. http://www.aafp.org/afp/2005/0101/p105.html

DYE ELECTROPHORESIS. Purdue University Van Project. http://www.chem.purdue.edu/teacher/table_of_contents/Gel%20Electrophoresis/DYE_ELEC.5.11.96.pdf

Enrique García Lara. El laboratorio en el estudio de las proteínas. Distrito Sanitario Cádiz-Lajanda. http://www.dscadizlajanda.com/images/archivos/proteinas.pdf

David E. Grafin. Gel electrophoresis of proteins. Essential cell biology. Volume 1. Oxford University Press 2000.