¿protegen los alcaloides a las ranas venenosas de...
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¿PROTEGEN LOS ALCALOIDES A LAS RANAS VENENOSAS DE LA
INFECCIÓN POR EL HONGO BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS?
MARIA CAMILA HURTADO TORRES
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS DE
COLOMBIA
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIA Y EDUCACIÓN
BOGOTÁ, COLOMBIA
2016
2
¿PROTEGEN LOS ALCALOIDES A LAS RANAS VENENOSAS DE LA
INFECCIÓN POR EL HONGO BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS?
MARIA CAMILA HURTADO TORRES
Código: 20091140032
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
Licenciado en biología
Director externo:
ADOLFO AMÉZQUITA TORRES. Ph.D
Director interno:
LUIS FRANCISCO BECERRA.Msc
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS DE
COLOMBIA
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIA Y EDUCACIÓN
BOGOTÁ, COLOMBIA
2016
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INDICE
1. RESUMEN…………………………………………………………………............ 6
2. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………… 6
3. PROBLEMA…………………………………………………………………......... 8
4. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………….... 9
5. OBJETIVOS………………………………………………………………………10
6. MARCO TEÓRICO…………………………………………………………….. 10
6.1 Disminución en la población de anfibios…………………………………….10
6.2 Quitridiomicosis y el hongo Batrachochytrium dendrobatidis …………….10
6.3 Ciclo de vida de Batrachochytrium dendrobatidis……………………….. 12
6.4 Distribución de Batrachochytrium dendrobatidis …………………………. 12
6.5 Cepa Colombiana EVOO1………………………………………………….. 13
6.6 Mecanismos de defensa de los anfibios frente a Batrachochytrium
dendrobatidis ………………………………………………………………… 14
6.7 Superfamilia Dendrobatoidea (Cope, 1985)……………………………….. 15
6.7.1 Familia Dendrobatidae……………………………………………….. 15
6.7.1.1 Dendrobates truncatus …………………………………………….. 17
6.7.1.2 Oophaga histrionica………………………………………………... 18
6.7.2 Familia Aromobatidae………………………………………………… 18
6.7.2.1 Rheobates palmatus………………………………………………. 18
6.8 Mucosoma…………………………………………………………………… 20
7. METODOLOGÍA………………………………………………………………...20
7.1 Área de estudio……………………………………………………………… 20
7.2 Captura de los especímenes………………………………………………… 22
7.3 Preparación de las pieles…………………………………………………… 22
7.4 Liofilización…………………………………………………………………. 22
7.5 Reactivación de la cepa EV001 y Conteo de zoosporas…………………… 22
7.6 Montaje en microplacas…………………………………………………….. 23
8. RESULTADOS…………………………………………………………………... 23
9. DISCUSIÓN……………………………………………………………………... 25
4
10. CONCLUSIONES……………………………………………………………….. 28
11. RECOMENDACIONES………………………………………………………… 29
12. REFERENCIAS………………………………………………………………..... 30
13. ANEXOS…………………………………………………………………………..31
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Diferenciación de algunos de los tipos de alcaloides presentes en las ranas de
la familia Dendrobatidae y Aromobatidae (Summers et al. 2001)……………………. 8
Figura 2: Zoosporas y esporangios encontrados en la rana Litoria caerulea. Foto de
Berger et al 1999……………………………………………………………………… 11
Figura 3: Corte histológico del dedo del pie de un adulto de la rana Litoria caerulea. En
ella se pueden observar los esporangios (flechas) y las zoosporas (Z). Tinción con
Hematoxilina y eosina. E = epidermis, K = queratina. Foto de Berger et al 1999……. 11
Figura 4: Discos orales de Limnodynastes dumerilii afectados por Bd……………… 11
Figura 5: Ciclo de vida del hongo Batrachochytrium dendrobatidis. En esta imagen
puede observarse la fase móvil y el enquistamiento………………………………….. 12
Figura 6: Distribución mundial del hongo Batrachochytrium dendrobatidis en el año
2013. Imagen tomada de Olson, 2013. El color rojo refleja presencia de Bd en la
localidad, el blanco lugares sin presencia de Bd y el azul desconocimiento en la presencia
o ausencia del quitridio………………………………………………………………… 13
Figura 7: Fotografía electrónica de las zoosporas de la cepa colombiana EV001. Tomada
por Flechas, et al 2013…………………………………………………………………. 15
Figura 8: Ranitomeya perteneciente a la familia Dendrobatidae……………………… 16
Figura 9: -Rheobates palmatus perteneciente a
Aromobatidae……………………………………………………………………… 16
Figura 10: Distribución de la familia Dendrobatidae. Como se puede observar en la
imagen, esta presenta una distribución en América……………………………………. 17
Figura 11: Ejemplos de cuidado parental en ranas de la familia Dendrobatidae. De izq a
der: Dendrobates pumilio y Epipedobates trivittatus…………………………………. 17
Figura 12: Individuo característico Oophaga histriónica…………………………….. 19
Figura 13: Individuos característico Dendrobates truncatus…………………………. 19
Figura 14: Distribución de la familia Aromobatidae. Se puede observar su amplia
distribución en Colombia, principalmente en la cordillera central y occidental……….19
Figura 15: Rheobates palmatus realizando cuidado parental…………………………..19
5
Figura 16: Distribución de cada una de las localidades de colecta para la realización del
estudio. Las especies son, de arriba abajo, O. histrionica, R. palmatus y D. truncatus…21
Figura 17: Zoosporangios de Batrachochytrium dendrobatidis en fase de
esporulación…………………………………………………………………………… 23
Figura 18: Absorbancia neta (crecimiento del hongo Bd) en función del tiempo de cada
uno de los tratamientos utilizados durante el proyecto. Donde bdm (Batrachochytrium
dendrobatidis muerto) bdv (Batrachochytrium dendrobatidis vivo) hist (Oophaga
histriónica) palm ( Rheobates palmatus) y trun ( Dendrobates truncatus)……………. 26
Figura 19: Variación de las concentraciones (crecimiento del hongo Bd) en función del
tiempo de cada uno de los tratamientos utilizados durante el proyecto………………. 28
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Relación peso piel vs absorbancia relativa de cada uno de los tratamientos
evaluados en el experimento……………………………………………………………25
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Características ambientales de cada uno de los sitios de colecta…………… 21
Tabla 2: Resultados de la regresión lineal de la relación peso piel vs absorbancia relativa
para cada una de las especies de cada uno de los tratamientos evaluados en el
experimento…………………………………………………………………………… 24
6
1. RESUMEN
El rápido declive de poblaciones de anfibios alrededor del mundo es un hecho ampliamente
aceptado en la comunidad científica. Muchos de estos declives poblacionales son causados
por una enfermedad denominada quitridiomicosis, la cual es el resultado de una infección
cutánea producida por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). En el presente trabajo
determinamos el papel que tiene el mucosoma (anticuerpos de la mucosa, los péptidos
antimicrobianos, los alcaloides y los metabolitos) de algunas especies de las familias
Dendrobatidae y Aromabatidae sobre el hongo Bd. Se eligieron estas familias porque se ha
comprobado que en ocasiones son capaces de convivir con el hongo sin ninguna afectación.
Se utilizaron cuatro individuos de las siguientes especies: Rheobates palmatus, Dendrobates
truncatus y Oophaga histrionica y se realizó una preparación de sus mucosomas por medio
de una extracción y liofilización de las pieles. Paralelamente se reactivó la cepa del hongo
patógeno EV001 y con las zoosporas se hizo un inóculo. Se llevó a cabo el montaje en placas
de microtitulación de 96 pozos, la cual se incubo a 23°C y se evaluó a las 24, 48, 72 y 96
horas en un lector de microplacas; lo anterior permitió estimar el nivel de crecimiento del Bd.
Se analizaron los valores de densidad óptica de un total de 42 muestras en las que se encontró
que el mucosoma es una posible fuente de nutrientes para Bd, ya que en la mayoría de los
casos este creció un 40% más respecto al medio de cultivo de Triptona al 1% con zoosporas.
De las tres especies se encontró que el extracto de R. palmatus aceleró en mayor medida el
crecimiento de Bd frente a los de D. truncatus y O. histrionica. Además de esto se determinó
que no existe una relación directa entre el peso de la piel del individuo y el grado de afectación
que puede llegar a causar el mucosoma sobre el quitridio.
2. INTRODUCCION
Los anfibios han sufrido las extinciones más notables entre todos los vertebrados (Wake &
Vredenburg 2008) siendo una de las causas, la quitridiomicosis causada por el hongo
Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), considerada la más preocupante (Bosch & Gutiérrez
2003). Este hongo pertenece al Phylum Chytridiomycota, Clase Chytridiomycetes, Orden
Rhizophydiales (Hibbett et al, 2007). Presenta un ciclo de vida en dos fases: una móvil para
disperción (zoosporas en ambiente acuático) y otra no móvil (enquistamiento y formación de
zoosporangio o esporangio en el hospedero). Como característica importante de su biología
presenta esporangios (zoosporangios) sin opérculos y zoosporas con flagelos (Berger et al.
2005).
En el caso particular de los anfibios la infección por este patógeno produce la
hiperqueratinización o engrosamiento del estrato córneo de la piel, que sobrepasa los 2-5 mm
habituales, llegando a 60 mm (Bosch & Gutiérrez 2003). Otros cambios incluyen hiperplasia
multifocal irregular, perturbación en las capas de células epidérmicas, espongiosis (edema en
la epidermis), erosiones y ulceraciones ocasionales en la piel (Berger et al. 2005). La
sintomatología de los animales enfermos es muy variable entre individuos y entre especies,
pero en general se produce inapetencia, decoloración de la piel, excesiva mucosidad, posturas
anormales, ausencia de comportamiento de huída y comportamientos atípicos (por ejemplo
los animales permanecen al sol sin buscar refugio). Sólo en algunas ocasiones hay síntomas
7
evidentes como úlceras y erosión en la piel (Berger & Kent 1999). Autores como Voyles et
al. en el 2009 y Fites et al. en el 2013 proponen dos posibles mecanismos de acción de Bd:
(1) cambios fisiopatológicos en la rana debido a la inhibición en el transporte de electrolitos,
reducción de un 20% y 50% en las concentraciones de sodio y potasio en plasma,
respectivamente, ocasionando así un paro cardiaco; y (2) Deterioro de los linfocitos de la rana
que causan una apoptosis celular inducida.
El hongo quitridio se ha expandido a múltiples regiones del planeta, predominando
especialmente en los hábitats que tienen las faunas de anfibios más diversas del mundo (Ron,
2005). Colombia, al considerarse como un punto de gran diversidad de herpetofauna, se ha
visto afectada por la proliferación de este quitridiomicete; desde hace un tiempo se han
presentado algunos registros en los bosques pre-montanos (Rueda-Almonacid 1999), en la
cordillera oriental (Vásquez, 2011; Bahamón, 2012; Acosta et al. 2006), en la cordillera
occidental (Velázquez et al 2008), en la Región Andina Oriental (Quintero, 2008), en la
cordillera central (Urbina et al. 2011), en la región pacífica (Palacios, 2014) y en Gorgona,
una isla de la costa pacífica (Flechas et al. 2012) en donde se ha constatado la presencia de
Bd por medio de técnicas histológicas y de PCR. La gran proliferación en nuestro país se
debe a que nos encontramos en una zona climática donde la temperatura y humedad son aptas
para la propagación del mismo lo que genera una mayor vulnerabilidad de infección para los
anfibios. Inicialmente, en nuestro país, la quitridiomicosis se relacionó con los sapitos de río
del género Atelopus (Familia Bufonidae) (De sa. 2005; Rueda-Almonacid et al. 2008) pero
poco a poco se ha revelado que afecta a una gran cantidad de familias incluyendo Hylidae,
Centrolenidae, Leptodactylidae.
Los dendrobátidos son ranas de pequeño y mediano tamaño distribuidas en la zona tropical
de América central y del sur (Ford et al. 1993). La familia incluye especies tanto aposemáticas
como crípticas. Son de hábitos diurnos y prefieren lugares donde predomine la hojarasca y la
presencia de bromelias. Algunos géneros (principalmente Dendrobates, Phyllobates, y
Epipedobates) son de colores brillantes y poseen alcaloides tóxicos de tipo lipófilos en la piel
(Daly et al. 1999). La fuente de estos alcaloides es probablemente la dieta, consistente de
artrópodos como hormigas, termitas y ácaros (Daly et al. 2002; Santos et al. 2003). Otros
géneros (por ejemplo, Colostethus, Mannophryne y Nephelobates) son crípticos y poco
tóxicos, careciendo así de alcaloides lipófilos (Santos et al. 2003) (Fig. 1).
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Figura 1: Diferenciación de algunos de los tipos de alcaloides presentes en las ranas de la
familia Dendrobatidae y Aromobatidae (Summers et al. 2001)
Palacios et al. en el 2014 reporta la infección de algunas poblaciones de O. histrionica, las
cuales presentan bajas concentraciones de zoosporas; esto nos lleva a suponer que por lo
menos algunas de las ranas de esta familia pueden llegar a tener algún tipo de resistencia
hacia el patógeno. Hasta el momento no existen estudios que expliquen el por qué estas ranas
venenosas se verían menos afectadas por este quitridiomicota, por lo cual no se tiene una idea
clara del mecanismo que les permite portar el patógeno sin sucumbir ante él. Teniendo en
cuenta la presencia de toxinas compuestas por alcaloides, proponemos una interacción entre
éstos, los factores inmunes y la actividad microbiana. Los alcaloides poseen la propiedad de
obstruir los canales de membrana e impedir el paso de solutos, por lo que podría existir una
relación con la viabilidad del hongo patógeno. Es por ello que nuestro objetivo principal será
determinar el papel que tiene el mucosoma de algunas ranas de las familias Dendrobatidae y
Aromabatidae sobre el hongo Batrachochytrium dendrobatidis. Para ello utilizaremos tres
tipos ranas, una tóxica (Oophaga histrionica), una medianamente tóxica (Dendrobates
truncatus) y otra no tóxica (Rheobates palmatus). Este diseño permitiría además establecer
la posible importancia de la toxicidad de los alcaloides como medio de protección.
Este estudio pionero espera proveer respuestas acerca de la posible incidencia positiva que
pueden llegar a tener los alcaloides para la protección y conservación de las ranas venenosas
contra este y otros patógenos, además de abrir el camino a nuevas investigaciones sobre el
uso de alcaloides como posible tratamiento contra el quitridio.
3. PROBLEMA
A partir de la década de los años 80´s se ha podido observar un fenómeno de disminución de
anfibios a gran escala debido a la introducción y rápida expansión de enfermedades (Bosch
et al. 2003). Un claro ejemplo es la quitridiomicosis que ha conllevado a mortalidades
masivas, declinaciones poblacionales y extinciones. El Bd es reconocido por su capacidad de
propagarse rápidamente por muchas poblaciones de anfibios, llegando a identificarse en todos
los continentes (Olson et al 2013).
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Por todo lo anterior resulta indispensable continuar realizando estudios que permitan explicar
aspectos relacionados con el manejo de Bd, tales como la reproducción del patógeno, su
fisiología, su adaptación, su rápida expansión y ante todo los posibles mecanismos de defensa
que puedan proporcionar aquellos grupos de anfibios que no se han visto masivamente
afectados. En diversos estudios (Woodhams et al. 2007; Rollins-Smith et al. 2003) se ha
encontrado que los péptidos presentes en la piel de algunas especies de anfibios son capaces
de inhibir el crecimiento de Bd. Es por ello que se quiere comprobar si el mucosoma,
compuesto por los anticuerpos de la mucosa, los péptidos antimicrobianos, los alcaloides y
los metabolitos, es capaz de contrarrestar y combatir la infección causada por esta enfermedad
considerada como una pandemia mundial (OMS, 2011). Es posible que todo este complejo
sistema pueda proporcionar interesantes respuestas y aportar a la generación de posibles
mecanismos de defensa.
4. JUSTIFICACIÓN
Los anfibios son organismos importantes en la mayoría de ecosistemas debido a su
importancia ecológica. Los adultos regulan la población de plagas, mientras que los
renacuajos pueden ser presas de especies acuáticas, ser consumidores de algas y
bioindicadores (Blaustein et al.1994; Hitzak et al. 1998). Desde 1988, con el caso del sapo de
Monteverde (Crump, 1992, Pounds et al. 1994), se han comenzado a reportar alarmantes
disminuciones en las poblaciones a nivel mundial, no solo en zonas que han sido intervenidas
por el hombre sino en lugares lejanos y áreas destinadas para la conservación, razón por la
cual la comunidad científica ha desarrollado estrategias como programas de monitoreo,
modelos estadísticos e investigaciones experimentales que permitan establecer el origen de
este declive. A partir de esto se han encontrado que las principales causas de extinción de
anfibios son: la fragmentación de su hábitat para la explotación minera, ganadera, usos
agropecuarios y cultivos ilícitos, la introducción de especies exóticas, el comercio ilegal, la
radiación ultravioleta, el cambio climático y la aparición de enfermedades emergentes,
principalmente la quitridiomicosis (Lips et al. 2000; Rueda-Almonacid et al. 1999;
Mittermeier et al 1992; Andre et al 1988; Blaustein et al 1994)
La quitridiomicosis es reconocida como una enfermedad de declaración obligatoria
(Organización Mundial de Sanidad Animal 2011), la cual es el resultado de una infección
cutánea producida por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis. Este patógeno se
caracteriza por ser generalista, debido a que afecta a numerosas familias de anfibios, en las
cuales puede ocasionar decesos repentinos, como en el género Atelopus (La Marca et al. 2005;
De Sa, 2005); o pueden llegar a ser portadoras asintomáticas, como en el caso de la rana toro
(Lithobates catesbeiana) (Daszak et al. 2004. En varios estudios realizados en Colombia
(Acosta et al. 2006; Ruiz & Rueda-Almonacid 2008; Velásquez et al. 2008; Quintero 2008;
Urbina & Galeano 2011) se monitoreó la presencia de Bd en diferentes puntos del país; en
los resultados encontraron que las poblaciones de los dendrobátidos no habían evidenciado
disminuciones, por lo que este estudio se centró en la detección y explicación de la
importancia que puede llegar a tener el mucosoma para contrarrestar o combatir esta
enfermedad.
10
5. OBJETIVOS
5.1 Determinar el papel que tiene el mucosoma de algunas ranas de las familias
Dendrobatidae y Aromabatidae sobre el hongo Batrachochytrium dendrobatidis
5.2 Identificar si este papel dpende además del nivel de toxicidad de la especie de rana
5.3 Como covariable, comprobar si existe una relación entre el peso de cada rana y el efecto
del mucosoma sobre el crecimiento de Batrachochytrium dendrobatidis
6. MARCO TEÓRICO
6.1 Disminución en la población de anfibios
A partir de los años 80´s la clase anfibia se ha visto fuertemente afectada por diversas
problemáticas como la deforestación, la minería, el cambio de pH del medio, la introducción
de especies invasoras o las interacciones entre estos factores (Lips et al. 2000; Mittermeier et
al 1992; Rueda-Almonacid et al. 1999; Andre et al 1988; Blaustein et al 1994; Alfrod et al.
1999). Esto ha llevado a una abrupta disminución de poblaciones a nivel mundial, siendo la
herpetofauna tropical la que se más afectada se ve. En el caso de los anuros, se ha presentado
una situación aún más preocupante, pues debido a su alta sensibilidad a los cambios externos
de su hábitat han disminuido sus poblaciones, llegando a encontrarse fuertemente desplazados
por factores como la disminución de la capa de ozono, lluvias ácidas, polución o
enfermedades emergentes (Coloma & Lombeida, 1992). Esta última causa se empezó a
considerar como una de las principales razones, debido a estudios realizados por Crump,
1992 y Pounds et al. 1994 en las selvas de Costa Rica y Panamá, respectivamente, y por
Berger et al. 1998 en Australia. Ellos demostraron una importante disminución de especies
debido a lo se conocería como una pandemia en la década de los 90’s y principios de los años
2000, la quitridiomicosis, enfermedad ocasionada por el hongo Batrachochytrium
dendrobatidis.
6.2 Quitridiomicosis y el hongo Batrachochytrium dendrobatidis
La quitridiomicosis es la enfermedad causada por el patógeno Batrachochytrium
dendrobatidis. Pertenece al Phylum Chytridiomycota, Clase Chytridiomycetes, Orden
Rhizophydiales (Hibbett et al, 2007). (Figura 2). Esta enfermedad fue descrita por primera
vez en el año de 1998, a partir de análisis histológicos realizados a un grupo de anfibios
enfermos encontrados en Australia y Panamá entre los años 1993 y 1998 (Berger et al., 1998;
Longore et al., 1999). Entre los principales daños que se encontraron fueron engrosamiento
de la epidermis (especialmente en el estrato córneo y granular, Figura 3) , así como
malformaciones en la región oral en renacuajos (Figura 4-5)
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Figura 2: Zoosporas y esporangios encontrados en la rana Litoria caerulea. Foto de Berger et
al 1999.
Figura 3: Corte histológico del dedo del pie de un adulto de la rana Litoria caerulea. En ella
se pueden observar los esporangios (flechas) y las zoosporas (Z). Tinción con Hematoxilina
y eosina. E = epidermis, K = queratina. Foto de Berger et al 1999.
Figuras 4. Discos orales de Limnodynastes dumerilii afectados por Bd. Foto de OIE 2011.
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6.3 Ciclo de vida de Batrachochytrium dendrobatidis
Batrachochytrium dendrobatidis tiene dos fases: una de zoosporas en dispersión (fase
acuática-móvil) y otra de formación de quiste sésiles o inmóviles que dan origen a
zoosporangios también conocidos como esporangios. La etapa infecciosa es cuando las
zoosporas presentan movimiento en busca de hospedero. Cuando la zoospora se establece en
el hospedero, el flagelo se reabsorbe, formando el quiste, el cual posteriormente da lugar a la
formación de rizoides y el crecimiento del talo, que madura dentro de un período de 4-5 días;
posteriormente, las zoosporas que se forman por la división mitótica son liberadas de los
esporangios cuando las condiciones de temperatura y humedad son apropiadas, y el ciclo
comienza de nuevo (Berger et al., 2005, Hernández et al 2014) (Figura 5).
Figura 5: Ciclo de vida del hongo Batrachochytrium dendrobatidis. En esta imagen puede
observarse la fase móvil y el enquistamiento. Foto tomada de olson 2013.
6.4 Distribución de Batrachochytrium dendrobatidis
En la actualidad el hongo Batrachochytrium dendrobatidis es reconocido como una patógeno
mundial, debido a su amplia expansión en todos los continentes (Organización Mundial de
Sanidad Animal, 2011). Su rápida propagación se puede deber a dos razones, la primera o
“hipótesis del patógeno incipiente” es que el hongo ha sido diseminado tanto por especies
invasoras como por el desplazamiento humano en zonas NO contaminadas (Fisher et al.
2007); su origen se habría dado en África inicialmente con algunas ranas del género Xenopus,
las cuales al ser utilizadas para pruebas de embarazo fueron altamente comercializadas, pero
rápidamente olvidadas, por lo que fueron liberadas masivamente (Rachowicz et al., 2005).
La segunda hipótesis de “patógeno endémico” relata que éste siempre ha estado latente en los
ecosistemas, pero que debido al cambio climático y al desplazamiento por factores como la
deforestación, se ha incrementado en el rango de huéspedes o de patogenicidad, mejorando
su adaptación, volviéndose más generalista e incluso variando su genoma (Rachowicz et al.,
2005; Rosenblum et al. 2013).
13
Figura 6: Distribución mundial del hongo Batrachochytrium dendrobatidis en el año 2013.
Imagen tomada de Olson, 2013. El color rojo refleja presencia de Bd en la localidad, el blanco
lugares sin presencia de Bd y el azul desconocimiento en la presencia o ausencia del quitridio.
Como puede observarse en la figura 6, este patógeno se ha extendido principalmente por el
sur de África, el este de Asia y en Norteamérica. Esto puede deberse a que la estabilidad
climática de estas zonas favorece el establecimiento de Bd; además de esto también es
importante tener en cuenta que son zonas que han sido muy estudiadas, por lo que es posible
que exista un mayor conocimiento en su distribución (Olson, 2013). En otras zonas como
Suramérica, también existen reportes pero en menor escala, debido tal vez a la poca atención
que anteriormente se prestaba.
En el caso particular de Colombia, existen reportes como los de Flechas et. al., en el 2012,
el cual registra la presencia de Bd en tierras bajas, específicamente en la isla de Gorgona;
Ruiz A y Rueda-Almonacid (2008) examinan en museos desde 1968 hasta 2006 muestras de
individuos a partir de métodos histológicos para conocer el estado de la enfermedad en
nuestro país; Velásquez, et. al. (2008) describe la incidencia de Bd en los individuos de la
cordillera occidental Colombiana. Vásquez et al. en el 2012, en contraste, describe la
presencia de la enfermedad en la cordillera oriental, haciendo énfasis en la relación de
temperatura, altitud y humedad con el patógeno. Además de esto, un estudio aún más actual
realizado en el departamento del Chocó y Valle del Cauca (Palacios, 2014), muestra la
14
presencia de este patógeno en poblaciones de Oophaga histrionica, las cuales, al parecer
pueden convivir con este hongo sin ningún tipo de disminución en sus poblaciones.
6.5 Cepa Colombiana EVOO1
En el 2013 Flechas y colaboradores realizaron un estudio en la cordillera de los Andes en
Colombia considerado como hotspot o un punto de alta diversidad mundial. En este estudio
lograron aislar una nueva cepa, la cual sería la primera reconocida para nuestro pais. La
denominaron EV001 (Figura 7 ). Esta cepa de Bd fue aislada de un juvenil de la especie
Rheobates palmatus (Werner, 1899).
Despues de comparar con las cepas que ya estaban secuenciadas se determinó que hace parte
del ‘Global Panzootic lineage Bd-GPL’, ya que comparte muchas similitudes genéticas;
también se encontró que EV001 está cercanamente relacionada con la cepa panameña JEL
423, lo que puede ser posible gracias a su cercanía geográfica.
Figura 7: Fotografía electrónica de las zoosporas de la cepa colombiana EV001. Tomada por
Flechas, et al 2013.
6.6 Mecanismos de defensa de los anfibios frente a Batrachochytrium dendrobatidis
En la última década se han realizado múltiples trabajos para establecer posibles mecanismos
que contribuyen a contrarrestar este patógeno. Entre los principales estudios podemos
encontrar los de Woodhams et al (2007), en el cual se corrobora que los péptidos son
defensas adecuadas para contrarrestar la infección de Bd. Rollins-Smith, et al (2005)
encuentran que los péptidos caerin 1,9, 1,1 maculatin, y caerin 1,1 son sumamente efectivos
15
para lograr inhibir al patógeno; Flechas et al (2012b) demuestran que existen algunas
bacterias en la piel de los Atelopus capaces de inhibir el crecimiento de Bd; Reid et al. (2006)
determinan que la interacción de bacterias de los género Arthrobacter, Bacillus,
Kitasatospora, Paenibacillus, Pedobacter, Pseudomonas y Streptomyces favorece la
protección contra el quitridio. Becker, et al. (2012), Harris et al. (2009), Lam et al. (2009)
reconocen la importancia de Janthinobacterium lividum para contrarrestar la enfermedad.
Gammill y colaboradores (2012) describen la efectividad de los péptidos antimicrobianos
contenidos en las glándulas granulares de Xenopus laevis; Woodhams y colaboradores, en el
2012, realizan una investigación con Litoria genimaculata y establecen la acción
antimicrobiana que posee este anfibio al ser expuesto frente al hongo. Además de esto,
podemos encontrar otros estudios realizados por Lauer, el primero en el 2007 , en el que
hablan acerca de esta relación simbiótica con otro tipo de anfibios, las salamandras, de la
especie Plethodon cinereus, aislando su microflora e identificando bacterias del género
Chryseobacterium, Pseudomonas, Lysobacter y Bacillus. Posteriormente en el 2008, se
comparó la microbiota proveniente de la piel de las salamandras Hemidactylium scutatum a
partir de métodos moleculares, encontrando 48 especies de bacterias con efecto anti fúngico,
siendo las más representativas Bacillus cereus, Pseudomonas fluorescens, Flavobacterium
sp. y Janthinobacterium lividum.
6.7 Superfamilia Dendrobatoidea (Cope, 1985)
Los individuos presentes en la superfamilia Dendrobatoidea se caracterizan por presentar un
pliegue metatarsiano, la inserción del tendón en el musculo semitendinoso, el transporte de
renacuajos en el dorso, el primer dedo más grande que el segundo y la presencia de escudetes
dérmicos en los discos digitales (Grant et al 2006; Barrio et al 1999). Ésta a su vez contiene
dos familias, Dendrobatidae y Aromobatidae. (Fig. 8-9). La primera se caracteriza por
presentar aposematismo y presencia de alcaloides, mientras que la segunda es generalmente
críptica. Ambas, con excepción de una especie, son diurnas.
Figuras 8-9: Ranitomeya , perteneciente a la familia Dendrobatidae y Rheobates palmatus
perteneciente a Aromobatidae. Tomadas de www.arkive.org
16
6.7.1 Familia Dendrobatidae
Esta familia se compone de ranas de pequeño y mediano tamaño que se identifican por
presentar un proceso retroarticular y la conformación del músculo depresor de la mandíbula
(Ford & Cannatella1993). Son endémicas de la zona central y del sur de América,
extendiéndose desde Nicaragua hasta Bolivia y el Atlántico, incluyendo bosques de Brasil y
la costa del Pacífico (Fig. 10). Habitan en casi todos los ecosistemas presentes en el trópico,
excepto zonas áridas y nevados (Grant et al 2006). Todas las especies excepto una
(Aromobates nocturnus) son diurnas; ponen huevos terrestres, ya sea en el suelo o en algunas
plantas, y muchos se caracterizan por elaborar comportamientos reproductivos como el
transporte de los renacuajos en el dorso de los padres (Fig. 11). Su época reproductiva se da
principalmente en periodos de lluvia, aunque existen algunas especies que pueden llegar a
reproducirse independientemente de la estación (Aichinger 1987, 1992). Presentan un
amplexo cefálico, el cual se presume que se desarrolló de manera aislada en comparación con
otras ranas (Ford, 1989).
Figura 10: Distribución de la familia Dendrobatidae. Como se puede observar en la imagen,
esta presenta una distribución en América. Tomada de Cortázares, 2011.
17
Figura 11: Ejemplos de cuidado parental en ranas de la familia Dendrobatidae. De izq a der:
Dendrobates pumilio y Epipedobates trivittatus. Tomado de
http://es.mongabay.com/travel/suriname/p24009p.html
Uno de los aspectos que más llama la atención de esta familia es la diversidad de coloraciones,
ya que son tanto aposemáticas como crípticas. Algunos géneros (principalmente
Dendrobates, Phyllobates, Oophaga y Epipedobates) son de colores brillantes y poseen
alcaloides tóxicos de tipo lipófilos en la piel (Daly et al, 1999), y su fuente es probablemente
algunos artrópodos como hormigas, termitas y ácaros (Daly et al 2002, Santos et al 2003).
Mientras que otros géneros (por ejemplo, Colostethus, Mannophryne y Nephelobates) son
crípticos y poco tóxicos, careciendo asi de alcaloides lipófilos (Santos et al 2003)
En el caso de este estudio, se utilizaron ejemplares de los géneros Dendrobates (D. truncatus)
y Oophaga (O. histrionica); los cuales serán descritos brevemente a continuación.
6.7.1.1 Dendrobates truncatus
Estas ranas son las más pequeñas de su género (Dendrobates), llegan a medir 30 mm de
longitud en promedio; siendo los machos algo más pequeños que las hembras (Cope, 1861;
Caldwell, 1996) (Fig. 12). Pueden presentar una cloración negra con líneas amarillas en el
dorso o franjas dorsolateralmente de color blanco o crema; la zona abdominal tiene manchas
blancas. Habitan principalmente entre la hojarasca y cerca de los cursos de agua de los
bosques húmedos y secos de la región tropical (Ossa et al, 2012). Presentan una amplia
distribución, yendo desde el Tolima hasta la costa Caribe; y en tierras bajas al norte de las
Cordilleras Central y Occidental al oeste del golfo de Urabá (Ossa et al, 2012). Se alimentan
de pequeñas moscas, arañas, ciempiés, mosquitos, pero principalmente de hormigas, de las
cuales adquieren su toxicidad (Darst et al 2005). Entre los alcaloides presentes en la piel de
estos individuos esta la histrionicotoxina, decahidroquinolinas, indozilinas, entre otras (Celis,
2005). Entre las principales amenazas para esta especie esta la deforestación, el cambio
climático y la caza por parte de los humanos para su comercialización.
6.7.1.2 Oophaga histrionica
También conocidas como ranas Cocoi o arlequines (por su gran diversidad de coloraciones)
son individuos pertenecientes al género Oophaga, el cual se caracteriza por consumir en su
etapa larval, huevos infértiles proporcionados por la madre (Zamora et al 1999). Además de
esto, llaman mucho la atención debido a su gran gama de coloraciones, que va desde un tono
brillante a opaco, pasando por tonalidades naranjas, amarillas, rojas, blancas, y azules; es por
ello que suelen ser el mejor ejemplo de aposematismo (Fig. 13) . El patrón en forma de banda
sobre su cuerpo también varía de espesor. Habitan principalmente en el suelo de bosques
tropicales entre ramas caídas, las hojas de plantas y la hojarasca en el suelo del bosque. Se
distribuyen en zonas bajas (0-1000 msnm) de Antioquia, Chocó y parte del Valle del Cauca
(Rueda-Almonacid et al 2004).
18
Oophaga histrionica se alimenta de pequeños invertebrados, principalmente hormigas,
termitas, pequeños escarabajos y otros artrópodos que se encuentran en la hojarasca
(Amézquita et al. 2013). Se ha estudiado que a partir de sus presas adquieren los alcaloides
que las caracterizan, en especial la histrionicotoxina (Daly et al 2005), la cual causa bloqueos
en los canales de sodio ocasionando así alteraciones neuromusculares. Poseen una relativa
baja toxicidad, pero pueden resultar incomodos a sus depredadores debido a su sabor amargo
y al bloqueo de canales inotrópicos (Celis, 2005). Entre sus principales amenazas se encuentra
la deforestación y el caza por parte del hombre para venta, debido a su coloración.
6.7.2 Familia Aromobatidae
También conocidas como ranas nodrizas, son parientes cercanos a la familia Dendrobatidae,
los cuales al realizar estudios moleculares se separaron de esta familia (Grant et al 2006). Son
individuos con coloraciones crípticas, de pequeños tamaños y diurnos. Habitan
principalmente ecosistemas asociados a bosques secos o húmedos en Colombia,
encontrándose con mayor diversidad en las tierras bajas. Se distribuyen en América Central
y del Sur y las Antillas Menores, concentrándose en las laderas orientales de los Andes, en la
región amazónica, y en la selva atlántica de Brasil (Grant et al 2006) (Fig.14). Dentro de esta
familia podemos encontrar cuatro géneros principales: Allobates, Anomaloglosus, Rheobates
y Aromobates.
Al igual que sus parientes cercanos, se alimentan principalmente de pequeños insectos como
hormigas, termitas, arañas, etc. También realizan cuidado parental, transportando sus
renacuajos en el dorso.
6.7.2.1 Rheobates palmatus (Werner, 1989)
Es una especie perteneciente al género Rheobates, el cual presenta principalmente
coloraciones crípticas y un tamaño mediano (Fig. 15). Sus larvas se desarrollan en los arroyos.
Habitan principalmente en los suelos de los bosques de niebla y en la selva tropical, llegando
a ser considerada como una especie resistente, debido a su adaptabilidad en áreas perturbadas
y contaminadas (Ramírez-Pinilla et al 2010). Es una especie endémica de Colombia, y se
distribuye desde el flanco oriental de la Cordillera Central en los departamentos de Caldas y
Tolima, y desde los flancos occidental y oriental de la Cordillera Oriental de los
departamentos de Cundinamarca, Boyacá, Santander, Meta y Serranía de la Macarena. Se ha
registrado desde el nivel del mar, hasta los 2.500 m.
19
Figuras 12 y 13: De izquierda a derecha Individuos característicos de Dendrobates truncatus.
Complejo de coloración presente en la especie Oophaga histrionica. Tomados
correspondienteme de http://travisandlaurie.blogspot.com/2011/05/baltimore-day-1-part-2-
national-aquarium.html ; http://www.faunaexotica.net/threads/oophaga-histrionica.78144/
Figura 14: Distribución de la familia Aromobatidae. Se puede observar su amplia
distribución en Colombia, principalmente en la cordillera central y occidental. Tomada de
http://data.sibcolombia.net/species/28889
20
Figura 15: Rheobates palmatus realizando cuidado parental. Tomada por Camila Hurtado.
6.8 Mucosoma
En el 2014 Woodhams y colaboradores expusieron por primera vez el concepto de mucosoma
y lo definieron como “la integración de los factores inmunes del huésped y la comunidad
microbiana” donde intervienen compuestos como los anticuerpos de la mucosa, los péptidos
antimicrobianos, los alcaloides y los metabolitos de cada individuo. Según estos autores
puede existir una variabilidad en cuanto a la abundancia o ausencia de cualquiera de estos
compuestos, los cuales están determinados por factores como la historia de vida, el hábitat y
las amenazas que pueda llegar a tener el individuo. Entre las principales funciones de este
complejo sistema encontramos la comunicación intra e interespecífica, la defensa contra
depredadores y patógenos.
7. METODOLOGIA
7.1 Área de estudio
La toma de muestras se realizó en tres localidades: Ubaqué (Cundinamarca), Melgar
(Tolima), y Cantón de San Pablo (Choco) (Tabla 1, Fig.16). Éstas fueron seleccionadas
debido la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis en dos de ellas (Ubaque y Melgar) y
a la facilidad de acceso (Palacios, 2014; Flechas et al 2013).
Ubaque se encuentra ubicado en el departamento de Cundinamarca, donde se colectaron los
individuos poco tóxicos, pertenecientes al género Rheobates. Presenta una temperatura
promedio de 18 °C. Es típicamente montañosa, destacándose como principales accidentes
orográficos los cerros de Guayacundo y el Güinto. En su aspecto hidrográfico cuenta con su
propia fuente hídrica llamada Río Palmar, que nace (Páramo de Cruz Verde) y muere (Río
Negro) en límites con el vecino Municipio de Fómeque (Alcaldía de Cundinamarca, 2011).
Este municipio se caracteriza por su gran diversidad de climas, resaltando ecosistemas como
los páramos y bosques altoandinos, que albergan gran cantidad de especies.
La segunda localidad, fue el municipio de Melgar, ubicado en el departamento del Tolima,
en donde se colectaron los especímenes de Dendrobates truncatus, que a su vez son
medianamente tóxicos (Daly 1978). Este sitio presenta alta temperatura y posee ecosistemas
como los bosques secos tropicales.
Y finalmente se seleccionó el Cantón de San Pablo, ubicado en el departamento del Chocó,
para la colecta de Oophaga histrionica. Este municipio presenta precipitaciones frecuentes,
un promedio de temperatura media anual de 20,5ºC, con una máxima de 28,7ºC y una mínima
21
promedio anual de 16ºC; tiene aproximadamente tres cuartas partes de su área todavía
cubierta de bosque tropical (Rangel 2004; Eslava 2004).
Tabla no 1: Características ambientales de cada uno de los sitios de colecta
Departamentos Municipios Coordenadas
geográficas
Zonas de
vida
Altitud
m.s.n.m
Especie
recolectada
Cundinamarca Ubaque 4º26’12” N,
73º55’10” O
Bosque
altoandino
1920 Rheobates
palmatus
Tolima Melgar 4°12′14″N
74°38′34″O
Bosque
seco
tropical
323 Dendrobates
palmatus
Chocó Cantón de
San Pablo
05°30′37″N
76°52′42″O
Bosque
húmedo
tropical
264 Oophaga
histriónica
Figura 16: Distribución de cada una de las localidades de colecta para la realización del
estudio. Las especies son, de arriba abajo, O. histrionica, R. palmatus y D. truncatus.
22
7.2 Captura de los especímenes
Los especímenes fueron capturados entre junio-agosto del 2013 por medio del método de
relevo por encuentro visuales (REV) descrito por Angulo et al. (2006). Los individuos se
manipularon utilizando guantes de nitrilo para cada especie con el fin de evitar contaminación
cruzada (Hyatt et al. 2007). Luego cada individuo fue puesto en una bolsa con extracto
vegetal, humedecida previamente, para evitar la muerte del mismo por disminución de la
respiración cutánea.
7.3 Preparación de las pieles
Las ranas se sacrificaron usando una inyección con 0.1 mL de metanol al 97%; luego se cortó
y se desprendió la piel de los individuos para minimizar la contaminación o la pérdida de
mucosoma. Cada muestra de piel se almacenó en una frasco de plástico que contenía 1.5 mL
de metanol al 100% y fue llevada al laboratorio para los ensayos (Arenas 2010). Luego se
pesó cada una para poder realizar una comparación entre la relación peso piel vs crecimiento
Bd. Cortamos cada piel en trozos pequeños y los licuamos con una PRO® 200
homogeneizador (Pro Scientific Inc.), usando el mismo metanol en el que fueron primero
almacenado (Hernández et al 2012).
7.4 Liofilización
La liofilización es una técnica de deshidratación o sublimación en frio, que se realiza para
secar una muestra sin necesidad de calor. En el caso de nuestro estudio se llevaron cada uno
de los extractos a liofilizar en frascos especiales que soportan grandes presiones durante 24
horas (Mori et al 2009); posteriormente lo que quedó fue resuspendido en 0.1ml de agua
destilada. Cabe anotar que antes de iniciar este proceso las muestras fueron congeladas a -80°
durante 3 días.
7.5 Reactivación de la cepa EV001 y Conteo de zoosporas
Con el fin de determinar el papel que tiene el mucosoma en el crecimiento del Bd se reactivó
la cepa colombiana del hongo, siguiendo el protocolo de Boyle y colaboradores del 2003.
Se le realizaron pases en diferentes tipos de medios: THGlac (Triptona, Agar bacteriológico,
Gelatina hidrolizada, agua destilada y Lactosa); THG (Triptona, Agar bacteriológico,
Gelatina hidrolizada, agua destilada) y TGH a la mitad de la concentración. Todo esto para
corroborar en cuál de estos proliferaban más las zoosporas (Fig. 17). Se pudo observar que
en la mayoría de los casos Batrachochytrium dendrobatidis creció más con el medio de TGH
lac, ya que este le suministraba mas nutrientes por contener una proporción de lactosa. Ya
con esto se lavó con DS (solución que simula el agua de charca) una caja de medio que tuviera
23
zoosporangios esporulando; y se utilizaron 10 µl de esta solución y 90 µl de lugol para
impedir que éstas se movieran. Posteriormente se montó en la cámara de Neubabuer y se miró
al microscopio en un aumento de 10X. Se realizan 10 conteos del número de zoosporas y se
promediaron hasta obtener un número cercano a 5X104 zoos/ml.
Fig. 17 : Zoosporangios de Batrachochytrium dendrobatidis en fase de esporulación. Tomada
por Motta, D ; Hurtado, C.
7.6 Montaje en microplacas
Para la realización de esta parte del ensayo se tuvieron en cuenta las metodologías utilizadas
en los trabajos de Rollins-Smith (2002, Ramsey (2010) y Woodhams (2010). En una placa de
96 pocillos se montaron por triplicado 3 tipos de tratamientos de la siguiente manera: (1)
50µL de zoosporas +Triptona al 1%+ mucosomas de cada uno de los individuos (se variaba
la concentración de extracto de mucosoma en 0.01; 0.10 y 0.20); (2) 50µL de zoosporas
+Triptona al 1% (Bd normal) y (3) 50µL de zoosporas +Triptona al 1% +calor (Zoosporas
inhibidas). ( Ver anexo 2) Estos se incubaron a 23°C y se evaluaron a las 24, 48, 72 y 96 horas
en un lector de microplacas a 450 nm. Estos datos fueron analizados teniendo en cuenta el
nivel de absorbancia que presentaron. Se examinó el efecto de variables como el peso de la
piel, la especie de rana y la concentración de los extractos sobre la absorbancia relativa.
8. RESULTADOS
Se encontró un mayor crecimiento de quitridio en el mucosoma de R. palmatus, seguido de
D. truncatus y finalmente O. histrionica (ver anexo No. 1). Es probable que Bd se haya visto
beneficiado por la presencia de mucosoma, ya que éste contiene algunos compuestos que
pueden resultar favorables para este hongo. En el caso de R. palmatus se halló que existe una
absorbancia neta superior a la de la mayoría de controles, lo que indica que existió un mayor
crecimiento y por lo tanto una mayor presencia del hongo en la hora 96 de cada uno de los
24
tratamientos. En D. truncatus algunos individuos presentaron pequeñas variaciones en la
absorbancia, resaltándose en su mayoría aquellos cuyo mucosoma estaba más concentrado
(0.01). Oophaga histrionica presentó una menor variación entre las absorbancias netas;
además de esto sus rangos eran menores que el control de la no tóxica ( R.palmatus) lo que
implica que B. dendrobatidis creció menos con este tipo de mucosoma. Esto puede ser posible
ya que estas últimas presentan una mayor concentración de alcaloides en su piel, en
comparación con el género Dendrobates (Daly et al 2005).
En comparación con los controles positivos (zoosporas vivas) y negativos (Zoosporas
inhibidas) se puede apreciar que hubo un mayor crecimiento de Bd con la presencia de los
mucosomas de cada una de las especies evaluadas; esto es posible debido a que parte de la
queratina aun presente en la piel, combinada con la temperatura adecuada y el medio de
crecimiento apropiado favoreció la proliferación de zoosporas (ver anexo 2).
Para el análisis de la relación entre el peso de los individuos y el crecimiento de Bd se realizó
una regresión lineal, la cual nos arrojó que no existe una correlación entre el peso de los
individuos y la absorbancia. Los valores del coeficiente oscilan para las especies entre 0,00 y
0,29, lo que significa que hay una baja relación entre estas dos variables. Además de esto, el
coeficiente de determinación R^2 es más cercano a 0, lo que nos muestra que el peso de la
piel no explica la variación existente en las absorbancias relativas (Tabla No. 2) (Grafico No.
1).
Tabla No.2: Resultados de la regresión lineal de la relación peso piel vs absorbancia relativa
para cada una de las especies de cada uno de los tratamientos evaluados en el experimento
Estadísticas de la regresión
Coeficiente de correlación múltiple 0,261
Coeficiente de determinación R^2 0,068
R^2 ajustado -0,024
Error típico 0,0656
Observaciones 12
25
Gráfico No.1: Relación peso piel vs absorbancia relativa de cada uno de los tratamientos
evaluados en el experimento
9. DISCUSION
Es conocido que Bd se alimenta de componentes de la piel de los anfibios, tales como la
quitina, celulosa o queratina, los cuales se encuentran especialmente ubicados en zonas
altamente queratinizadas como las puntas de los dedos o las zonas inguinales (Lips, 1999) .
En este estudio posiblemente este hongo se vio beneficiado por la presencia de todos los
componentes inmersos en el mucosoma (comunidad antimicrobiana, celulosa, quitina, etc.),
que le permitieron esporular más rápido y de esta manera crecer en mayor medida. En la
Figura 18 se pueden observar las diferencias existentes entre cada una de las especies
examinadas y su comparación con el control.
Rheobates palmatus fue la especie que mayor variación presentó con respecto a las otras
muestras, favoreciendo el crecimiento del hongo quitridio. Esto posiblemente puede deberse
a que estas ranas habitan principalmente en zonas cercanas a las corrientes de los ríos y
lagunas (Lüddecke, 1999) lo que favorece enormemente el crecimiento y dispersión de Bd
(Berger, 2005). Además es posible que esta especie se haya visto afectada hace algunos años
ya que en la zonas montañosas es donde existe una mayor dispersión y por lo tanto una
disminución en la respuesta inmune de las poblaciones (Berger et al. 1998; Lips, et al 2006;
Skerrat et al, 2007). Otro aspecto que podría ser importante es la ausencia de alcaloides en R.
palmatus, ya que según Grant et al. (2006) la familia Aromobatidae carece de la capacidad
de secuestrar alcaloides, lo que la haría un poco susceptible a la infección frente a los otros
individuos de estudio. Además de esto no se ha corroborado que R. palmatus posea en su piel
bacterias antagonistas que generen una barrera de protección, por lo que el mecanismo de
defensa de estar ranas debe estar relacionado con el ambiente.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
Ab
s_re
l
Peso Piel
Relación peso piel vs Absorbancia relativa
26
Figura No. 18: Absorbancia neta (crecimiento del hongo Bd) en función del tiempo de cada
uno de los tratamientos utilizados durante el proyecto. Donde bdm (Batrachochytrium
dendrobatidis muerto) bdv (Batrachochytrium dendrobatidis vivo) hist (Oophaga
histriónica) palm ( Rheobates palmatus) y trun ( Dendrobates truncatus).
Dendrobates truncatus fue la especie que presentó una variación media respecto a los otros
dos controles, ya que sus absorbancias oscilaron en rangos intermedios respecto a los otros
individuos, demostrando así que aunque el mucosoma de esta rana le sirvió de fuente de
nutrientes a las zoosporas no fue tan benéfico para estas como en el caso de R. palmatus.
Según Daly 1978 D.truncatus posee una gran diversidad de alcaloides, entre los que
destacamos la pumiliotoxina y las histrionicotoxinas, pero estos últimos expresan menor
actividad biológica. Sin embargo es importante tener en cuenta que tan solo la presencia de
estos compuestos puede llegar a generar algún tipo de resistencia que impida la proliferación
de las zoosporas de Bd (Macfoy, 2005).
Oophaga histrionica fue la especie que menor crecimiento de Bd promovió con respecto a
los otros 2 tratamientos, dado que los valores de la absorbancia relativa variaron entre 0,680-
1,300. Ello podría evidenciar que hubo incidencia importante de los alcaloides para
contrarrestar la proliferación de las zoosporas. Oophaga histrionica es una rana que
principalmente habita en bosques húmedos del pacifico colombiano, (Myers & Daly 1976;
27
Saporito et al. 2007). Palacios en el 2014 encontró que había presencia de Bd y que estas
ranas eran capaces de convivir con este patógeno; es posible que esto pueda darse por la
presencia de altas concentraciones de histrionicotoxina, un alcaloide espiropiperinídico que
puede antagonizar los cambios en las conductancias del sodio y/o los iones de potasio, que se
asocian con transmisión eléctrica en los nervios y células musculares; llega a bloquear la
transmisión neuromuscular o en este caso los mecanismos de acción del quitridio (Celis,
2006).
Con respecto a los controles (Zoosporas vivas y zoosporas inhibidas de la cepa EV001) se
encontró que en las 3 especies analizadas durante el estudio existió una mayor diferenciación
a la hora 96. En comparación R.palmatus presentó absorbancias altas, las cuales sugieren
baja eficacia de los péptidos antimicrobianos (PAM). Según Woodhams y colaboradores en
el 2010, es posible que estos componentes no eliminen la infección, sino que por el contrario
permitan el ingreso de las zoosporas y el descenso de la respuesta inmunitaria. Con
Dendrobates truncatus y Oophaga histrionica encontramos un comportamiento similar ya
que los valores encontrados durante el estudio fueron muy cercanos entre estas dos especies
(Myers & Daly 1976)
En cuanto a las concentraciones utilizadas en los experimentos (Fig. 19) podemos apreciar
que en el caso de los controles de Batrachochytrium inhibido y Batrachochytrium vivo este
decreció en función del tiempo, esto se generó posiblemente por la presencia de
microorganismos contaminantes que consumieron al quitridio. En relación con cada una de
las especies se observa una diferencia significativa entre Oophaga histriónica y Rheobates
palmatus, ya que sus bandas no se sobrelaparon a diferencia de Dendrobates truncatus que si
lo hizo con ambas especies. Probablemente el comportamiento anterior se dio por las
variaciones de toxicidad presentes en cada especie y al grado de tolerancia que tienen con
este hongo.
En este experimento se sugiere la diferenciación en cuanto a los mecanismos de acción que
poseen R. palmatus, D. truncatus y O. histrionica; como se planteó inicialmente, debe existir
una variación ya que cada especie tiene diversos compuestos químicos en su mucosoma, que
al final determinaron la cantidad y la velocidad de proliferación que tuvo Bd. Es posible que
la combinación de los anticuerpos de la mucosa, los péptidos antimicrobianos, los alcaloides,
los metabolitos y la temperatura constante le confirieran una ventaja al hongo, pues este al
ser un patógeno puede volverse generalista con su alimento en aptas condiciones. (Rachowicz
et al., 2005). Además de esto, según un estudio realizado por Woodhams y colaboradores en
el 2007, se encontró que algunas especies poseen una defensa inmunológica innata que se
expresa en el momento de aparición de la enfermedad, lo que les confiere una mayor
probabilidad de sobrevivir; este puede ser el caso de O.histrionica quien es capaz de convivir
en zonas de Bd sin ver una disminución en sus poblaciones (Palacios, 2014). Faltan realizar
estudios que determinen si las poblaciones de R. palmatus y D. truncatus son capaces de
habitar ambientes con presencia del patógeno sin ver un descenso en su población.
28
En cuanto al peso de los individuos y la afectación de Bd se observó que no existe una
relación directamente proporcional, pues los valores del coeficiente de correlación múltiple
oscilan entre 0,00 y 0,29 y los del Coeficiente de determinación R^2 es más cercano a 0. Los
individuos de gran tamaño no tendrían necesariamente más mucosoma o un mucosoma más
activo. Su abundancia podría estar más re,lacionada con factores como la historia de vida y
el contexto ambiental, más no al tamaño corporal de la especie.
Figura No. 19: Variación de las concentraciones (crecimiento del hongo Bd) en función del
tiempo de cada uno de los tratamientos utilizados durante el proyecto
10. CONCLUSIONES
10.1 Los resultados sugieren que el mucosoma de las familias Dendrobatidae y Aromobatidae
favorecieron el crecimiento de Batrachochytrium dendrobatidis.
10.2 Rheobates palmatus fue la especie cuyo mucosoma generó mayor efecto positivo al
crecimiento del Bd durante el estudio
10.3 No se encontró una correlación entre el peso de los individuos y el efecto del mucosoma
sobre el quitridio.
29
10.4 Se estandarizó una metodología para el análisis del mucosoma y el crecimiento de
Batrachochytrium dendrobatidis , ya que los estudios realizados anteriormente solo tenían en
cuenta el antagonismo con bacterias y péptidos antimicrobianos.
11. RECOMENDACIONES
Realizar estudios donde se utilicen los extractos de alcaloides de cada uno de las
especies para determinar si estos tienen un efecto inhibitorio frente a
Batrachochytrium dendrobatidis.
Es importante determinar si los individuos están infectados con Bd previo al
experimento. Para esto se puede tomar un frotis de la piel y hacer una prueba
diagnóstica usando técnicas moleculares como PCR convencional o PCR en tiempo
real.
Utilizar especies de otras familias de anuros para comparar el crecimiento de
Batrachochytrium dendrobatidis respecto a individuos con alcaloides.
30
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ANEXOS
Anexo No. 1
Resultados obtenidos en función del tiempo de medición de la absorbancia neta de los
controles e individuos de estudio
Especie
Individuos
Concentración
Blanco inicial
Absorbancia individuos y controles
Absorbancia neta
Hora
palm 1 0.200 0.032 0.416 0.384 24
palm 1 0.200 0.032 0.494 0.462 48
palm 1 0.200 0.032 0.506 0.474 72
palm 1 0.200 0.032 0.565 0.533 96
palm 1 0.100 0.033 0.407 0.374 24
palm 1 0.100 0.033 0.478 0.445 48
palm 1 0.100 0.033 0.504 0.471 72
palm 1 0.100 0.033 0.582 0.549 96
palm 1 0.010 0.034 0.361 0.327 24
palm 1 0.010 0.034 0.440 0.406 48
palm 1 0.010 0.034 0.455 0.421 72
palm 1 0.010 0.034 0.497 0.463 96
palm 2 0.200 0.034 0.421 0.387 24
palm 2 0.200 0.034 0.507 0.473 48
palm 2 0.200 0.034 0.515 0.481 72
palm 2 0.200 0.034 0.541 0.507 96
palm 2 0.100 0.034 0.379 0.345 24
palm 2 0.100 0.034 0.454 0.420 48
palm 2 0.100 0.034 0.457 0.423 72
palm 2 0.100 0.034 0.531 0.497 96
palm 2 0.010 0.034 0.417 0.383 24
palm 2 0.010 0.034 0.493 0.459 48
palm 2 0.010 0.034 0.461 0.427 72
palm 2 0.010 0.034 0.525 0.491 96
palm 3 0.200 0.033 0.443 0.410 24
palm 3 0.200 0.033 0.510 0.477 48
palm 3 0.200 0.033 0.489 0.456 72
palm 3 0.200 0.033 0.556 0.523 96
palm 3 0.100 0.033 0.312 0.279 24
palm 3 0.100 0.033 0.386 0.353 48
palm 3 0.100 0.033 0.378 0.345 72
palm 3 0.100 0.033 0.419 0.386 96
palm 3 0.010 0.034 0.384 0.350 24
palm 3 0.010 0.034 0.472 0.438 48
palm 3 0.010 0.034 0.498 0.464 72
palm 3 0.010 0.034 0.553 0.519 96
palm 4 0.200 0.034 0.271 0.237 24
palm 4 0.200 0.034 0.460 0.426 48
38
palm 4 0.200 0.034 0.457 0.423 72
palm 4 0.200 0.034 0.499 0.465 96
palm 4 0.100 0.033 0.211 0.178 24
palm 4 0.100 0.033 0.301 0.268 48
palm 4 0.100 0.033 0.308 0.275 72
palm 4 0.100 0.033 0.328 0.295 96
palm 4 0.010 0.034 0.337 0.303 24
palm 4 0.010 0.034 0.493 0.459 48
palm 4 0.010 0.034 0.305 0.271 72
palm 4 0.010 0.034 0.177 0.143 96
trun 1 0.200 0.034 0.376 0.342 24
trun 1 0.200 0.034 0.468 0.434 48
trun 1 0.200 0.034 0.497 0.463 72
trun 1 0.200 0.034 0.520 0.486 96
trun 1 0.100 0.034 0.306 0.272 24
trun 1 0.100 0.034 0.333 0.299 48
trun 1 0.100 0.034 0.312 0.278 72
trun 1 0.100 0.034 0.419 0.385 96
trun 1 0.010 0.034 0.249 0.215 24
trun 1 0.010 0.034 0.327 0.293 48
trun 1 0.010 0.034 0.247 0.213 72
trun 1 0.010 0.034 0.370 0.336 96
trun 2 0.200 0.034 0.288 0.254 24
trun 2 0.200 0.034 0.331 0.297 48
trun 2 0.200 0.034 0.297 0.263 72
trun 2 0.200 0.034 0.392 0.358 96
trun 2 0.100 0.035 0.387 0.352 24
trun 2 0.100 0.035 0.456 0.421 48
trun 2 0.100 0.035 0.459 0.424 72
trun 2 0.100 0.035 0.519 0.484 96
trun 2 0.010 0.034 0.413 0.379 24
trun 2 0.010 0.034 0.493 0.459 48
trun 2 0.010 0.034 0.493 0.459 72
trun 2 0.010 0.034 0.550 0.516 96
trun 3 0.200 0.033 0.348 0.315 24
trun 3 0.200 0.033 0.421 0.388 48
trun 3 0.200 0.033 0.412 0.379 72
trun 3 0.200 0.033 0.466 0.433 96
trun 3 0.100 0.034 0.296 0.262 24
trun 3 0.100 0.034 0.327 0.293 48
trun 3 0.100 0.034 0.318 0.284 72
trun 3 0.100 0.034 0.391 0.357 96
trun 3 0.010 0.035 0.364 0.329 24
trun 3 0.010 0.035 0.441 0.406 48
trun 3 0.010 0.033 0.352 0.319 72
39
trun 3 0.010 0.035 0.539 0.504 96
trun 4 0.200 0.033 0.372 0.339 24
trun 4 0.200 0.033 0.345 0.312 48
trun 4 0.200 0.033 0.347 0.314 72
trun 4 0.200 0.033 0.424 0.391 96
trun 4 0.100 0.033 0.389 0.356 24
trun 4 0.100 0.033 0.385 0.352 48
trun 4 0.100 0.034 0.41 0.376 72
trun 4 0.100 0.033 0.420 0.387 96
trun 4 0.010 0.034 0.351 0.317 24
trun 4 0.010 0.034 0.391 0.357 48
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40
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bdm 1 0.000 0.034 0.061 0.027 72
bdm 1 0.000 0.034 0.12 0.086 96
bdm 2 0.000 0.034 0.334 0.300 24
bdm 2 0.000 0.034 0.188 0.154 48
bdm 2 0.000 0.034 0.055 0.021 72
bdm 2 0.000 0.034 0.103 0.069 96
bdm 3 0.000 0.033 0.323 0.290 24
bdm 3 0.000 0.034 0.083 0.049 48
bdm 3 0.000 0.034 0.079 0.045 72
bdm 3 0.000 0.034 0.091 0.057 96
41
Anexo No. 2
Disposición en la placa de cada uno de los controles y concentraciones propuestas para el
estudio