PROKARYOTLARDA GEN İFADESİNİN DÜZENLENMESİ:

Gen ifadesi neden ve nasıl kontrol edilir?

Prokaryotlarda gen ifadesinin sürekli kontrol edildiğini gösteren deliller nelerdir:

Bakteriler çevre koşullarındaki değişikliklere bağlı olarak ortaya çıkan genetik transkripsiyonu uyarmak uyarılmasını incelemek için mükemmel modellerdir. Ancak transkripsiyon sonrası regülasyonun varlığı da önemlidir.

Prokaryotlarda çevre koşullarına cevap veren etkin genetik mekanizmalar bulunuyor. Gen ifadesinin regülasyonu hücrenin metabolik ihtiyacını karşılayan gen ürününe gereksinimine göre genleri açıp kapayan son derece etkin bir sistemdir. Bu sistem genetik mekanizmalarca kontrol edilmektedir.

Gen ürünleri bulunuşlarına göre:

Uyum sağlayan : adaptif, indüklenebilen ,uyarılabilen(fakültatif) enzimler denir. Her zaman var olanlara ise konstitütif enzim denir.

Konstitütif enzimler yapısal enzimler olarak da bilinmektedir. Bu enzimler hücrede her zaman sentez edilmektedir. Fakültatif ya da adaptif olarak adlandırılan enzimler yalnızca substrat varlığında sentez edilebildiklerinden bunlara sonraları uyarılabilen; indüklenebilen enzimler denir. Diğer alternatif model ise uyarılabilen modelin aksine metabolik son ürün uyarmak yerine transkripsyonu baskılayarak baskılanabilir sistem adı verilmektedir. Enzim substratı kendi sentez yolunu baskılamaktadır.

Uyarılabilen ve baskılanabilen sistemlerin her ikisinde negatif ve pozitif kontroller bulunuyor. Negatif kontrolde regülatör tarafından engellenmedikçe genetik ifade gerçekleşir. Pozitif kontrolde ise sadece regülatör molekülün RNA sentezini doğrudan uyarması ile transkripsiyon gerçekleşir. Yani uyarıcı rol oynayan laktoz doğrudan transkripsiyonu uyarmakla gen regülasyonun pozitif kontrolünü sağlıyor.

E. coli’de laktoz metabolizması:

Yapısal genler tek bir regülatörce kontrol edilen kümeler halindedir.

OPERON: birbiri ile aynı işlev gören ürünleri, sentezleyen genlerin oluşturduğu kümelerdir.

Regülatör alan ve gen kümesi:

Operon modelinde regülatör bir genin ve gen kümesinin oluşturan bir regülatörün bulunuşu bu sistemde gen ifadesinin anlaşılması açısından önemlidir. Regülatör elemanların şifreleme yapmak yerine , yapısal genlerin işlevini düzenler.

YAPISAL GENLER: Enzimlerin birincil yapısını şifrelemek ile görevli olan enzimlerdir.

LacZ : beta galaktozidaz enzimi

LacY: permeaz enzimi

LacA : transasetilaz enzimi

NEGATİF VE POZİTİF KONTROLLER:

1-) NEGATİF KONTROL:

Bu durumda ortamda laktoz bulunmuyor. Laktoz olamadığından bununla ilgili genlerin sentezi hücre tarafından gerçekleştirilmez. Çünkü hücre enerjisini tasarruflu kullanmayı tercih eder her zaman. Regülatör bölge tarafından sentezlenen represör protein operatöre bağlanır ve bu bağlanma RNA polimerazın promotora bağlanmasını engeller. RNA polimeraz bağlanamadığından bu genlerin ifadesi de gerçekleştirilemez.

2-) POZİTİF KONTROL:

Pozitif kontrolde ortamda laktoz bulunuyor. Ortamda laktoz olduğunda bunun represöre bağlanması neticesinde represörün üç boyutlu yapısı değişeceğinden operatöre bağlanamaz. O bölgenin açık kalmasına bağlı olarak da RNA polimeraz promotora bağlanır ve ilgili genlerin ifadesi gerçekleştirilir.

KATABOLİK AKTİVATÖR VE Lac OPERONUNDA POZ KONTROLÜ:

cAMP’nin varlığında ve CAP

laktoz ve glukoz birlikte varsa durum nedir?Bu durumda işe CAP dahil olurCAP glukoz varken Lac operonu baskılanır bu yüzden katabolik baskılanma adını alır.Laktoz varlığında lac baskılayıcıya bağlanır ve operon aktiftir.Polimeraz promotora bağlanır ve üst bölgede l ve 0 arasındadır.İncelemelerde CAP ortamda bulunduğunda enzim promotora bağlanmaktadır. Dolayısıyla operon açıktır.Mekanizma aşağıdaki iki şekilde gösterilmiştir.

Glukoz yokken:

CAP molekülü CAP bölgesine bağlanır ve bu sayede enzim promotor alanına yerleşir.Gen ifadesi olur.

CAP- katabolit aktivatör ile Lac operonun pozitif kontrolü:

Glukoz var:

CAP’ın CAP bölgesine bağlanması cAMP gerektirir.Siklik AMP ,CAP ve polimeraz bağlanması bir tür kooperativitedir.

LAC OPERONU İLE İLGİLİ YENİ YAKLAŞIMLAR:

Lac operon lac represör için 3 operatör bölgeye sahiptir.Genetik ve kristalografik çalışmalar lac represörün bağlanma mekanizmasının düşünüldüğünden daha kompleks olduğunu göstermiştir. 3 operator bölgesi keşfedilmiştir: >>> O1-promotorun yanında >>> O2-lacZ kod bölgesinin downstreamında>>> O3-CAP bölgesinin hafif upstreamında bulunur.

Hipoteze göre lac represörün ifade edilebilmesi için 3 operatörden 2 sine bağlanması gerekir.Lac represör aynı anda O1 ve O2 ,O1 ve O3'e bağlanabiliyorken O2 ve O3'e bağlanamıyor. Lac represörün iki operatör bölgeye bağlanması DNA'nın bir ilmik oluşturmasını gerektiriyor.DNA'nın ilmik oluşturması operatör bölgeleri birbirine yaklaştırıyor.Bu da represör proteinin bağlanmasını kolaylaştırır.

Promotor ve yapısal genler arasında operatör bölge ve represör proteini kodlayan İ geni bulunur.Represör gen represör mRNA oluşumu için RNA polimerazın bağlandığı kendine ait bir promotora sahiptir. Allolaktoz ve IPTG gibi indükleyicilerin yokluğunda İ geni transkribe edilir ve oluşan represör protein lac operonun operatör bölgesine bağlanarak Z,Y ve A genlerinin transkripsiyonuna engel olur.İndükleyicilerin varlığında,indükleyici represöre bağlanır ve represörün operatör bölgeye bağlanmasını önleyerek dolaylı olarak Z Y ve A genlerinin transkripsiyonunu aktive eder. Normalde E.coli bu üç preteini çok az miktarda sentezler,ancak besin ortamına laktoz konulduğunda her bir enzimin miktarında koordineli ve büyük bir artış meydana gelir.Böyle

sadece gerektiği zaman sentezlenen enzimlere indüklenebilir enzim ve bu olaya indüksiyon denir.(Hücrede çevre koşullarına bakılmaksızın sürekli olarak sentezlenen enzimlere ise kostitütif enzimler denir.)Lac operonun indüksiyonunda,hücrede indüksiyondan önce -galaktozidaz molekülleri laktozu allolaktoz denen ve lac operonundaki bu üç geni aktive eden

bir moleküle dönüştürür dolayısıyla allolaktoz indükleyici olarak i,şlev görür.Laktoz operonunu indükleyen diğer bir indükleyici de laktozun kükürtlü sentetik analoğu olan izopropilthiogalaktozid(IPTG) dir.IPTG ,allolaktoz gibi E.coli tarafından metabolize edilmez

buyüzden indüksiyon deneylerinde çok kullanışlıdır.Özellikle E.coli'de bu amaçla yoğun çalışmalar yapılmıştır.Bir hücredeki genlerin çoğu her zaman gerek duyulmayan fonksiyonları

kodlar örneğin;bakteriler glukoz içeren bir besiyerinde üretiliyorlarsa onların laktoz veya selüloz gibi alternatif C kaynaklarını kullanmalarını sağlayan enzimleri üretmelerine gerek yoktur.Bu yüzden gereksiz enerji tüketimine engel olmak için hücrede fiziksel ve besinsel ortama cevapta genlerin ifadesini kontrol etmek için regülatör sistemler mevcuttur.Gen ifadesinin kontrolü transkripsiyon, mRNA işlenmesi veya translasyon gibi farklı düzeylerde ortaya çıkabilir.Ancak bu kontrol çoğunlukla RNA polimerazın promtora bağlanması dolayısıyla sentezlenen RNA miktarını hızlı ve hassas bir şekilde kontrolünü modüle eden düzenleyici proteinlerin işlev yaptığı transkripsiyon seviyesindedir. Kaynak: www.csus.edu/indiv/d/dulaik/GeneticsLectures07/L12_Genetics_07.ppt

Prokaryotic and Eukaryotic Gene Expression

Moleküler biyoloji Physiology of the bacterial cell Genetic regulatory mechanisms and the ecological of E.coli

E.coli hücrelerinde β- galaktosidaz sentezinin kontrolü:

β- galaktosidaz: bu enzim laktozun bileşenlerine (glukoz ve galaktoz ) hidrolizini katalizlemektedir.

E.coli’deki beta-galaktosidazdaki enzim tetramerik yapıdadır. Enzimin aktif bölgesi laktoza komplamenter olan bir paket içindeki 4 domain residuelerden şekillenmiştir.

Laktoz analogları:

Isopropyl-β-D-thio-galactoside (IPTG): fiziksel işlemler için lac operonun bir indükleyici olarak fonksiyon göstermektedir. IPTG represöre bağlanarak onu inaktive etmektedir. Ancak şunu da unutmamak gerekiyor ki bu molekül β-galactosidaz için substrat değildir. İn vitro çalışmalarada IPTG ‘nin avantajlarında biri E. Coli tarafından katabolize edilmemesidir.

Bu şekilde bu molekülün konsantrasyonu sabit kalıyor.

IPTG ‘nin hücre içine alınması laktoz permeaz aktivitesine bağlıdır.

Phenyl-β-D-galactose (phenyl-Gal): β-galactosidaz için bir substrattır. Ancak bu molekül ne represörü aktive ediyor ne de bir indükleyici olarak fonksiyon göstermiyor. Yaban tipteki hücreler çok az miktarda β-galactosidaz enzimini çok az üretiyorlar ve phenyl-Gal in karbon ve enerji olarak kullanıldığı ortamlarda gelişme gösterememektedir.

ONPG(orthonitrophenol): β-galactosidaz aktivitesinin renkli indikatörü olarak fonksiyon gösteren bir bileşiktir. ONPG β-galactosidaz testleri için sıklıkla kullanılan ve sarı renk ile

karakterize edilen bir moleküldür.

Allolactose: laktozun bir izomeridir ve lac operonun indüklenmesini sağlamaktadır.

laktozda galactose-(β1->4)-glucoseallolaktozda galactose-(β1->6)-glucose

laktoz β-galactosidaz aracılığıyla allolaktoza dönüştürülmektedir.

DENEYİN YAPILIŞI:

N.A’ da hücreler üretilecek

1 öze dolusu hücre büyüme ortamına inoküle edilecek

24 saat inkübe edilecek

1 ml ortam alınıp EÜO’ da inokule edilecek

16 saat 37°C de inkübasyon

1ml ortam alınır , buz banyosunda 30sn homojenize edilir.

+4°C’de 5ı boyunca 10000g’de santrifüj edilir.

Santrifüjden sonra elde edilen süpernatant ile

Bradford yöntemi ile protein tayini enzim aktivite tayini yapılacak

hücre IPTG IPTG+Lac Glukoz+lac IPTG+glu glu3,7mg 3,7mg+0,312g 0,156g+0,15g 3,7mg+0,312g 0,312g

Aktivite tayin yöntemi:

Kör(ml) Örnek(ml)Fosfat tamponu 2,75 2,35ONPG ----------- 0,40Enzim 0,25 0,25 Sarı renk oluşana kadar 37°C de inkübe edilecekNa2CO3 1,00 1,00

Tüplerde sarı renk görülünce 1ml Na2CO3 eklenerek reaksiyonun sonlanması sağlandı. Daha sonra geçen süre kaydedildi. 420nm de absorbans okundu. Tüm bu işlemlerin sonucunda elde edilen sonuçlara bakacak olursak:

Tüpler Tüplerin içinde Renk oluşumu Geçen süre(dk) 420nm deki absorbans değeri

1. Hücre Sararma gözlenmedi

--------------- -----------------

2. Hücre+IPTG Sararma yok ---------------- -----------------3. IPTG+laktoz Sarı renk var 6 dakika 0,3354. Glukoz+laktoz Sarı renk var 7 dakika 0,0705. IPTG+glukoz Sarı renk var 6 dadika 0,0746. Hücre+glukoz Sararma

gözlenmedi---------------- -----------------

Hacimsel aktivite (U/ml):

A420 x 2,666/t(dakika) formülü kullanılacak

A420 : 420nm de okunan absorbans değeri

T: dakika

3.tüp(IPTG+Laktoz):

0,335x2,666/6 dakika 0,149(U/ml)

4.tüp için(glukoz+laktoz):

0,070 x 2,666/7 0,026(U/ml)

5.tüp için(IPTG+GLUKOZ):

0,074 x 2,666/6 0,033(U/ml) sonuçları elde edildi. Diğer kalan tüplerde renk oluşumu gözlenmediği için absorbansları okunmadı.

Bradford yöntemi ile protein tayini:

BRADFORD (COOMASSİE BLUE ) YÖNTEMİ: Bradford yöntemi bir solüsyonda bulunan protein konsantrasyonunun belirlenmesinde kullanılan spektoskobik bir yöntemdir. Oldukça subjktif olan bu yöntem çlçülen proteinin aminoasit kompozisyonuna bağlıdır.

Yöntemin prensibi: protein boya kompleksinde iki tip bağ interaksiyonu gerçekleşiyor. Coomassie boya önce kendisinin serbest protonlarını protein üzerindeki iyonize olabilen gruplara veriyor. Buna bağlı olarak proteindeki doğal durum bozuluyor ve sonuçta hidrofobik oluklar ortaya çıkıyor. Proteinin oluklarındaki tersiyer yapı boyanın non-polar bölgesine kovalent olmayan bağlarla bağlanıyor. Bu etkileşime bağlı olarak da mavi renk oluşumu gözleniyor.

Bu yöntem, Coomassie Brilliant Blue G-250 boyasının farklı konsantarsyonlardaki protein çözeltilerinde değişik şiddette mavi renk ortaya koymasından yararlanılarak geliştirilmiştir.

Boyanın özellikle arginin gibi bazik amino asitler ve bazı aromatik amino asitlere bağlanma eğiliminde olduğu gösterimiştir.

Dolayısıyla bu yöntemde proteinin primer yapısının önemi vardır. Duyarlılık sınırları, total reaksiyon karışımında (5.1 ml) 20-140 μg olan bu yöntemde

(örnek konsantrasyonunun 0.2-1.4 mg/ml arasında olması demektir) asidik boya proteine bağlanır ve 495-595 nm arasında maksimum absorbsiyon değerleri elde edilir. Bu deneyde standart protein olarak miktarı belirlenecek proteinin kendisi kullanılırsa

en doğru sonuç alınır. Standart olarak çoğunlukla kullanılmakta olan sığır serum albumininden (bovine

serum albumin, BSA) yararlanılabilir, ancak BSA, boya bağlama kapasitesinin fazla olması nedeniyle, Bradford deneyinde diğer yöntemlere göre daha yüksek değerler ortaya koyar. Bu da protein miktarının gerçeğinden daha düşük çıkmasına yol açar. Bu nedenle standart protein olarak sığır γ-globulin ya da yumurta albumini tercih edilir.

Standartın hazırlanması: 1mg/ml BSA çözeltisi stok olarak kullanıldı.

Standart(ml) Kör(ml) Örnek(ml)Distile su --------- 0,5 -------Standart çözelti 0,5 ------- -------Örnek çözeltisi --------- ------- 0,5Bradford reaktifi 1,0 1,0 1,0Tüpler karıştırılır ve 10 dakika oda sıcaklığında bekletilir. 595 nm de absorbans okunur

Standart çözeltisi Konsantrasyon(mg/ml) 595 nm deki absorbans1.tüp 0,02 0,23342.tüp 0,05 0,33553.tüp 0,10 0,60574.tüp 0,15 0,70125.tüp 0,20 0,7769

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

f(x) = 3.12815196998124 x + 0.205212195121952R² = 0.940592598721296

STANDART GRAFİĞİ

Series2Linear (Series2)

konsantrasyon mg/ml

ABSO

RBAN

S-59

5nm

10 kat seyreltilen örneklerden elde edilen absorbans değerleri:

tüpler Absorbans değerleri(595nm de)1.tüp 0,50172.tüp 0,43673.tüp 0,54234.tüp 0,32615.tüp 0,54606.tüp 0,4787

Her tüp için y=3,1282x formülünden yola çıkarsak:

1.tüp için: y=3,1282x ise 0,5017=3,1282x

x : 1,60 mg/ml

2.tüp için: y=3,1282x

0,4367= 3,1282x ise x:1,40 mg/ml

3.tüp için: y=3,1282x

0,3261= 3,1282x ise x: 0,104x10=1,04 mg/ml

4.tüp için: y=3,1282x 0,5423=3.1282x ise x:0,173x10 x=1,73mg/ml

5.tüp için: y=3,1282x 0,5460= 3,1282x ise x:0,174x10 x=1,74mg/ml

6.tüp için: y=3,1282x 0,4787=3.1282x ise x:0,153x10 x=1,53mg/ml

Tüm bu elde ettiğimiz değerleri bir tabloya dökecek olursak:

Aktivite(U/ml) Protein konsantrasyonu(mg/ml)

Spesifik aktivite(U/mg)

Hücre ----------- 1,60 --------Hücre+IPTG ----------- 1,40 --------IPTG+lactoz 0,149 1,04 0,143Glukoz+laktoz 0,026 1,73 0,015IPTG+ Glukoz 0,033 1,74 0,019Hücre+glukoz ----------- 1,53 --------

SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ VE YORUM:

Deneyde elde edilen sonuçlara göre: hücre, hücre+IPTG ve hücre + glukoz tüplerinde zaten bir sararmanın olmasını beklemiyorduk. Spesifik aktivitenin en yüksek çıktığı deney tüpümüz ise IPTG+laktozun olduğu tüptür. Lac operonundaki genel mekanizmayı düşündüğümüzde ortamda bir indükleyici( IPTG), substratın bulunmasına bağlı olarak resresör proteinin operatöre bağlanamaması ve RNA polimeran enzimini ilgili promotora etkili bağlanması sonucunda beta galaktosidaz enziminin ifadesi gerçekleşmiştir. Ortamda da substratın bulunmasına bağlı olarak buradaki spesifik aktivite diğer tüplere oranla daha yüksek çıkmıştır. 4. ve 5. Tüpteki değerlere bakarsak: buradaki iki değer birbirine oldukça yakındır. Bu durum ile ilgili olarak kesin bir şey söylemek çok zordur. Glukoz varlığında normalde katabolik represyona bağlı olarak lac operonundaki yapısal genlerin ifade edilmemesi beklenir. Çünkü hücre ortamdaki glukozu öncelikli olarak kullanmayı tercih edecektir. Ama RNA polimeraz zayıf da olsa promotora bağlanıp lac operonundaki genlerin minimal düzeyde de olsa ifade olmasını sağlıyor. 5. Tüpte bir indükleyicini de olması enzim ifadesinin artmasını da sağlamış olabilir. Birinci tüpte sadece hücrenin olduğu tüpte bir aktivite gözlenememesi bize ortamnada bir indukleyicinin varlığının olması gerektiğini de göstermektedir. Ortamda IPTG olmadığında ve bir substrat bulunmadığında represör protein operatör bölgeye bağlanarak RNA polimerazın promotora bağlanmasını engellediğinden beta galaktasidaz enziminin ifadesi gerçekleşemiyor.

İncelediğimiz canlı prokaryotik bir organizmadır. Prokaryotlarda gen regülsyonu genellikle transkripsiyonel düzeyde gerçekleşmektedir. İşte bir takım genlereden sentezlenen indükleyici, baskılayıcı moleküller, üç boyutlu yapının değişmesine bağlı olarak bir takım genlerin regülasyonu sağlanabilmektedir.

BİYOKİMYA –III LAB. RAPORU

ADI: EDA

SOYADI: AÇIKGÖZ

NUMARA: 04-04-6253

ASİSTAN: ALPER AKKAYA

DENEYİN ADI: E.coli HÜCRELERİNDE β- GALAKTOSİDAZ SENTEZİNİ İNDÜKSİYONU