programa mitogÊnico desencadeado durante a infecÇÃo celular pelo vÍrus vaccÍcia laboratório de...
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PROGRAMA MITOGÊNICO PROGRAMA MITOGÊNICO DESENCADEADO DURANTE A DESENCADEADO DURANTE A
INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍCIAVACCÍCIA
Laboratório de Vírus Departamento de Microbiologia Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
Grupo de Transdução de SinalOrientador: Cláudio Antônio Bonjardim
Linha de Pesquisa
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INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO
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VíruVíruss
Agentes infecciosos
Constituídos basicamente de uma cápsula protéica que guarda o material genético – RNA ou DNA.
Parasitas intracelulares obrigatórios
Extremamente dependentes de toda maquinaria energética e biossintética de seus hospedeiros
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Interação Vírus-Interação Vírus-hospedeirohospedeiro
Hospedeiro susceptível
Interações altamente especializadas
Tropismo da infecção
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Interação Vírus-Interação Vírus-hospedeirohospedeiro
Manipulação das respostas e funções celulares do hospedeiro:
Evasão da resposta imune
Interferência na produção de citocinas
Controle da repressão/indução da apoptose
Controle da proliferação e/ou diferenciação celular
Criação um ambiente celular propício para uma multiplicação bem-sucedida
Manipular e intervir nas vias de sinalização que regulam esses processos
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Alterações nas vias de sinalização celular e transcrição gênica do hospedeiro
Citoplasma
Núcleo
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MAPK
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MAPKs MAPKs (Mitogen-activated protein kinase)
Proliferação
Apoptose
Diferenciação
Sobrevivência
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MEKKs
MKK7MKK4 MKK3 MKK6
JNK/ SAPK
p38
MAPKKKMAPKKK
MAPKKMAPKK
MAPKMAPK
Cascata de Sinalização das MAPKsCascata de Sinalização das MAPKs
Resposta Resposta BiológicaBiológica
EstímuloEstímuloEstresse, Fatores de Estresse, Fatores de Crescimento, GPCRs, Crescimento, GPCRs,
Citocinas InflamatóriasCitocinas Inflamatórias
Raf
ERK
MEK
Fatores de Fatores de Crescimento, Crescimento,
Mitógenos, GPCRsMitógenos, GPCRs
Crescimento, Crescimento, Diferenciação, Diferenciação,
DesenvolvimentDesenvolvimentoo
Inflamação, Apoptose, Inflamação, Apoptose, Crescimento, Crescimento, DiferenciaçãoDiferenciação
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Os Vírus e as Os Vírus e as MAPKsMAPKs
Hepatite B (HBx)
HIV
Herpes
Influenza
Hepatite C
Vírus Vaccinia
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Vírus VaccíniaVírus Vaccínia
Pertencente à mesma família do vírus causador da varíola
Utilizado para imunização contra a varíola (1967 – 1977)
Atualmente – vírus de laboratório
Década de 80 – grande interesse pelo VV como ferramenta de estudos em biologia molecular
Recentemente, verificou-se a emergência de zoonoses causadas pelo vírus vaccínia-like.
Erradicação da doença no mundo
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Vírus VaccíniaVírus Vaccínia
Família: Poxviridae
Subfamília: Chordopoxvirinae
Gênero: Orthopoxvirus
Características:
Complexos vírus envelopados que medem em torno de 300 nm;
Genoma – DNA fita dupla linear;
Ciclo replicativo citoplasmático.
2 tipos de partículas infectivas: - IMV: 90% da progênie viral - EEV: principais formas de disseminação do VV
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Genoma do Vírus VaccíniaGenoma do Vírus Vaccínia
Genes ConservadosITRs ITRs
191 Kpb / 263 genes
Genes essenciais – polipeptídeos estruturais e enzimas envolvidas no
metabolismo da DNA
Variáveis - Genes não-essenciais – interação com o
hospedeiro e virulência
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Núcleo
Replicação doDNA
Transcrição de genes tardios
Desnudamentosecundário
Desnudamentoprimário
Ciclo de MultiplicaçãoCiclo de Multiplicação
VírionIMV
EEVIEV Morfogênese
IMV
Transcrição de genes imediatamente
precoces
Transcrição de genes imediatamente
precoces
Transcrição de genes
precoces
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Poxvírus e Poxvírus e MitogêneseMitogênese
Fator de Crescimento do VV - VGF
Similaridades estruturais e funcionais ao EGF e TGF- ;
Liberado no sobrenadante das células infectadas;
Estimula o crescimento e/ou a atividade metabólica de células não infectadas adjacentes, favorecendo a expansão da infecção;
A atividade mitogênica de VGF é considerada benéfica para a replicação do VV.
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Citoplasma
Núcleo
EGR-1
c - fos
MEK
ERK 1/2
Magalhães et al, 2001Elk-1
MEK
ERK 1/2
RSK 2A
ndra
de e
t al, 2
00
4
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Citoplasma
Núcleo
EGR-1
Andra
de e
t al, 2
00
4
TyK
MEK
ERK
RSK-2
Elk-1
STK
?
?
?
c-jun
JNK
CREB/ATF-1
?
?
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TESE DE DOUTORADO
Significado Funcional do Gene de Resposta Precoce ao Crescimento Significado Funcional do Gene de Resposta Precoce ao Crescimento – EGR-1 – para a Biologia do Orthopoxvirus Vaccinia– EGR-1 – para a Biologia do Orthopoxvirus Vaccinia
Patrícia Nogueira da Gama Silva
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+1 c-fos
Citoplasma
Núcleo
estágio precoce (0 -1 hpi)adsorção penetração
estágio precoce-tardio (1-36 hpi)pós-penetração progênie
MEK
ERK
PKA
SRF
AP-1SRE CRE
ATF-1
+1 egr-1
SRE
MEK
ERK
TyK
TCFSRF
ELK-1 RSK-2
Citoplasma
Núcleo
VV
A BVV
STK
estágio precoce-tardio (1-36 hpi)Pós-penetração progênie
+1 ???
EBS
Egr-1
Egr-1
C
Citoplasma
Núcleo
+1 ???
AP-1
? JUN
?
?
UO126
+1 c-fos
Citoplasma
Núcleo
estágio precoce (0 -1 hpi)adsorção penetração
estágio precoce-tardio (1-36 hpi)pós-penetração progênie
MEK
ERK
PKA
SRF
AP-1SRE CRE
ATF-1
+1 egr-1
SRE
MEK
ERK
TyK
TCFSRF
ELK-1 RSK-2
Citoplasma
Núcleo
VV
A BVV
STK
estágio precoce-tardio (1-36 hpi)Pós-penetração progênie
+1 ???
EBS
Egr-1
Egr-1
C
Citoplasma
Núcleo
+1 ???
AP-1
? JUN
?
?
UO126
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+1 c-fos
Citoplasma
Núcleo
estágio precoce (0 -1 hpi)adsorção penetração
estágio precoce-tardio (1-36 hpi)pós-penetração progênie
MEK
ERK
PKA
SRF
AP-1SRE CRE
ATF-1
+1 egr-1
SRE
MEK
ERK
TyK
TCFSRF
ELK-1 RSK-2
Citoplasma
Núcleo
VV
A BVV
STK
estágio precoce-tardio (1-36 hpi)Pós-penetração progênie
+1 ???
EBS
Egr-1
Egr-1
C
Citoplasma
Núcleo
+1 ???
AP-1
? JUN
?
?
UO126
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EGR-1
Rho RacCdc42
Ras
PAK-1PAK-1
Raf
MEK
ERK
?Citoplasma
Núcleo
Rac
PAK-1PAK-1
JNK
MKK4/7
?
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ENVOLVIMENTO DA PROTEÍNA ENVOLVIMENTO DA PROTEÍNA QUINASE - PAK1 - DURANTE A QUINASE - PAK1 - DURANTE A
INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍNIAVACCÍNIA
Luciana Garcia AndradeLuciana Garcia Andrade
Projeto de Pesquisa
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GDP
PAK-1PAK-1
PAK-1 PAK-1 (p21-activated kinase - 1)
GTPRac / Cdc42
Serina-treonina kinase
Dinâmica do Citoesqueleto /
Motilidade Celular Proliferação/Sobrevivência
(MEK/ERK)
Pro-inflamatórios/Estresse
(JNK/SAPK)
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PAK-1 PAK-1 (p21-activated kinase - 1)
Domínio Catalítico(aa 255 – 529)
PDB AI
Nck Grb2Rac
Cdc42
G
Domínio Autoinibitório
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OBJETIVOSOBJETIVOS
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GeralGeral
Analisar a contribuição da serina/treonina quinase PAK1 (p21- activated kinase) na
transmissão dos sinais mitogênicos desencadeados após a infecção de células
de fibroblasto murino A31 pelo vírus vaccínia.
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EspecíficosEspecíficos
Gerar clones expressando de maneira estável mutação que confere dominância negativa para a proteína PAK-1;
Verificar se a infecção pelo VV induz a fosforilação de PAK-1, bem como sua cinética de ativação;
Verificar o significado funcional de PAK-1 na multiplicação do vírus vaccínia.
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Materiais e Materiais e MétodosMétodos
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Células:Células A31 – clone de Balb/3T3
- Obtenção dos clones de PAK-1- Infecção / Expressão protéica
Células VERO - Produção do estoque do VV- Titulação viral
Vírus:Vírus Vaccínia WR (Western Reserve)
- Purificados /Titulados
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Vetores:
pcMV6m – WT PAK1
PAK1-WTBam HI
Eco RI
Amp
pcMV6m – DN PAK1
PAK1- K299
RBam HI
Eco RI
Amp
PAK – K299R
Dominante Negativo para PAK-1
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Sub-clonagem:
PAK1 – WT KPAK1 – DN R
pcMV6m – WT -PAK1
PAK1-WTBam HI
Eco RI
Amp
pcMV6m – PAK1 – K299R
PAK1- K299
RBam HI
Eco RI
Amp
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Transformação bacteriana:
E. coli – DH5
Transformação
LB Agar + AMP
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LB Agar + AMP
Amplificação de cópias do plasmídio
LB + AMP
PurificaçãoPequena-escala
Média-escala
Eletroforese em gel de agarose
Purificação do Plasmídio
Transfecção de células A31
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pcDNA 3– PAK-WT ou
pcDNA 3– PAK –K299R
Transfecção:
Células A31Células A31
Transfecção
G418
Seleção dos clones
resistentes
Caracterização dos clones resistentes
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Células A31 ou ClonesCélulas A31 ou Clones
Carenciadas com 1% de SFB por 12 horas
Infectadas com o VV (MOI de 10,0) por tempos variáveis
Estratégia de TrabalhoEstratégia de Trabalho
Extração de proteínas totais
“Western blot”
Extração de mRNA total
“Northern blot”
Vírus
Titulação
Análise de Multiplicação
Viral
Fenótipo de Placa de Lise
Viral
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Reação com o anticorpo primário
Transferência de “Western”
+
-
+-
Bloqueio
Reação com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase
Filme Raio-X
Sistema Revelador
Revelação
Exposição
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Pré hibridação
Hibridação com sonda marcada
Revelação
Lavagem
+
- Exposição
Transferência de “Northern”
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P-JNK
1 3 4 5 6 7 8 9 102
KDa
4654
M VV M VV M VV M VV M VV
A31 NT WT 6 WT 7 WT 8 WT 9
KDa
46
54
1 3 4 5 62 7 8 9 10
P-JNK Mock VV Mock VV Mock VV Mock VV Mock VV
A31 NT DN 1 DN 5 DN 6 DN 10
Teste – caracterização dos clones Teste – caracterização dos clones de PAK-1 de PAK-1
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Acumulação de EGR-1 induzida pelo VVAcumulação de EGR-1 induzida pelo VV
1 2 3 6 12 24 36 48 1 2 3 6 12 24 30 36 48
MOCK VV (WR) (m.o.i. 3,0)
Egr-1
Tempo (hpi)
ERK-1ERK-2
KDa
80
4442
1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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VV (WR) (m.o.i. 3,0)
- 10 20 50 100C SFB
1 2 3 4 5 6 7
18S rRNA
egr-1
H7 (M)
Co-participação de diversas vias sinalizadoras Co-participação de diversas vias sinalizadoras associadas com a indução de EGR-1 após associadas com a indução de EGR-1 após
infecção pelo VV infecção pelo VV
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MOCK EG
F
VV WR
MEK-DN 3
Egr-1
KDa
80
4442
1 2 3 4 5 6 7
ERK-1ERK-2
8 9 10 11 12 13 14
3 6 12 3 6 12 ½ 3 6 12 3 6 12 ½MOCK E
GF
VV WR
MEK-WT 11
Tempo (horas)
MEK – ERK – EGR-1MEK – ERK – EGR-1
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MEK-DN 3MEK-WT10
VV 48 hpi
Controle
MEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VVMEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VV(Fenótipo da Placa de Lise Viral)
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1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
6 12 24 48
Horas pós-infecção
Tít
ulo
Vir
al (
Lo
g)
MEK-WT10
MEK-DN3
MEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VVMEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VV(Análise da Multiplicação Viral)
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O Vírus Vaccínia induz a ativação de
proteínas quinases e genes envolvidos
com mitogênese e/ou reprogramação
celular, criando as condições necessárias
à geração eficiente de novas progênies
virais.