Modelli sperimentali per combattere la malattia di Pearson

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Le malattie mitocondriali sono un gruppo di patologie eterogenee multisistemiche dovute sia a

mutazioni del DNA nucleare che mitocondriale (mtDNA). In queste malattie lo stesso difetto

molecolare può portare a manifestazioni cliniche molto diverse e ogni organo può essere coinvolto

ad ogni età e con una variabile presentazione clinica. Al momento non sono disponibili terapie

risolutive per queste patologie.

Per quanto riguarda le malattie dovute a mutazioni del mtDNA le difficoltà maggiori nel

comprendere i meccanismi che causano la malattia sono legate alla difficoltà di avere appropriati

modelli in vivo poichè è complicato manipolare il DNA mitocondriale. Per superare questa

difficoltà proponiamo di utilizzare fibroblasti derivati da biopsie cutanee di pazienti che portano

macroriarrangiamenti del mtDNA per generare cellule indotte pluripotenti (iPSCs). Queste cellule

verranno usate per ottenere specifici tipi cellulari differenziati, ad esempio neuroni, e per generare

complesse strutture tridimensionali che mimano organi interi e che sono chiamati mini-organi.

Questo ci potrebbe consentire di ottenere modelli in vitro fisiologicamente più rilevanti rispetto alle

colture cellulari tradizionali e generare una piattaforma sperimentale per testare approcci terapeutici

sperimentali.

Il progetto prevederà la generazione e l’utilizzo di diverse cellule differenziate, neuronali e non-

neuronali a partire da cellule iPSCs ottenute riprogrammando fibroblasti derivati da pazienti che

presentano macro-riarrangiamenti (delezione del mtDNA) responsabili della sindrome di Pearson e

Kearns-Sayre. A tale scopo effettueremo, in collaborazione con la UO Neuropsichiatria Infantile, la

biopsia cutanea di pazienti affetti per ottenere i fibroblasti. Questi saranno infettati con il virus non-

integrante Sendai che esprime i 4 fattori necessari alla riprogrammazione (OCT4; c-MYC; SOX2-

KLF4) per generare cellule iPSC. Queste linee saranno caratterizzate per la loro pluripotenza

mediante PCR quantitativa e immuno-fluorescenza. Le cellule iPSC saranno poi differenziate in

neuroni e miociti mediante protocolli messi a punto nel laboratorio. Effettueremo poi una

   

caratterizzazione genetico-molecolare mediante valutazione quantitativa e qualitativa del mtDNA

nelle diverse linee cellulari (fibroblasti, iPSCs, cellule differenziate) tramite tecnologia NGS.

Prevediamo di studiare diversi parametri di funzionalità mitocondriale quali: attività della catena

respiratoria, consumo di ossigeno, livelli di ATP, potenziale di membrana, produzione di ROS,

morfologia. Tutti questi aspetti saranno valutati nella transizione da fibroblasti, iPSCs e cellule

differenziate. Queste valutazioni genetico-molecolare e biochimiche saranno il presupposto per

l’identificazione di possibili bersagli terapeutici e renderanno possibile utilizzare composti in grado

di agire su specifici meccanismi patogenetici.