UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA

QUÍMICA FARMACEUTICO BIOLÓGICA BIOSINTESÍS Y BIOTECNOLOGÍA

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Canchola Carrillo Eileen

Muñoz Herrera David

Nava Pintor Edgar Ezequiel

Ocampo Olvera Silvestre Alfredo Semestre 2014/2

Torres Torres Edna Yuzi 30 de Abril del 2014

.

INTRODUCCIÓN

Hormonas, interferones y

diversas enzimas

Técnicas de DNA recombinante Significaron una revolución en la producción de este tipo de compuestos. Permite alterar los genes y expresarlos de tal manera que se pueden obtener proteínas con propiedades funcionales mejoradas o corregir defectos genéticos

•Vector de expresión, un plásmido q contiene secuencias de control de trascripción y traducción en posiciones adecuadas. •Proteínas de eucariontes. El DNA recombinante con la secuencia que codifica la proteína también presenta las secuencias.

MARCO HISTÓRICO

• Biotecnología Aplicación de los principios de la ciencia e ingeniería al procesamiento de materiales por agentes biológicos. La definición actual se refiere también a los productos.

El consumo de la bebida aumentó

al transcurrir los siglos; se tuvieron

que desarrollar métodos que

permitieran obtener grandes

volúmenes.

RECOMBINACIÓN NATURAL Conjugación

Transducción

Transformación

MUTAGÉNESIS Herramienta para el mejoramiento de cepas.

MUTACIÓN Es un cambio heredable en la secuencia de nucleótidos del DNA.

Puede o no producir un cambio observable en el individuo.

Se presenta súbita y espontáneamente.

10-10 mutaciones por generación por gen

MUTÁGENOS FÍSICOS

• Mutaciones puntuales

• Dímeros de Timina

• Roturas cromosómicas

• Radiación UV

• Rayos γ

• Rayos X

MUTÁGENOS QUÍMICOS

Ácido Nitroso

Agentes alquilantes

Sustancias análogas a las bases nitrogenadas

Sustancias intercalantes

MUTAGÉNESIS INDUCIDA

Someter a los microorganismos a repetidas rondas de Mutagénesis, seguido de una detección y selección apropiadas de los sobrevivientes, ha sido una herramienta muy efectiva en el mejoramiento de muchos microorganismos utilizados industrialmente.

INGENIERÍA GENÉTICA DE MICROORGANISMOS Producción de proteínas en bacterias.

• La tecnología de DNA recombinante ha permitido que

secuencias específicas de ADN sean transferidas de un

organismo a otro.

• Esto puede ser utilizado para incrementar el rendimiento de un

producto mediante la remoción de los cuellos de botella en las

rutas metabólicas y amplificando o modificando pasos

específicos en la ruta metabólica.

• Dado que no hay restricción para el origen de los genes que

expresa un microorganismo, la producción de proteínas de

origen animal y vegetal se ha hecho posible

• La Ingeniería Genética implica la manipulación del DNA

fuera de la célula.

1. Aislamiento y recuperación del gen de interés.

• Regulación de su expresión.

2. 3. Inserción del DNA en la célula huésped mediante un

vector de fácil manipulación.

4. Reproducción.

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN BACTERIAS

Uso de vectores para la inserción del DNA

Usualmente resulta necesario insertar un gen exógeno en un

vector que se replica autónomamente en el microorganismo

hospedero y actúa como un transportador del segmento de

DNA exógeno insertado.

PLÁSMIDOS

• Características

• Origen de replicación

• Gen de resistencia a

antibióticos

• Comúnmente el DNA

exógeno y el plásmido

son cortados con la

misma enzima de

restricción.

• El plásmido recombinante

se introduce por

Transformación

La introducción de plásmidos recombinantes por Transformación se

puede lograr con un tratamiento de Cloruro de Calcio, lo cual somete a

la membrana celular haciéndola más permeable al DNA exógeno.

VECTORES DE FAGO Λ

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS Detección y Selección de clones Recombinantes

PCR y Bases de Datos

Expresión de los Genes clonados

Recuperación y Purificación de Proteínas

• Método de hibridación.

• Método fenotípico

• Método inmunológico

Colonias con defectos nutricionales

Métodos Genéticos

BASES DE DATOS

EXPRESIÓN DE LOS GENES INSERTADOS.

ALTOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNA

• Factores genéticos.

Características del gen, estabilidad del ARNm, Promotor empleado, cepa utilizada

• Factores fisiológicos.

Componentes del medio de cultivo, estrategias de cultivo, parámetro en el fermentador.

RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

• Acumulación de proteína en citoplasma

*Lisis de la célula

*Puede ocurrir la formación de cuerpos de inclusión.

• Acumulación de proteínas en el espacio periplasmático.

*Choque osmótico

*Separar por centrifugación

O filtración.

** remoción de ácido nucleicos

mediante agentes policatiónicos

*** precipitación de la proteína

con sale s o resinas de integración

hidrofóbica

**** purificación final por métodos

cromatográficos.

PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA EN E. coli

PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA (RENNINA)

• Es la proteasa (Aspartil-proteasa) que se produce en una mayor proporción en el cuarto estómago de los rumiantes lactantes.

RENNINA

• Se libera como PREPROQUIMOSINA

PRE 16 aa PRO 27 aa QUIMOSINA

PRO 27 aa QUIMOSINA

QUIMOSINA

¿QUÉ HACE LA RENNINA?

• Coagula la leche por la hidrólisis de k-caseina

PROBLEMA

¿Solución? Rennina producida por hongos como Mucor o Endothia

PRO 27 aa QUIMOSINA

Rennina recombinante

QUIMOSINA RECOMBINANTE

• Fusión al extremo N-terminal de LacZ o TrpE

• La secuencia de la proquimosina se insertó nmediatamente después del RBS y el codón ATG

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN LEVADURAS

GENOMA NUCLEAR S. CEREVISIAE

Distribución genoma S. cerevisiae Comparación en tamaño de genomas

GENOMA NO NUCLEAR

YAC’S “YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES”

Centromérico Episomal (Lanzadera)

MEJORA EXPRESIÓN GENÉTICA

Acetilación

Otras

• Glicosilación

• Insertar genes de glicosilación humanos

• Deleción de genes de glicosilación

• Cadena de oligohistidina

CEPA E. COLI K12 JA 198, VECTOR PBR322, GEN PROQUIMOSINA ERAN 3 SEGMENTOS SE INSERTAN EN EL VECTOR Y SE DEJA LA CEPA CON EL

VECTOR EN MEDIO PARA FORMAR CUERPOS DE INCLUSIÓN.

PRODUCCIÓN DE ANTÍGENO DE SUPERFICIE DE LA HEPATITIS B

POR LEVADURAS

VACUNA DE LA HEPATITIS B Antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg)

9 RESIDUOS DE G

3 RESIDUOS DE G

GLUCOSILACION, PLEGAMIENTO Y ACETILACIÓN DE HBSAG

Humano

• N-Glucosilado

• Exportado hacia la membrana vía Golgi

• Plegamiento en partículas de 22 nm

• Acetilado

Levadura

• No glucosilado

• Se acumula en el citoplasma

• Plegamiento en partículas de 22 nm

• Una fracción se acetila

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Uso Terapeútico

PROTEÍNAS RECOMBINANTES: USO

TERAPÉUTICO •Factor de necrosis tisular-α

Anticuerpos

•Interferones, Interleucinas , TNF Cáncer y infecciones virales

•Eritropoyetina, Hirudin, Uroquinsa, Activador de plasminógeno tisular

Enfermedades cardiovasculares

•Insulina, Hormona del crecimiento Hormonas

•Endorfinas, Neuropéptidos Enfermedades Neurológicas

•Hepatitis-B Vacunas

•Factor de crecimiento epidermico, de fibroblastos y factor VIII de la coagulación

Cicatrizantes y factores de coagulación

DNASAS: FIBROSIS QUÍSTICA

DNasas 260 aa (Pulmozyme®, FDA 1996)

Viscosidad

del moco

ERITROPOYETINA

EPOGEN® 1989

SOMATOTROPINA (HGH)

hGH

191 aa

Cadáveres Bovino o porcino

Recombinante

(E. coli)

SOMATOTROPINA

192 aa N-formilmetionina

N-formilmetionil-Hgh PROTROPIN® 1985

INSULINA

• Primera proteína recombinante de uso farmacéutico.

E. Coli

o S. cerevisiae

Cadena A Cadena B

Insulina

Humulin® , FDA 1981

INTERFERÓN

IFN-α IFN-β

IFN-γ

• Hepatitis C

• Cáncer renal

• Leucemias

• Mieloma • Esclerosis múltiple

• Leucemia

• Cáncer renal

INTERFERÓN

INTERLEUCINAS

IL-2

(PROLEUKIN®, FDA 1992)

Carcinoma renal

FACTOR ACTIVADOR DEL PLASMINÓGENO TISULAR

(TPA)

tPA (Serín proteasa)

Plasminógeno Plasmina Disolución del

coágulo

COLÁGENO

Pichia augusta

Pichia pastoris

Colágeno tipos I y III

REFERENCIAS

• Lauersen, K. J.; Berger, H.; Mussgnug, J. H.; Kruse, O. Efficient recombinant protein production and secretion from nuclear transgenes in Chlamydomonas reinhardtii . Journal of Biotechnology 167 (2013) 101-110.

• Singer, M; Berg, P. Genes y Genomas. Una perspectiva cambiante. 1993, 1a edición, Ediciones Omega, S.A, Barcelona, España. pp 227-229.

• Klug, W. S; Cummings, M.R. Conceptos de Genética. 1999, 5a edición, Prentice Hall, México. pp 453- 454 y 504.

• Glazer, AN. Nakaido, Hiroshi.(2007) Microbial Biotechnology. Fundamentals of applied microbiology. 2da Edición. Cambridge University Press. Cambridge, UK. p. 90-143.

REFERENCIAS

• Waites, MJ. (2001) Industrial Microbiology: An Introduction. Blackwell Science. London, UK. p. 80-84. 173-177.

• Mellor, J., M. J. Dobson, N. A. Roberts, M. F. Tuite, J. S. Emtage, S. White, P. A. Patel, A. J. Kingsman and S. M. Kingsman. 1983. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae. GENE 24: 1-14

• J. M. Cregg1, ,†, J. F. Tschopp1, C. Stillman1, R. Siegel1,High–Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast, Pichia Pastoris, Nature Biotechnology 5, 479 - 485 (1987) doi:10.1038/nbt0587-479