producciÓn de enzimas proteolÍticas y compuestos

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS Y

COMPUESTOS ANTIOXIDANTES EN

CULTIVOS CELULARES DE Jacaratia

mexicana CON UN INDUCTOR

INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA

MODALIDAD DE

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO

BIOTECNÓLOGO

PRESENTA:

LILIANA MONTAÑO HERRERA

DIRECTORA: DRA. MARÍA DEL CARMEN OLIVER SALVADOR

México D.F., mayo de 2007

i

ÍNDICEGENERAL

Página

I. ÍNDICE DE FIGURAS........................................................................................... iv

II. ÍNDIDE DE CUADROS........................................................................................ vi

III. ABREVIATURAS............................................................................................... vi

IV. RESUMEN.......................................................................................................... viii

1. INTRODUCCIÓN................................................................................................. 1

2. ANTECEDENTES…………………..................………………................………… 3

2.1 Enzimas………...…………………...................……………............……….. 3

2.1.1 Enzimas proteolíticas.................................................................... 4

2.1.2 Importancia biológica de las proteasas cisteínicas....................... 4

2.1.3 Importancia Industrial de las enzimas proteolíticas....................... 5

2.1.4 Fuentes vegetales de enzimas proteolíticas................................. 6

2.2.4.1 Jacaratia mexicana.................................................................... 7

2.2 Inductores................................................................................................. 8

2.3 Cultivo de tejidos vegetales...................................................................... 8

2.3.1 Principios básicos del CTV............................................................ 9

2.3.2 Tejido calloso……………………………..…...........................……. 10

2.3.3 Cultivos de células en suspensión................................................ 10

2.4 Antioxidantes ........................................................................................... 11

2.5 Antecedentes del proyecto........................................................................ 12

3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 13

4. OBJETIVOS........................................................................................................ 14

ii

4.1 Objetivo general........................................................................................ 14

4.2 Objetivos específicos................................................................................ 14

5. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................... 15

5.1 Materiales.................................................................................................. 15

5.1.1 Material biológico.......................................................................... 15

5.1.2 Materiales...................................................................................... 15

5.1.3. Equipos........................................................................................ 16

5.1.4 Reactivos....................................................................................... 16

5.2 Estrategia experimental............................................................................ 18

5.3 .Metodología............................................................................................. 20

5.3.1 Desinfección de semillas de J. mexicana...................................... 20

5.3.2 Germinación de semillas de J. mexicana...................................... 20

5.3.3 Desinfección de plántulas de J. mexicana.................................... 20

5.3.4 Medios semisólidos para la inducción de callos............................ 20

5.3.5 Obtención de callos de J. mexicana.............................................. 21

5.3.6 Evaluación de la tasa de crecimiento ........................................... 22

5.3.7 Determinación de la actividad proteolítica en medios donde

crecieron los callos de J. mexicana............................................... 22

5.3.8 Establecimiento de cultivos en suspensión................................... 22

5.3.9 Determinación de biomasa en los cultivos de células en

suspensión................................................................................. 23

5.3.10 Determinación de viabilidad........................................................ 23

iii

5.3.11 Determinación del consumo de azúcares por el método de la

antrona en medios en suspensión.............................................. 23

5.3.12 Determinación de actividad proteolítica en los cultivos en

suspensión................................................................................. 24

5.3.13 Determinación de proteína.......................................................... 24

5.3.14 Electroforesis en gel de poliacrilamida ....................................... 25

5.3.15 Determinación de actividad antioxidante..................................... 25

5.3.16 Preparación del inóculo para cultivo en biorreactor.................... 26

5.3.17 Condiciones del cultivo celular de J. mexicana en el biorreactor

Air-lift.......................................................................................... 26

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................ 27

6.1 Elección de la formulación del medio de cultivo para la inducción de

callos de Jacaratia mexicana.................................................................... 27

6.2 Estudio del efecto de un inductor y de la concentración inicial de

sacarosa a nivel matraz............................................................................ 31

6.3 Preparación del inóculo para el cultivo en biorreactor.............................. 37

6.4 Cultivo celular de Jacaratia mexicana en un biorreactor Air-lift de 0.5 L

con un inductor.......................................................................................... 41

6.5 Determinación de peso molecular de las proteasas por electroforesis en

gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)........................................................... 50

7. CONCLUSIONES................................................................................................ 52

8. BIBLIOGRAFIA……............................................................................................ 53

9. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES……........................................................... 56

10. ANEXO.............................................................................................................. 57

iv

I. ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Jacaratia mexicana. Nombres comunes: Bonete (Jal., Gro.),

cualsuayote (Gro.), papaya orejona, papayón (Oax.) .....................

7

Figura 2 Diagrama de bloques del desarrollo experimental..........................

18

Figura 3 Efecto del Mioinositol (MI), del BAP y de la caseína en el

desarrollo de callos de J. mexicana................................................

29

Figura 4 Efecto del Mioinositol (MI), del BAP y de la caseína en la actividad

proteolítica determinada en los medios de cultivo donde crecieron

los callos de J. mexicana................................................................

30

Figura 5 Efecto de la caseína (inductor) en la proteína determinada en el

medio de cultivo en suspensión donde crecieron las células de J.

mexicana.........................................................................................

32

Figura 6 Efecto de la caseína (inductor) 0.005% (p/v) en la actividad

proteolítica determinada en el medio de cultivo en donde crecieron

las células de J. mexicana en suspensión......................................

33

Figura 7 Efecto de la caseína (inductor) 0.005% (p/v) en la producción de

biomasa de los cultivos de células de J. mexicana en

suspensión.....................................................................................

34

Figura 8 Activdad proteolítica del cultivo celular de Jacaratia mexicana

(inóculo)..........................................................................................

38

Figura 9 Desarrollo de la biomasa del cultivo celular de Jacaratia mexicana

(inóculo)...........................................................................................

39

Figura 10 Consumo de sacarosa del cultivo celular de Jacaratia mexicana

(inóculo)..........................................................................................

39

Figura 11 Determinación de proteína del cultivo celular de Jacaratia

mexicana (inóculo).........................................................................

40

v

Figura 12 Actividad Antioxidante del cultivo celular de Jacaratia mexicana

(inóculo). Muestras al 0.5%(v/v)......................................................

41

Figura 13 Cultivos celulares de Jacarita mexicana en un biorreactor Air-lift

de 0.5 L..........................................................................................

42

Figura 14 Actividad proteolítica determinada en el medio de cultivo donde

crecieron las células de Jacaratia mexicana en un biorreactor Air-

lift con 0.005% (p/v) de caseína y control……….............………….

43

Figura 15 Crecimiento celular de Jacaratia mexicana en un biorreactor Airlift

con 0.005% (p/v) de caseína y control……………...............……..…

44

Figura 16 Consumo de sacarosa de las células de Jacaratia mexicana

creciendo en un biorreactor Air-lift con 0.005% (p/v) de caseína y

control……………………………………………………..….......………

45

Figura 17 Proteína total determinada en el medio de cultivo donde crecieron

las células de Jacaratia mexicana en un biorreactor Air-lift con

0.005% (p/v) de caseína y control……………......………….............

46

Figura 18 Células de Jacaratia mexicana creciendo en un Biorreactor Air-lift

de 0.5 L a los 7 días de cultivo (A) Caseína 0.005% p/v (B) Control

a 125X.............................................................................................

48

Figura 19 Fracción del número de células viables de J. mexicana contra el

tiempo de cultivo en un biorreactor Air-lift de 0.5 L: con 0.005%

(p/v) de caseína y cultivo control.....................................................

49

Figura 20 Cuenta viable de células de J. mexicana contra el tiempo de

cultivo en un biorreactor Air-lift de 0.5 L: con 0.005% (p/v) de

caseína y cultivo control..................................................................

50

Figura 21 Electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% con SDS................. 51

Figura 22 Curva tipo de proteína por el método de Bradford.......................... 60

Figura 23 Curva tipo de tirosina...................................................................... 61

Figura 24 Curva tipo de sacarosa por el método de la antrona...................... 62

vi

II. ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1 Optimización de la formulación del medio MS para la inducción de

callos de J. mexicana........................................................................

21

Cuadro 2 Formulación de los medios de cultivo MS para medir el efecto de

la concentración de sacarosa y de caseína en suspensión de J.

mexicana..........................................................................................

23

Cuadro 3 Efecto de la caseína (inductor) al 0.005% (p/v) en el consumo de

sacarosa en los cultivos en suspensión de células de J. mexicana

36

Cuadro 4 Actividad Antioxidante determinada en los medios de cultivo en

suspensión de células de J. mexicana...............................................

37

Cuadro 5 Actividad Antioxidante determinada en los medios de cultivo donde

crecieron las células de J. mexicana en un biorreactor Air-lift de

0.5 L...................................................................................................

47

Cuadro 6 Elaboración de la curva tipo de proteína por el método de

Bradford............................................................................................

60

Cuadro 7 Elaboración de la curva tipo de sacarosa por el método de la

antrona...............................................................................................

62

III: ABREVIATURAS 2,4-D Ácido 2,4-difenoxiacético

ATC Ácido tricloroacético

BAP 6-bencilaminopurina

BSA Albúmina de suero bovino

Da Daltones

DPPH 2-2-difenil-1-picril-hidracilo FDA Food and Droug Administration

vii

MI Mioinositol

MS Murashige & Skoog

nm Nanómetros

p.s Peso seco

p/v Peso volumen

PBS Solución amortiguadora de fosfato salino

pH Potencial de hidrógeno

PSA Persulfato de amonio

rpm Revoluciones por minuto

SDS Dodecil sulfato de sodio

TEMED N,N,N,N'-tetrametilnediamina

UT Unidades de tirosina

v/v Volumen volumen

vvm Volumen de medio por volumen de aire por minuto

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS Y COMPUESTOS ANTIOXIDANTES EN CULTIVOS CELULARES DE Jacaratia mexicana CON UN INDUCTOR

Liliana Montaño Herrera, *María del Carmen Oliver Salvador. *Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología del Instituto Politécnico Nacional. Av. Acueducto s/n, Barrio la Laguna Ticoman, México, D. F., C.P. 07340, Teléfono: 57296000, Ext.: 56343, 56342. Correo electrónico: [email protected]

Palabras clave: Jacaratia mexicana, proteasas, inductor, antioxidantes, cultivo in vitro.

Introducción. La Jacaratia mexicana es una planta silvestre de la familia de las Caricáceas que produce enzimas proteolíticas capaces de competir en usos industriales con la papaína (1), además de que se han descubierto nuevas actividades de estas proteasas como la acción mitogénica (2). Se conoce que las proteasas son enzimas inducibles (3). Y en cultivos celulares de J. mexicana se ha obtenido un incremento de la actividad proteolítica usando un hidrolizado de caseína como inductor (4). Por otra parte, se tenían indicios de que esta planta sintetiza compuestos antioxidantes de gran importancia tecnológica y nutricional. El objetivo del presente trabajo fue incrementar la síntesis de enzimas proteolíticas en cultivos celulares de J. mexicana usando caseína como inductor y evidenciar la presencia decompuestos antioxidantes en dichos cultivos. Metodología. Se probaron seis diferentes formulaciones del medio de cultivo para inducción de callos Murashige y Skoog (MS), (Cuadro 1). Con los callos obtenidos se estableció un cultivo de células en suspensión de J. mexicana en medio MS adicionado con 0.50 mg/L de 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y 0.25 mg/L de BAP a pH 5.6. El ensayo se realizó con dos concentraciones de sacarosa [4 y 6% (p/v)] con y sin caseína 0.05 g/L. Los cultivos se mantuvieron en a 100 rpm, a 25°C y fotoperiodo de 16 h. Cada quince días se pasaron a medio fresco y se determinó biomasa, proteína, consumo de sacarosa, actividad proteolítica y actividad antioxidante con del radical 2-2-difenil-1-picril-hidracilo (DPPH). A partir de las mejores condiciones encontradas se estableció el cultivo en biorreactor Air-lift de 0.5 L.

Cuadro 1. Optimización de la formulación del medio MS para la inducción de callos de J. mexicana

Medio MS 9 Mioinositol g/L Caseína g/L BAP mg/L

A 0.2 - 0.5 B 0.1 - 0.5 C 0.2 0.05 0.5 D 0.1 0.05 0.5 E 0.2 - 0.25 F 0.1 - 0.25

Resultados y discusión. En los cultivos de callos de J. mexicana se observó que con 0.1 g/L de mioinositol hay mayor tasa de crecimiento que con 0.2 g/L, sin embargo, este compuesto no tiene influencia en síntesis de proteasas. Mientras que la producción de biomasa y de enzimas proteolíticas que se liberan al medio de cultivo es mayor en presencia de caseína al 0.005% (p/v). A los 30 días de cultivo, los callos con 0.25 mg/L de BAP tuvieron una tasa de crecimiento 1.2 veces mayor que con 0.50 mg/L y la producción de enzimas proteolíticas aumentó 1.6 veces.

La actividad proteolítica fue mayor en los cultivos adicionados con caseína, el incremento a los 37 días de cultivo fue de 1.6 veces con sacarosa al 4% (p/v) y de 1.2 veces con sacarosa al 6% (p/v) con respecto al control (Fig.1), estos resultados coinciden con la producción de proteína y con el consumo de sacarosa (datos no mostrados). Lo cual sugiere que la caseína promueve la síntesis y/o liberación de las proteasas al medio de cultivo. Por otro lado, el crecimiento celular de J. mexicana aparentemente no se afectó por la adición de caseína al medio de cultivo ni por la concentración de sacarosa. La actividad antioxidante en los medios de cultivo es entre 8 y 9% mayor con respecto al control. Sin embargo, no hay una diferencia en la actividad antioxidante entre las diferentes formulaciones probadas.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 15 30 45D ías d e cult ivo

Figura 1. Actividad proteolítica determinada en el medio de cultivo donde

crecieron las células de J. mexicana. Medio MS. Sacarosa 4%: ( ) caseína 0.05 g/L; ( ) sin caseína. Sacarosa 6%: (▲) caseína 0.05 g/L; (●) sin

caseína. Conclusiones. La adición de caseína en cultivos celulares de J. mexicana incrementó la producción de enzimas proteolíticas excretadas al medio de cultivo donde crecieron dichas células. El incremento en concentración de la sacarosa del 4 al 6% (p/v) no influye en el desarrollo del cultivo, sin embargo con 4% es mayor la producción de enzimas proteolíticas. J. mexicana sintetiza compuestos antioxidantes en cultivos in vitro. Agradecimientos. SIBE-COFFA-IPN, PIFI-IPN y Proyecto CGPI20060388. Referencias 1. Briones, R., Cruz y Victoria M., Cortés, M. y Oliver, M. 1994. Preparaciones enzimáticas de interés industrial. Información Tecnológica (Chile), 5(1):29-38. 2. Gomes R., Mello J., Rodríguez, L., Bemquerer, P., Lopes P., Faça, M., Salas, E. 2005. Isolation of two plant proteinases of latex from Carica candamarcensis acting as mitogens for mammalian cells. Planta Medica 71: 244-248 3. Castañeda-Agulló, M. 1956. Studies on the biosynthesis of extracellular proteases by bacteria: Serratia marcescens, synthetic and gelatine media. J. General Physiology. 39: 369-375. 4. Barrera, I. 2006. Cultivo de células de Jacaratia mexicana en un biorreactor Airlift: Efecto de un inductor y un elicitor en la producción de enzimas proteolíticas. Tesis de Maestría. UPIBI-IPN. México.

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS Y COMPUESTOS ANTIOXIDANTES

EN CULTIVOS CELULARES DE Jacaratia mexicana CON UN INDUCTOR

1

1. INTRODUCCIÓN

Las plantas producen una gran cantidad de sustancias químicas usadas por el hombre para

la elaboración de medicamentos, pesticidas, saborizantes y fragancias. Algunos de estos

compuestos sólo se encuentran en algunas plantas y la complejidad química de muchas de

estas sustancias, hace imposible o incosteable su producción por síntesis química. Debido a

lo anterior, el cultivo de células vegetales es utilizado como una herramienta biotecnológica

para la producción de una gran variedad de metabolitos, entre ellos las enzimas. En los

últimos años, el uso de enzimas en gran cantidad de industrias ha adquirido gran relevancia,

por ejemplo, las enzimas proteolíticas (hidrolizan las uniones peptídicas de las proteínas)

ocupan un 60% del mercado mundial de enzimas y son utilizadas en numerosas industrias:

en los procesos de fabricación de cerveza, la elaboración de ablandadores de carne, en la

producción de hidrolizados de proteínas, en la formulación de productos farmacéuticos

diversos, y en la modificación de las propiedades funcionales de las proteínas. Dentro de las enzimas proteolíticas se encuentran las proteasas cisteínicas que

incluyen a la papaína, bromelaína, y mexicaína entre otras. Las plantas de la familia de las

Caricáceas producen cantidades abundantes de proteasas. Entre ellas se encuentra

Jacaratia mexicana, que es una planta silvestre con frutos semejantes a los de la papaya

(Carica papaya) y de cuyo látex fue aislada la proteasa “mexicaína”, de gran estabilidad y

con mayor actividad proteolítica específica que la papaína. Sin embargo, esta planta da

frutos una temporada al año, por lo que para disponer de materia prima constante se

requieren estrategias alternas como es el cultivo de células in vitro de J. mexicana para

producir estas enzimas proteolíticas. Por otra parte se tienen indicios de que esta planta

sintetiza compuestos con actividad antioxidante, los cuales han despertado un gran interés

por su importancia desde un punto de vista tecnológico y nutricional.

Se ha demostrado en los cultivos celulares que las proteasas de J. mexicana son

extracelulares. Siendo este hecho ventajoso desde el punto de vista práctico, ya que las

proteasas se pueden obtener directamente de los filtrados de fermentaciones sin tener que

romper las células.

Además se sabe que las proteasas son enzimas inducibles (Castañeda-Agulló, 1956),

es decir, las células pueden incrementar su síntesis bajo condiciones moleculares



2

específicas como la presencia de un inductor. Por ejemplo, las proteasas pueden ser

inducidas por proteínas como caseína, por péptidos o por aminoácidos, los cuales entran a la

célula y activan el sistema de transcripción genético para la síntesis de estas enzimas. Por lo

que en este trabajo se estudiará el efecto de un inductor en el desarrollo del cultivo en la

producción de enzimas proteolíticas y en la síntesis de compuestos antioxidantes.

A pesar de los esfuerzos, la biotecnología vegetal ha tenido pocos éxitos comerciales

en la producción de metabolitos, ya que las células vegetales han sido consideradas muy

frágiles para crecer en los biorreactores convencionales, usados tradicionalmente para el

crecimiento de microorganismos (Rodríguez et al, 1999; Sajc et al, 2000). Sin embargo

existen evidencias experimentales que sugieren que las células de J. mexicana no son tan

frágiles al estrés hidrodinámico de un biorreactor tipo tanque agitado (Martínez, García y

Oliver, 2006).



3

2. ANTECEDENTES

2. 1 Enzimas Las enzimas son proteínas de alto peso molecular (desde 12,000 Da hasta

aproximadamente un millón de Da) con formas tridimensionales complejas que catalizan

reacciones bioquímicas y son sintetizadas por todas las células. Las cuales aceleran la

velocidad de una reacción sin ser utilizadas o alteradas permanentemente y lo hacen

disminuyendo la energía de activación.

Las enzimas son fundamentales en el metabolismo de las células pues intervienen en

la degradación, asimilación y síntesis de biomoléculas así como en la producción de energía

y en todos los procesos de la reproducción; sin las enzimas las reacciones necesarias para

la vida no podrían ocurrir.

Las enzimas pueden funcionar dentro de la célula misma o estar asociadas a la

membrana y son llamadas intracelulares; pero otras son excretadas para actuar con su

sustrato en el medio que rodea a la célula, éstas son las enzimas extracelulares.

Las enzimas tienen muchas aplicaciones industriales como en la fabricación de

cervezas, vinos, alimentos y detergentes; así como en las industrias panaderas, lácteas,

farmacéuticas y textiles. Además se pueden utilizar para obtener materias primas, en la

agricultura y para el mejoramiento ambiental.

En muchos procesos las enzimas poseen ventajas sobre los catalizadores químicos:

− Pueden funcionar bajo condiciones moderadas de pH, temperatura y presión.

− Presentan gran especificidad del sustrato sobre el cual actúan.

− Se pueden obtener en grandes cantidades y a muy bajo costo a partir de

microorganismos como bacterias y hongos.

Pero también tienen las siguientes desventajas;

− Son inestables, porque pierden su estructura tridimensional en condiciones extremas

de pH y temperatura y por tanto pierden su actividad.

− Son fácilmente degradadas por proteasas u otros microorganismos.



4

2.1.1 Enzimas Proteolíticas

Las enzimas que hidrolizan las uniones peptídicas se llaman enzimas proteolíticas,

peptidasas, proteasas o proteinasas. Sin embargo, peptidasa es el término avalado por la

Comisión de Enzimas (EC). Una hidrólisis completa de una proteína a aminoácidos requiere

de la acción de diferentes enzimas, las cuales actúan como un sistema multienzimático. Las

proteasas se clasifican dependiendo de la reacción que catalizan, la estructura química del

sitio activo y de su estructura tridimensional.

Las enzimas proteolíticas se clasifican en:

a. Proteasas serínicas. Tienen un residuo de serina en su sitio activo, así como una

histidina y un ácido aspártico.

b. Proteasas cisteínicas. Tienen un residuo de cisteína en el sitio activo. Dentro de este

grupo se encuentran la papaína, bromelaína, ficina, actinidina y mexicaína entre

otras.

c. Proteasas treonínincas. Poseen un residuo de treonina en el sitio activo.

d. Proteasas aspárticas. Presentan dos residuos de ácido aspártico en el sitio activo y

presentan su máxima actividad catalítica a pH ácido.

e. Metaloproteasas. Poseen un residuo de ácido glutámico en el sitio activo y requieren

un catión divalente como el zinc, calcio o magnesio para catalizar la hidrólisis del

enlace peptídico.

Las proteasas son enzimas inducibles, es decir, las células pueden incrementar su

síntesis bajo condiciones moleculares específicas. En microorganismos como bacterias y

hongos, las proteasas son inducidas por fragmentos de péptidos, los cuales pueden entrar a

la célula y activar el sistema de transcripción genético para la síntesis de estas enzimas. Sin

embargo, no se posee la suficiente información de este tipo de inducción en células

vegetales.

2.1.2 Importancia biológica de las proteasas cisteínicas

Las proteasas participan en la iniciación, mantenimiento y terminación de una gran variedad

de procesos biológicos; el mantenimiento y transformación de proteínas intracelulares, el

transporte y activación de las proteínas; participan también en los mecanismos de defensa



5

de las células fagocíticas de los eucariotes y en el caso de las células vegetales son

importantes en los procesos de germinación de las semillas, de senescencia, de maduración

de frutos, etc. (Pérez, 1999).

El látex de los frutos de plantas como las Caricáceas, contiene una mezcla de

endopeptidasas cisteínicas que son activadas después que el látex es liberado. En frutos

heridos, el látex se libera hasta formar un coágulo alrededor del lugar de la herida. El

coágulo formado se compone principalmente de proteínas. Entonces las proteasas del látex

pueden jugar un papel similar a los factores de la coagulación sanguínea pero dotados con

actividad proteolítica (Gomes et al, 2005).

2.1.3 Importancia industrial de las enzimas proteolíticas cisteínicas

Los usos más importantes de las enzimas proteolíticas se encuentran en la industria

alimentaria y farmacéutica.

Industria alimentaria:

− Las proteasas son usadas en la clarificación de cervezas. En el tratamiento de

la malta y de la cebada.

− Ablandamiento de carnes.

− Se utilizan para la extracción de zumos, saborizantes, especias y pigmentos.

− Junto con las celulasas y pectinasas se utilizan en la fabricación de vinos, y en

la clarificación de jugos de frutas y vinos.

− Para la elaboración de hidrolizados de proteínas.

Industria farmacéutica

− Las proteasas se utilizan en el tratamiento de quemaduras y pequeñas

úlceras.

− Para la elaboración de medicamentos para la digestión de proteínas.

− Y para la eliminación de ciertos parásitos. Existen evidencias que el látex de las Caricáceas contiene una fracción protéica que

estimula la proliferación de fibroblastos y células epiteliales en mamíferos. Esta nueva

propiedad de actividad mitogénica es atribuida a una proteasa cisteínica, la que podría

explicar algunas de las acciones terapéuticas atribuidas a estas enzimas (Gomes et al,

2005).



6

2.1.4 Fuentes vegetales de enzimas proteolíticas

En el grupo de las proteasas cisteínicas encontramos a la mayoría de las proteasas de

origen vegetal (papaína, ficina, bromelaína, mexicaína, etc.). Estas enzimas son

endopeptidasas (Cruz y Victoria, 1993; Whitaker, 1994). Las proteasas existen en muchas

plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, pero en forma abundante sólo en escaso

número de ellas. El desarrollo de los métodos de purificación ha permitido descubrir la

presencia de varias proteasas en el látex o jugo de frutos. Entre las proteasas mexicanas

más estudiadas se encuentran las de los frutos de caricáceas: la papaína y la mexicaína

obtenida de los látex de Carica papaya y de Pileus mexicanus también conocida como

Jacaratia mexicana, respectivamente y de las bromeliáceas hemisfericina de la Bromelia

hemisphaerica (Garduño, 1974; Cruz, 1993).

La mexicaína es una proteasa monomórfica de tipo cisteínico que fue aislada del látex de los

frutos de J. mexicana por Castañeda-Agulló, y col. (1942). Estudios comparativos

bioquímicos y sobre aplicaciones industriales donde se usa la papaína (estabilización

coloidal de la cerveza, ablandamiento de la carne, hidrólisis de proteínas de pescado y de

origen vegetal, así como la modificación de las propiedades funcionales de proteínas) han

mostrado que presentan una mayor actividad específica y estabilidad que la papaína y que

las proteasas de J. mexicana pueden competir con ella (Briones y col., 1994; Briones, 1996).

Por mucho tiempo se pensó que la denominada mexicaína era la única proteasa presente en

el látex de J. mexicana y además que esta era una sola enzima, sin embargo, en estudios

bioquímicos recientes se ha demostrado la existencia de al menos cinco proteasas presentes

en dicho látex. De acuerdo con el orden de elución de las proteasas del extracto del látex por

cromatografía de intercambio iónico fuerte, se les nombró proteasas P-I, P-II, P-III, P-IV y P-

V, esta última presenta mayor actividad específica que la proteasa P-IV. A la proteasa P-IV

por ser la más abundante se le denomino mexicaína (Oliver, 1999) y fue purificada,

caracterizada y cristalizada por Oliver, (1999) y Oliver, y col., (2004).



7

2.1.4.1 Jacaratia mexicana

Nombre común: Bonete

Nombre científico: Jacaratia mexicana

La familia de Caricáceas son plantas que producen grandes cantidades de proteasas,

encontrándose entre ellas la J. mexicana que es una planta silvestre que crece en las

regiones subtropicales de la República mexicana en los estados de Morelos, Puebla,

Guerrero, Campeche y Yucatán. Sus frutos son semejantes a los de la papaya (Carica

papaya).

Es un árbol que llega a medir hasta 15m de altura y a tener un diámetro de 40cm. Presenta

un tronco cónico muy frágil, el cual se ramifica en la punta, lo que lo hace muy característico.

Florece y fructifica en época de sequía es una especie característica del bosque tropical

caducifolio y sus frutos son consumidos principalmente por aves y la gente consume el fruto

tierno en guisados.

Figura 1. Jacaratia mexicana. Nombres comunes: Bonete (Jal., Gro.), cualsuayote (Gro.), papaya orejona, papayón (Oax.).

TAXONOMÍA Reino: Plantae

Filo: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Parietales

Familia: Caricaceae

Género: Jacaratia

Especie: mexicana



8

2.2 Inductores Las enzimas proteolíticas son metabolitos inducibles. El crecimiento de microorganismos en

medios de cultivo ricos en proteínas como caseína, peptona, triptona, gelatina o leche

descremada es excelente para elevar la síntesis de proteasas, dada su capacidad de actuar

como inductores. Como lo demostró por primera vez el Dr. Castañeda-Agulló con la

inducción de proteinasas en Serratia marcescens. El observó que las proteasas producidas

por esta bacteria son inducidas al crecer en un medio adicionado con gelatina ya que

mostraban un incremento en la actividad proteolítica después de un periodo corto de tiempo,

por lo que concluye que la presencia de gelatina en el medio es la responsable de la rápida

aparición de dichas proteasas y en consecuencia del incremento de la actividad proteolítica

(Castañeda, 1956).

Otros compuestos que son capaces de actuar como inductores son los aminoácidos

como la leucina (Romero, 2001). Braun (1980) comprobó estos resultados, induciendo la

síntesis de proteasas de origen bacteriano en S. marcescens con leucina, caseína y extracto

de levadura-triptona en un medio de cultivo mínimo. Sin embargo, la regulación de la síntesis

de proteasas extracelulares no ha sido estudiada de manera extensa (Bromke, 1978).

Un inductor, entonces, se puede definir como un compuesto que aumenta la expresión

de genes que codifican enzimas inducibles, es decir, la presencia de aquel en cultivos

celulares incrementa la síntesis de estas enzimas. Puede ser un compuesto que funciona

como sustrato de enzimas inducibles.

2.3 Cultivo de tejidos vegetales

Se llama Cultivo de Tejidos Vegetales (CVT) al conjunto de técnicas que permiten el

establecimiento, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte de una planta, desde una

célula hasta un organismo completo, bajo condiciones artificiales, axénicas y controladas.

El uso de estos sistemas biotecnológicos ofrece varias ventajas con respecto al

método tradicional de obtención de metabolitos a partir de plantas cultivadas en el campo.

Entre ellos se pueden citar los siguientes: independencia de las condiciones climáticas



9

adversas y de los problemas de plagas, la posibilidad de mantener consistencia en la calidad

de los productos deseados y amplias perspectivas para incrementar la productividad (Taticek

et al, 1991; Alferman y Paterson, 1995). Sin embargo el desarrollo industrial y la

comercialización de metabolitos producidos por CTV se limitan a pocos casos, debido a la

falta de información de las rutas de biosíntesis y de aspectos ingenieriles.

El CVT tiene diversas aplicaciones en la biotecnología vegetal como la

micropropagación, la generación de plantas libres de enfermedades y la conservación de

germoplasma in vitro. (Pérez et al, 1999).

2.3.1 Principios básicos del CVT

El CVT se basa en tres principios básicos, de cuya comprensión y manipulación depende el

éxito o fracaso de cualquier trabajo en este campo. (Pérez et al, 1999)

Los principios básicos son los siguientes:

Elección del explante. Se llama explante al órgano, tejido o segmento de tejido

vegetal que va a ser utilizado para iniciar el cultivo. Entre más joven y menos

diferenciado sea un tejido, más fácil será su adaptación y respuesta al cultivo in vitro.

El cultivo de un fragmento de tejido vegetal en condiciones artificiales significa el

cese de sus relaciones con otros órganos, tejidos y células de la planta completa; las

cuales deben de ser compensadas por el medio y las condiciones de cultivo.

Elección del medio y condiciones de cultivo. El medio de cultivo junto con el tipo de

explante determina la respuesta que se obtendrá del mismo, por lo que su elección y

adecuada formulación son fundamentales para el éxito del CTV. El medio de cultivo

consiste en dos grupos de componentes. Los primeros son los esenciales, aquellos

que satisfacen los requerimientos nutricionales básicos del tejido cultivado: incluye a

los nutrientes minerales, la fuente de carbono y algunas vitaminas. El segundo grupo

de compuestos son los llamados opcionales, los cuales determinan el tipo de

respuesta que se obtendrá del tejido, y por tanto influyen en el establecimiento y

respuesta de los cultivos in vitro. A este grupo pertenecen las fitohormonas o

reguladores de crecimiento vegetal. Además es importante considerar las

condiciones físicas como luz, fotoperiodo, temperatura y humedad; ya que

contribuyen a la respuesta del explante.



10

Condiciones asépticas. Para que un cultivo de cualquier tejido vegetal prospere de la

manera deseada, debe excluirse del mismo a cualquier tipo de organismo

contaminante.

2.3.2 Tejido calloso Es un tejido obtenido por medio del aislamiento de órganos o tejidos diferenciados, los

cuales posteriormente son llevados a una desdiferenciación celular, presentando estas

células una proliferación continua, acelerada y de apariencia desorganizada, que da origen a

una masa amorfa de tejido (Hurtado y Merino, 2001).

2.3.3 Cultivo de células en suspensión

Se le denomina cultivo de células en suspensión al cultivo in vitro de células vegetales

aisladas o en pequeños agregados, distribuidas en un medio nutritivo líquido y en constante

movimiento, las cuales presentan una alta tasa de división celular y una homogeneidad

relativamente alta. El cultivo de células en suspensión puede iniciarse a partir de cualquier

explante inoculado en medio líquido con agitación; sin embargo, hay una mayor probabilidad

de éxito y rapidez en la obtención del cultivo si se parte de tejido calloso; por lo tanto, los

cultivos de células en suspensión generalmente se inician transfiriendo fragmentos de tejido

calloso a medio nutritivo líquido, y agitándolos para facilitar la dispersión celular y la

oxigenación del medio. Los cultivos celulares se han utilizado como sistemas modelo para

estudiar distintos procesos en la ciencia vegetal básica y aplicada. Además ofrecen sistemas

adecuados para diferentes procesos, ya que nos permiten disponer de grandes poblaciones

de células relativamente homogéneas creciendo en condiciones perfectamente controladas.

Por otra parte, estas células son susceptibles de recibir de manera rápida y uniforme

cualquier tipo de estímulo externo que se aplique y cuyo efecto se desee estudiar; asimismo,

la falta de clorofilas y carotenos en la mayoría de las células vegetales obtenidas de un

cultivo celular es de gran utilidad para el aislamiento y purificación de enzimas de origen

vegetal. La velocidad de crecimiento de un cultivo de células en suspensión depende de la

densidad inicial del inóculo, de la duración en cada caso de la fase lag y de la tasa de

multiplicación del cultivo. Los dos últimos factores dependen del genotipo de las líneas

celulares, del medio nutritivo y de las condiciones de incubación (Pérez y col., 1999).



11

2.4 Antioxidantes

Los antioxidantes son compuestos que inhiben o retrasan la oxidación de otras moléculas

mediante la inhibición de la propagación de la reacción de oxidación. Los antioxidantes

pueden clasificarse en naturales o sintéticos, sin embargo, existen estudios que les atribuyen

a estos últimos efectos carcinogénicos (Ito, 1993 y Velioglu, 1998). Este hecho ha

despertado un creciente interés en el estudio de los antioxidantes naturales entre los que se

encuentran distintos compuestos fenólicos.

Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de sustancias

químicas, considerados como metabolitos secundarios de las plantas, con diferentes

estructuras químicas y actividad. Su forma más frecuente es la de polímeros o lignina

insoluble. La distribución de los compuestos antioxidantes en los tejidos y células vegetales

varía considerablemente de acuerdo al tipo de compuesto que se trate, situándose en el

interior de las células o en la pared celular (Andary, 1997).

Los principales antioxidantes contenidos en vegetales son polifenoles entre los que

destacan, los flavonoides, las vitaminas, los carotenoides, los ácidos fenólicos, taninos,

calconas y cumarinas. Pero en vegetales existen otros compuestos con actividad

antioxidante como los fitoesteroles y los péptidos obtenidos mediante reacciones enzimáticas

de proteólisis limitada que les confieren propiedades funcionales.

Sus principales funciones en las células vegetales son las de actuar como

metabolitos esenciales para el crecimiento y reproducción de las plantas, y como agentes

protectores frente a la acción de patógenos, siendo secretados como mecanismos de

defensa (Butler, 1992).

La actividad antioxidante tiene interés desde un punto de vista tecnológico y

nutricional (Berra, 1995). Así, los compuestos fenólicos intervienen como antioxidantes

naturales de los alimentos , por lo que la obtención y preparación de los alimentos con alto

contenido en estos compuestos supone una reducción en la utilización de aditivos

antioxidantes, a la vez que se obtienen alimentos más saludables, que incluso pueden llegar

a englobarse dentro de los alimentos funcionales.

Los alimentos funcionales contienen compuestos nutracéuticos que son nutrientes

cuyo consumo ha sido asociado con la prevención y tratamiento de enfermedades crónico

degenerativas como las cardiovasculares y el cáncer así como en procesos de



12

envejecimiento. Los compuestos nutracéuticos se clasifican de acuerdo a sus propiedades

químicas y su actividad biológica. El común denominador de la mayoría de los nutracéuticos

es que tienen propiedades antioxidantes.

2.5 Antecedentes del proyecto

Ya que las proteasas de J. mexicana tienen una gran importancia científica e industrial, se

han estudiado las condiciones para el establecimiento de cultivos celulares de dicha planta.

Se demostró la producción de enzimas proteolíticas cisteínicas en cultivo de callos y en

células en suspensión de J. mexicana, también que las proteasas son liberadas al medio de

cultivo y que la producción de estas enzimas está asociada al crecimiento celular del cultivo

(Badillo y col., 2002).

Así mismo se ha logrado la mayor síntesis de proteína así como la mayor liberación

de enzima(s) proteolítica(s) con el medio MS9 completo en sales y 4% de sacarosa, con 0.5

mg/L de BAP (6-bencilaminopurina) y 0.5 mg/L de 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético)

(Oliver y col, 2005).

Dichos resultados apoyan la posibilidad de utilizar el cultivo de células vegetales de J.

mexicana como fuente alterna para la obtención de enzimas proteolíticas y se ha trabajado

en el establecimiento de las condiciones de cultivo en biorreactor Air-lift y hasta ahora

existen evidencias experimentales que sugieren que las células de J. mexicana no son tan

frágiles al estrés hidrodinámico (Martínez, García y Oliver, 2006).

Sin embargo, para aumentar la producción de estas enzimas, en nuestro grupo de trabajo se

ha estudiado el efecto de un inductor (un hidrolizado de caseína) en la síntesis de enzimas

proteolíticas y en la producción de biomasa en cultivos celulares de J. mexicana. La actividad

proteolítica y la concentración de proteína mostró un incremento en presencia del inductor. El

mayor incremento observado fue con 0.05% (p/v) del hidrolizado de caseína. Además se

observó también que la adición del inductor no afecta de manera aparente el desarrollo

celular en las condiciones probadas (Barrera, 2006).

Los resultados sugieren que la síntesis de proteasas puede ser inducida en cultivos

celulares de J. mexicana tal como ocurre en los cultivos de Serratia marcescens (Castañeda-

Agulló, 1956). Sin embargo no se ha probado el efecto de la proteína completa (caseína)

como inductor.



13

3. JUSTIFICACIÓN El cultivo de células vegetales es una gran herramienta biotecnológica para la

producción de una gran variedad de metabolitos primarios y secundarios, entre éstos se

encuentran las enzimas proteolíticas, las cuales ocupan un 60% del mercado mundial de

enzimas y tienen una gran variedad de aplicaciones en las industrias farmacéuticas y de los

alimentos, Estas industrias prefieren el uso de las proteasas de origen vegetal porque son

consideradas por la FDA como sustancias Generalmente Reconocidas como Seguras

(GRAS). Además de las nuevas actividades descubiertas recientemente como son la acción

mitogénica y moduladora del sistema inmune. La familia de las Caricáceas es una fuente

vegetal de proteasas, dentro de la cual se encuentra Jacaratia mexicana, que produce

grandes cantidades de proteasas cisteínicas. Sin embargo es una planta silvestre que crece

en regiones subtropicales y da frutos sólo en ciertas temporadas del año por lo tanto el

cultivo in vitro de esta planta es una alternativa para la producción de estas enzimas. Se ha

demostrado que las proteasas son enzimas inducibles, por lo que se estudiará el efecto de

un inductor en el desarrollo del cultivo y en la producción de enzimas proteolíticas y de

compuestos antioxidantes. Por otra parte se tienen indicios de que esta planta es capaz de

sintetizar compuestos con actividad antioxidante en cultivos in vitro, los cuales tienen un gran

interés desde un punto de vista tecnológico y nutricional para la obtención de alimentos

funcionales.



14

4. OBJETIVOS

Objetivo general

− Incrementar la síntesis de enzimas proteolíticas en cultivos celulares de

J. mexicana usando caseína, como inductor, y verificar la presencia de

compuestos con actividad antioxidante en dichos cultivos.

Objetivos específicos

− Inducir y mantener los cultivos de callos de J. mexicana.

− Estudiar el efecto de la concentración de mioinositol, BAP y caseína en

la producción de biomasa y síntesis de enzimas proteolíticas en

cultivos de callos de J. mexicana.

− Obtener cultivos celulares de J. mexicana en suspensión a nivel

matraz.

− Estudiar el efecto de la concentración de sacarosa y presencia de

caseína en cultivos celulares de J. mexicana en suspensión, a nivel

matraz.

− Estudiar el efecto de un inductor, caseína, en la producción de

enzimas proteolíticas y de compuestos antioxidantes en cultivos

celulares de J. mexicana a nivel matraz y en un biorreactor tipo Air-lift

de 0.5 L



15

5. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

5.1.1 Material biológico Semillas de Jacaratia mexicana, obtenidas de la reserva de esta planta en el Centro de

Desarrollo de Productos Bióticos del IPN (CEPROBI), en Yautepec, Morelos.

5.1.2 Materiales 1. Frascos tipo Gerber® con tapas de plástico

2. Espátulas estériles

3. Frascos para almacenar soluciones

4. Pinzas de disección

5. Bisturí

6. Tubos Eppendor® f de 1.5 mL

7. Material de laboratorio (Probetas, matraces, vasos de precipitados de diferentes

capacidades, tubos de ensaye)

8. Cámara de Neubauer Superior Marienfeld

9. Membrana de nitrocelulosa de 0.22 µm Millipore®

5.1.3 Equipos 1. Balanza analítica Mettler Toledo AB204-S

2. Potenciómetro Orion Research

3. Horno de microondas Sanyo

4. Olla de presión Presto

5. Campana de flujo laminar Fisher Hamilton

6. Espectrofotómetro Beckman DU 650



16

7. Centrifuga Hermle 7300

8. Micropipetas Eppendorf

9. Termomixer Eppendorf

10. Microscopio Motic

11. Baño de temperatura controlada Labline Aquabath

12. Dosificador Repipet II Barnstead/Labindustries

13. Biorreactor Air-lift

14. Estufa Shel Lab

15. Concentrador Amicon

16. Cámara de electroforesis BioRad

17. Fuente de poder BioRad

5.1.4 Reactivos 1. Agar noble o agar-agar DIFCO

2. Sales minerales: MgSO4.7H2O, KNO3,

KH2PO4, Ca(NO3)2.4H2O, NH4NO3, KI, H3BO3,

CaCI2.H2O, NaH2PO4.H2O, Na2H2PO4.H2O,)

Sigma

3. Agua desionizada Obtenida en un equipo Milli-Q

4. Hipoclorito de sodio al 1 y 1.5 % de cloro libre Cloralex 6% de cloro libre

5. Auxinas: 2,4-D (Ácido 2,4-diclorofenoxiacético) Sigma

6. Citocininas: BAP (6-Bencilaminopurina) Sigma

7. Vitaminas: Ácido nicotínico

piridoxina.HCl

tiamina.HCl

glicina

Sigma

8. Sacarosa Mallinckrodt

9. Macronutrientes y Micronutrientes Sigma

10. Mioinositol Sigma

11. Ácido tricloroacético Baker

12. Caseína Sigma

13. Cisteína.HCl Sigma

14. Hidrolizado de caseína Bacto triptona Difco



17

15. Antrona Mallinckrodt

16. Ácido sulfúrico Baker

17. Ácido clorhídrico Reasol

18. Hidróxido de sodio Reasol

19. Ácido bórico Droguería Mercurio

20. Cefotaxima (Claforan 500 mg) Aventis

21. Azul de Comassie Sigma

22. Azul de tripano Sigma

23. Marcador de peso molecular de 26 a 180 KDa Sigma

24. Acrilamida-Bisacrilamida (30:0.8) Sigma

25. Tris-HCl USB

26. Tris- Base Sigma

27. Persulfato de amonio (PSA) Merck

28. Etanol absoluto Merck

29. Metanol absoluto Merck

30. Glicina Sigma



18

Estrategia experimental

Figura 2. Diagrama de bloques del desarrollo experimental

En la figura 2 se presenta el diagrama de bloques del desarrollo experimental. En primer

lugar, a partir de semillas desinfectadas de J. mexicana se obtuvieron plántulas de

aproximadamente doce centímetros en condiciones de asepsia. Una vez que alcanzaron

esta altura se realizaron cortes de aproximadamente un centímetro y fueron colocados en

frascos tipo Gerber® con seis diferentes formulaciones del medio de cultivo para la inducción

Explante (tallo) Plántula J. mexicana

Células en suspensión

Inducción callos

Cultivo callos

Biorreactor Air-lift 0.5 L

25ºC 100 rpm pH 5.6

25ºC pH 5.6

fotoperiodo 16 h

25ºC pH 5.6 0.3 vvm

3-5 g

Tasa de crecimiento: Peso fresco Actividad proteolítica: Kunitz

Biomasa: Método de peso secoConsumo de azúcares: Antrona

Actividad proteolítica: Kunitz Proteína: Bradford

Actividad antioxidante: Reducción del DPPH



19

de callos Murashige y Skoog (MS) como se indica en el Cuadro 1 en las cuales se varió la

concentración de mioinositol (0.1 g/L y 0.2 g/L), se probaron dos concentraciones de BAP (6-

bencilaminopurina) (0.25mg/L y 0.50 mg/L) y también se estudió el efecto de la presencia de

la caseína como inductor a una concentración de 0.05 g/L (0.005% (p/v)). Todo lo anterior

con el propósito de incrementar la producción de enzimas proteolíticas y el desarrollo de los

callos de J. mexicana.

Los callos fueron resembrados cada quine días en medio fresco cuatro veces, y después se

utilizaron para obtener el cultivo en suspensión a nivel matraz, donde fue realizado el estudio

con un inductor (caseína). Se estableció un cultivo de células en suspensión de J. mexicana

en medio MS adicionado con 0.50 mg/L de 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y 0.25 mg/L

de BAP (6-bencilaminopurina) a pH 5.6. El ensayo se realizó con dos concentraciones de

sacarosa con y sin caseína 0.05 (g/L) (Cuadro 2). Los cultivos se mantuvieron en agitación a

100 rpm, a 25°C y fotoperiodo de 16 h. Cada quince días se realizaron subcultivos a medio

fresco y semanalmente se determinó biomasa, actividad proteolítica, proteína, consumo de

sacarosa y actividad antioxidante. Con las mejores condiciones de los estudios anteriores, se

realizaron cultivos de células de J. mexicana a nivel biorreactor con y sin la presencia de

inductor. Al terminar los cultivos en el biorreactor el medio agotado fue cosechado y se

recuperaron la(s) enzimas proteolíticas.



20

5.3 Metodología

5.3.1 Desinfección de semillas de J. mexicana.

Las semillas se colocan en detergente “extrán” al 2 % (v/v) durante 40 minutos, se enjuagan

con suficiente agua destilada estéril para eliminar el detergente y se pasan a un vaso estéril

con etanol al 70% por 1 minuto. Se enjuagan varias veces con agua estéril para eliminar el

etanol y se pasan a una solución de hipoclorito de sodio al 1.25%, (cloro libre) durante 10

min. Se enjuagan varias veces con agua estéril para eliminar el hipoclorito de sodio. Las

semillas se dejan hidratando en un vaso con agua estéril aproximadamente 24 horas, en

condiciones de asepsia (Dixon, 1991).

5.3.2 Germinación de semillas de J. mexicana.

Del vaso de precipitados, se toman una a una las semillas y pasan a tubos con medio de

Knop (Ver Anexo) con la ayuda de una espátula estéril, a cada uno de los tubos se les

colocan 3 semillas tratadas como se describe anteriormente. Se colocan en fotoperiodo de

16 horas de luz y 8 horas de oscuridad a 27 ºC hasta que la plántula alcance un tamaño

aproximado de 12-15 cm (Badillo y col., 2002).

5.3.3 Desinfección de plántulas de J. mexicana

En condiciones de asepsia, las plántulas son extraídas de los tubos que las contienen y se

colocan en una solución de hipoclorito de sodio al 1.25 % durante 15 minutos,

posteriormente las plántulas se lavan tres veces con agua destilada estéril para eliminar

completamente los residuos de la solución desinfectante.

5.3.4 Medios semisólidos para la inducción de callos de J. mexicana.

Los medios de cultivo semisólidos de Murashige y Skoog (MS) son preparados en frascos

tipo “Gerber®”, conteniendo aproximadamente 20 mL de medio MS. El medio consiste en 100



21

mL de macro y micronutrientes cuando el medio es completo en sales, suplementado con

100 mg/L de mioinositol, 1mL/L de vitaminas MS, 20 g/L de sacarosa, agar 0.6 % (Ver

Anexo) y ajustado a pH 5.6 antes de ser esterilizado durante 20 minutos a 121 °C Y 15 libras

de presión.

Se probaron las siguientes formulaciones del medio MS con el fin de incrementar la

producción de enzimas proteolíticas y/o el desarrollo de los callos de J. mexicana.

Cuadro 1. Optimización de la formulación del medio MS para la inducción de callos de J. mexicana

Medio MS 9 Mioinositol

g/L Caseína g/L

BAP mg/L

2,4-D mg/L

A 0.2 - 0.5 0.5

B 0.1 - 0.5 0.5

C 0.2 0.05 0.5 0.5

D 0.1 0.05 0.5 0.5

E 0.2 - 0.25 0.5

F 0.1 - 0.25 0.5

5.3.5 Obtención de callos de J. mexicana.

Con las plántulas desinfectadas, se realizan cortes de tallo de aproximadamente 1 cm, se

colocan tres cortes de tejido en cada medio MS semisólido. Los cortes se colocan en

fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad a temperatura de 25 + 3°C, se realizan

observaciones periódicas para determinar el tiempo de respuesta en cada una de las

condiciones probadas.

Los callos inducidos bajo las condiciones antes mencionadas, son transferidos a

medios de cultivo frescos en periodos de aproximadamente 15 días (resiembra), hasta que

estos alcanzaron un peso entre 3 y 5 gramos. En cada una de las resiembras, se determinó

el peso fresco de los callos y la actividad proteolítica en el medio donde estos crecieron.



22

5.3.6 Evaluación de la tasa de crecimiento

La tasa de crecimiento se determina a partir del peso final de cada uno de los callos después

de cuatro resiembras entre el peso inicial del explante sembrado en los medios MS

semisólidos, lo cual se realiza después de 45 días de iniciado el cultivo.

5.3.7 Determinación de actividad proteolítica en medios de cultivo

donde crecieron los callos de J. mexicana.

Se determina la actividad proteolítica por el método de Kunitz (modificado por Ortega y Del

Castillo, 1966 y Oliver, 1999) en los medios de cultivo semisólidos donde crecieron los callos.

La actividad enzimática se realiza por triplicado en los medios donde los callos se han

desarrollado. El medio de cultivo se disgrega con una espátula estéril, se agregan 500 µL de

cisteína 0.8 M, en regulador de fosfatos 0.05 M, pH 7.6, los frascos se incuban a 35°C,

durante 15 minutos, se agrega a cada uno de los frascos 9.5 mL de caseína al 1 % en

regulador de fosfatos 0.05 M, pH 7.6, la reacción procede durante tres horas a 35°C, al

término de ésto se toman alícuotas de 0.5 mL de la mezcla y se colocan en 0.75 mL de ATC

al 5%, esto se deja en reposo durante una hora, se centrifugan a 6500 min-1 durante 20 min y

se determina la absorbancia a 280 nm contra un blanco de reactivos (0.75 mL de ATC al 5%

y 0.5 mL de regulador de fosfatos, 0.05 M, pH 7.6). Con estas lecturas de absorbancia se

expresa la actividad proteolítica en Unidades de Tirosina (UT=µg de Tirosina liberados h-1, en

las condiciones de reacción indicadas) usando la ecuación de la Curva Tipo de Tirosina y =

1.1595x+0.0053 con un coeficiente r2 de 0.9995 (Barrera, 2004).

5.3.8 Establecimiento de cultivos en suspensión

Se preparan 50 mL de los medios de cultivo en matraces Erlenmeyer de 250 mL. Los medios

de cultivo tendrán la mejor formulación obtenida en los medios semisólidos utilizados para la

inducción de callos, en este caso sin agar. Además se usarán dos diferentes

concentraciones de sacarosa para saber su efecto en la producción de biomasa y en la

síntesis de enzimas proteolíticas.



23

Cuadro 2. Formulación de los medios de cultivo MS para medir el efecto de la concentración de sacarosa y de caseína en suspensión de J. mexicana

Medio MS9 Modificado 2,4-D 0.5 mg/L BAP 0.25 mg/L

Caseína (g/L) Sacarosa

% (p/v)

1 0.05 4

2 - 4

3 0.05 6

4 - 6

5.3.9 Determinación de biomasa en los cultivos de células en

suspensión.

Se pesan membranas de 0.45 µm, se filtra a través de ellas un mililitro de cultivo en

suspensión, los filtros se colocan en una estufa a 60 °C, hasta que las membranas alcanzan

un peso constante y por diferencia de peso se calcula el peso seco de las células por mL

presentes en el medio de cultivo en suspensión (Badillo y col., 2002).

5.3.10 Determinación de la viabilidad de células de J. mexicana.

Adicionar azul de tripano y muestra en proporción 1:1, colocar una alícuota conocida en la

cámara de Neubauer y observar al microscopio. Contar células, las vivas aparecen

refringentes y las muertas se tiñen de azul. Tomar en cuenta las diluciones.

5.3.11 Determinación del consumo de azúcares por el método de la

antrona en los cultivos de células en suspensión de J. mexicana.

Se colocan 25 µL del sobrenadante del medio de cultivo en un tubo Eppendorf® y se

adicionan 25 µL de una solución de KOH al 30%. Se colocan en un baño de agua a

ebullición por 10 minutos y se permite que se enfríen a temperatura ambiente.

Posteriormente, se le adicionan 0.75 mL de reactivo de antrona preparado en el momento y



24

se colocan en un baño a 40º C por 10 minutos. La absorbancia se lee a 620 nm. El reactivo

de antrona se prepara disolviendo 150 mg de antrona en 100 mL de ácido sulfúrico diluido

(30 mL de agua y 76 mL de ácido sulfúrico). (Van Handel, 1967).

5.3.12 Determinación de actividad proteolítica en los cultivos en

suspensión

Para determinar la presencia de enzimas en el medio de cultivo en donde crecieron células

de J. mexicana en suspensión, se toman 90 µL de muestra y se adicionan 30 µL de cisteína

0.8 M en regulador de fosfatos 0.05 M, pH 7.6. Para la determinación de la actividad

enzimática se toman 25 µL del medio de cultivo con la enzima activada y se adicionan a 475

µL de una solución de caseína al 1 % en regulador de fosfatos 0.05 M, pH 7.6. El tiempo de

reacción es de 3 horas a 35°C, después de este tiempo se adicionan 750 µL de ATC al 5 %

para detener la reacción. Los testigos reciben el mismo tratamiento excepto que los 25 µL de

la solución de enzima se agregan después de adicionar el ATC, los tubos se dejan en reposo

durante una hora, se centrifugan durante 10 minutos a 6000 g y se lee la absorbancia del

sobrenadante a 280 nm, ajustando contra un blanco de reactivos (500 µL de regulador de

fosfatos 0.05 M, pH 7.6 y 750 µL de ATC 5%) (Oliver, 1999).

5.3.13 Determinación de proteína en los cultivos celulares de J.

mexicana.

En los medios en suspensión donde crecieron las células de J. mexicana, se determinó el

contenido de proteína por el método de Bradford. Se toman 250 µL del medio de cultivo y se

adicionan 750 µL del reactivo de Bradford, se mezcla, se deja en reposo 5 minutos y se lee

la absorbancia a 595 nm. La determinación se realiza por triplicado, ajustando contra un

blanco de reactivos (250 µL de agua y 750 µL de reactivo de Bradford). Se calcula el

contenido de proteína mediante la ecuación de la recta obtenida de la curva tipo de proteína

por dicho método (Ver Anexo).



25

5.3.14 Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).

Las muestras de cultivo de células en suspensión con mayor actividad proteolítica se filtran

en membranas de 0.45 µm y se concentran a través de membranas de corte molecular de 3

kDa (Millipore®). Las muestras concentradas, el extracto del látex de J. mexicana y el

marcador de peso molecular se pasan por electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%

(para un volumen de 5 mL: 1.7 mL de agua, 2 mL. de acrilamida-bisacrilamida (30:0.8), 1.25

mL de tris 2 M pH 8.8, 25 µL PSA, 2.5 µL TEMED, 50 µL SDS al 10%).

Se vacía la acrilamida y se deja polimerizar 20 minutos. Se prepara el gel

concentrador de acrilamida al 4% (para un volumen de 2 mL: 1.25 mL de agua, 0.275 mL. de

acrilamida-bisacrilamida (30:0.8), 0.525 mL de Tris 2 M, pH 6.8, 10 µL PSA, 2 µL TEMED).

Se vacía la acrilamida, se coloca el peine y dejar polimerizar 20 minutos. Sacar el peine,

limpiar los pozos y colocar las muestras (Ver Anexo).

5.3.15 Determinación de actividad antioxidante en los cultivos de

células de J. mexicana.

La evaluación de la actividad antioxidante de los medios de cultivo donde crecieron las

células se realizó empleando el radical DPPH (2-2-difenil-1-picril-hidracilo) según el método

de Von Gadow y col. (1997), con algunas modificaciones. Se preparó una solución 1 mM de

DPPH en metanol al 100% y una solución al 0.5 % (v/v) de las muestras. La reacción se

realiza mezclando 0.25 mL de DPPH 1 mM en Metanol 100% y 0.75 mL de los medios de

cultivo al 0.5 % (v/v) donde crecieron las células de J. mexicana, agitando vigorosamente y

manteniendo en oscuridad por 30 min; posteriormente, las mezclas se centrifugaron a 10 000

g durante 30 min, y se leen a 517 nm, utilizando metanol como blanco y 0.75 mL de la

solución de DPPH más 0.25 mL de agua como testigo. La determinación se hace por

triplicado.

El porcentaje de inhibición del radical DPPH por las muestras se calcula de acuerdo con la

fórmula de Yen y Duh (1994).

% Inhibición = [ (AC(0) – AA(t) ) / AC(0) ] x 100 (1)



26

donde AC(0) es la absorbancia del testigo a t= 0 min y AA(t) es la absorbancia de la muestra a t

= 30 min.

5.3.16 Preparación del inóculo para cultivo en biorreactor

A 500 mL del medio MS9, completo en sales con 0.5 mg/L 2,4-D y 0.25 mg/L de BAP

adicionado con sacarosa al 4%. Se esterilizó durante 15 minutos a 121 ºC. Después de que

esté alcanzó la temperatura del laboratorio fue inoculado con los callos obtenidos en la

sección 5.3.5. El inóculo fue 10% (p/v) en peso fresco. El cultivo del inóculo se mantuvo

durante 28 días, en agitación a 100 rpm, fotoperiodo de 16 horas luz y 8 de oscuridad y a 25

± 3 ºC, y cada semana fue tomada una muestra para determinar actividad enzimática,

proteína, consumo de fuente de carbono, biomasa y actividad antioxidante.

5.3.17 Condiciones del cultivo celular de J. mexicana en el biorreactor

Air-lift

Se colocan en los biorreactores Air-lift de 0.5 L 450 mL del medio MS9 completo en sales

con 0.50 mg/L 2,4-D y 0.25 mg/L de BAP con sacarosa al 4%. Se establecen dos cultivos

simultáneos: un cultivo se adiciona con caseína al 0.005% (p/v) y al cultivo control no se

agrega caseína. Se esterilizan durante 20 minutos a 121º C. Después de que éstos alcancen

la temperatura ambiente se adiciona el inóculo. El volumen final de trabajo es de 500 mL y el

inóculo de 9% (p/v) en peso fresco. La aireación es de 0.3 vvm, el cultivo se mantiene a 25 ±

3 ºC. Se adicionaran ácido bórico al 0.05% como antimicótico y 100 mg de cefotaxima como

antibiótico por cada litro de medio de cultivo. Cada semana se toma una muestra para

determinar actividad enzimática, proteína, consumo de fuente de carbono, viabilidad,

biomasa y actividad antioxidante.



27

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Elección de la formulación del medio de cultivo para la

inducción de callos de Jacaratia mexicana

De acuerdo con trabajos previos de Badillo, y col., (2002), Barrera y Oliver, (2004) y Oliver y

col., (2005), se observó que con tres formulaciones del medio Murashige & Skoog (MS1,

MS5 y MS9) se obtuvieron cultivos de callos a partir de explantes de tallos de J. mexicana.

Sin embargo, los callos obtenidos en el medio MS9 presentaron la mayor tasa de crecimiento

celular y la mayor actividad proteolítica (Martínez, 2006 y Barrera, 2006).

Para el establecimiento del cultivo de callos de J. mexicana se utilizaron las

condiciones ya establecidas por Oliver y col., (2005). Sin embargo, con el fin de obtener

mejores rendimientos en la producción de biomasa y síntesis de enzimas proteolíticas, se

probaron seis diferentes formulaciones del medio de cultivo MS9 para la inducción de callos,

como se indica en el Cuadro 1, en las formulaciones se varió la concentración de mioinositol

(0.1 g/L y 0.2 g/L), se probaron dos concentraciones de BAP (6-bencilaminopurina)

(0.25mg/L y 0.50 mg/L) y también se estudió el efecto de la presencia de la caseína como

inductor a una concentración de 0.05 g/L (0.005% (p/v)).

Los resultados de los estudios arriba mencionados se muestran en las Figuras 3 y 4,

donde se observan los perfiles de crecimiento y actividad enzimática determinada en el

medio de cultivo donde crecieron los callos de J. mexicana. Las barras representan la

actividad proteolítica determinada en UT (Unidades de tirosina) totales o la tasa de

crecimiento obtenida en cada uno de los cuatro subcultivos realizados cada 15 días a un

medio de cultivo nuevo.

En la Figura 3, se muestran los resultados del efecto del mioinositol en la tasa de

crecimiento de los callos de J. mexicana. Donde, comparando los medios A y B con 0.1g/L y

0.2 g/L de mioinositol respectivamente, se observa que 0.1 g/L de este compuesto es



28

suficiente para estimular el crecimiento del tejido calloso y además se obtiene una mayor

tasa de crecimiento. Resultados similares se obtuvieron al comparar los cultivos en los

medios C y D, así como los cultivos en los medios E y F.

En la misma figura, al realizar la comparación entre los medios de cultivo A y C, con y

sin caseína al 0.005 % (p/v) respectivamente, se aprecia un perfil de crecimiento celular muy

similar en ambas formulaciones. Pero a partir de los 45 días de cultivo la tasa de crecimiento

es mayor en el medio C (con caseína), resultado que podría atribuirse a variaciones

experimentales. Lo anterior indica que la presencia de caseína no afecta la producción de

biomasa aunque esta proteína representa una fuente alterna de carbono para las células

además de la sacarosa. Algo similar ocurre al comparar las formulaciones B y D, pero en

este caso la tasa de crecimiento obtenida en el medio D con caseína al 0.005% (p/v) es

similar a la del medio B a partir de los 60 días de cultivo.

Por otra parte, los explantes cultivados en los medios de cultivo con 0.25 mg/L y con

0.5 mg/L de BAP presentaron la inducción de callo a los 7 días después de iniciado el cultivo.

Asimismo la concentración de BAP, aparentemente no tuvo influencia en la disgregabilidad

de los callos.

En cuanto al efecto de la concentración de BAP en la tasa de crecimiento de los

callos de J. mexicana se obtuvo que con 0.25 mg/L de BAP hubo mayor crecimiento que con

0.5 mg/L (Figura 3). Hasta los 45 días de cultivo se puede apreciar que aparentemente con

0.25 mg/L de BAP es menor el crecimiento de los callos que con 0.50 mg/L. Sin embargo a

partir del día 60 se obtuvo una mayor tasa de crecimiento en los callos crecidos con 0.25

mg/L de BAP (medios E y F) que con 0.50 mg/L (medios A y B), dicho incremento fue de1.2

veces.

Con relación a lo anterior, cabe mencionar que en un experimento de nuestro grupo

de trabajo, fue posible obtener callos de J. mexicana con la auxina 2,4-D (0.5 mg/L) como

único regulador de crecimiento exógeno (Martínez, 20006). En el presente estudio se obtuvo

una respuesta similar del cultivo utilizando la misma concentración de 2,4-D más 0.50 mg/L

de la citicinina BAP, sin embargo con 0.25 mg/L de BAP hay mayor tasa de crecimiento

(Figura 3). Esto sugiere que las células tienen una concentración endógena de citocininas

suficiente para estimular la división celular y permitir la proliferación del tejido calloso.

Además existen reportes que sugieren que altos niveles de la citocinina BAP en

cultivos in vitro podrían inducir la muerte celular programada acelerando la senescencia



29

(Carmini y col., 2004). En la Figura 3, se muestra que en los cultivos control (A y B) con 0.50

mg/L de BAP el crecimiento celular decrece a partir de los 60 días de cultivo, mientras que

en los cultivos E y F con 0.25 mg/L de BAP, el crecimiento de acelera. Este rápido descenso

en el crecimiento en los cultivos con 0.50 mg/L de BAP se puede explicar por la progresión

de la senescencia en los explantes.

Por todo lo mencionado anteriormente el medio MS9 (F) fue con el que se obtuvo la

mayor tasa de crecimiento. En la producción de enzimas proteolíticas, la tasa de crecimiento

es determinante para seleccionar el medio de cultivo, ya que la producción de estas enzimas

en los cultivos celulares de J. mexicana está asociada al crecimiento.

0

4

8

12

16

20

A B C D E F

Medio de cultivo MS

Tasa

de

crec

imie

nto

g fin

ales

/ g

inic

iale

s

15 días 30 días 45 días 60 días

Figura 3. Efecto del mioinositol (MI), del BAP y de la caseína en el desarrollo de callos de J. mexicana. (A) 0.2 g/L MI, 0.50 mg/L BAP; (B) 0.1 g/L MI, 0.5 mg/L BAP; (C) 0.2 g/L MI, 0.50 mg/L BAP, 0.05 g/L caseína; (D) 0.1 g/L MI, 0.50 mg/L BAP, 0.05 g/L caseína; (E) 0.2

g/L MI, 0.25 mg/L BAP y (F) 0.1 g/L MI, 0.25 mg/L BAP

En la Figura 4, se puede observar el efecto del mioinositol en la actividad proteolítica

determinada en el medio de cultivo donde crecieron los callos de J. mexicana.

Aparentemente la actividad proteolítica es la misma en los medios A y B con 0.2 g/L y 0.1 g/L

de este compuesto respectivamente. Lo mismo ocurre para los medios C y D, así como los

medios E y F, donde la única diferencia es la concentración de mioinositol. De esta manera



30

es posible afirmar que el mioinositol no tiene un efecto importante en la producción de

proteasas ni en la liberación de las mismas al medio de cultivo.

En la misma figura se aprecia que la adición de caseína al 0.005% (p/v) al medio de

cultivo tiene una influencia en la actividad proteolítica de los cultivos. La actividad

determinada en los medios de cultivo C y D con 0.005% (p/v) de caseína es mayor que en

los medios de cultivo A y B que no contienen esta proteína. Esto resultados apoyan el hecho

de que se puede inducir la síntesis de las enzimas proteolíticas en los cultivos celulares de J.

mexicana al adicionar caseína que es un sustrato de estas enzimas que son inducibles tal

como lo demostró Castañeda en 1956.

Por otra parte, la máxima actividad proteolítica se determinó a los 30 días de iniciado

el cultivo en los medios E y F, los que tienen 0.25 mg/L de BAP, dicha actividad fue 1.6

veces mayor con relación a los cultivos control A y B. Por lo anterior es posible afirmar que la

concentración de esta citocinina tiene un efecto significativo en la producción de estas

enzimas. Este compuesto tiene una acción estimulante en el metabolismo favoreciendo la

síntesis proteica.

0

200

400

600

800

1000

1200

A B C D E F

Medio de cultivo MS

Act

ivid

ad e

nzim

átic

aU

T to

tale

s

15 días 30 días 45 días 60 días

Figura 4. Efecto del Mioinositol (MI), del BAP y de la caseína en la actividad proteolítica determinada en los medios de cultivo donde crecieron los callos de J. mexicana. (A) 0.2 g/L

MI, 0.5 mg/L BAP; (B) 0.1 g/L MI, 0.5 mg/L BAP; (C) 0.2 g/L MI, 0.5 mg/L BAP, 0.05 g/L caseína; (D) 0.1 g/L MI, 0.5 mg/L BAP, 0.05 g/L caseína; (E) 0.2 g/L MI, 0.25 mg/L BAP y (F)

0.1 g/L MI, 0.25 mg/L BAP



31

En base a todo lo discutido anteriormente, el medio de cultivo seleccionado para

realizar los estudios de producción de enzimas proteolíticas y compuestos antioxidantes en

medio en suspensión a nivel matraz fue el medio F (MS9 completo en sales y con 0.5mg/L

de 2,4-D y 0.25 mg/L de BAP). Ya que con este medio se obtuvo la mayor tasa de

crecimiento así como la mayor producción de enzimas proteolíticas.

6.2 Estudio del efecto de un inductor y de la concentración inicial de sacarosa a nivel matraz

Los resultados de la cinética de los cultivos celulares de J. mexicana en presencia de

caseína (un inductor) a 0.05 g/L que equivale a 0.005 % (p/v) y con dos diferentes

concentraciones de sacarosa (4% y 6% p/v), se muestran en las Figuras 5 a 7 y en los

Cuadros 3 y 4. Los cultivos de células en suspensión a nivel matraz se mantuvieron durante

90 días.

La Figura 5 muestra la concentración de proteína total determinada en los medios de

cultivo en suspensión donde crecieron las células de J. mexicana. Como se puede observar,

la concentración de proteína presentó variaciones durante el tiempo de cultivo, sin embargo

con la adición de caseína al 0.005% (p/v) se observa un incremento apreciable en la proteína

con ambas concentraciones de sacarosa (4 y al 6% (p/v)). Alcanzando una concentración

máxima a los 15 días de haber iniciado el cultivo. La concentración de proteína total en los

medios adicionados con caseína es entre 35% y 50% mayor con respecto a los controles sin

el inductor. Estos datos indican un incremento en la actividad metabólica asociada a la

presencia de caseína, la cual puede funcionar como inductor en la síntesis de las enzimas

proteolíticas.

Es posible apreciar que a los 30 días de cultivo la síntesis de proteína es similar con

4 y 6% (p/v) de sacarosa. Aparentemente la concentración de sacarosa no tiene un efecto

significativo en la síntesis de proteína liberada al medio de cultivo. Sin embargo después del

día 37 se observa una ligera disminución en la concentración de proteína en los medios con

6% (p/v) de sacarosa.



32

Los datos anteriores coinciden con los resultados de la determinación de la actividad

proteolítica en el medio de cultivo (Figura 6), ya que con 4% (p/v) de sacarosa y caseína se

obtuvo la mayor concentración de proteína y la mayor actividad proteolítica, además se

observan diferencias significativas de estos valores con respecto al cultivo testigo.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

0 15 30 45 60 75 90

Días de cultivo

Prot

eína

(mg/

L)

Figura 5. Efecto de la caseína (inductor) en la proteína determinada en el medio de

cultivo en suspensión donde crecieron las células de J. mexicana. Medio MS9 con 0.25 mg/L de BAP y 0.1 g/L de mioinositol:( ) sacarosa 4 %, caseína 0.05 g/L; ( ) sacarosa

4%, sin caseína; (▲) sacarosa 6%, caseína 0.05 g/L; (●) sacarosa 6 %, sin caseína.

La Figura 6 muestra la actividad proteolítica determinada en el medio de cultivo

donde crecieron las células de J. mexicana. Como se puede observar, la actividad

proteolítica fue mayor en los cultivos adicionados con caseína al 0.005% (p/v). Los

incrementos encontrados a los 37 días de cultivo fueron de 1.6 veces con sacarosa al 4%

(p/v) y de 1.2 veces con sacarosa al 6% (p/v) con respecto al control con la misma

concentración de sacarosa pero sin inductor. También se observa que con las células de J.

mexicana, la actividad enzimática se incrementó en un tiempo relativamente corto después



33

de haber iniciado el cultivo, es decir, el efecto de inducción apareció a partir del día 15. En

otros estudios realizados con un hidrolizado de caseína al 0.05% (p/v), se encontró un

incremento de 2.3 veces en la actividad proteolítica a los 35 días de haber iniciado el cultivo

(Barrera, 2006). Nuestros resultados muestran un incremento menor en la actividad

proteolítica, pero el efecto de inducción apareció al mismo tiempo. Sin embargo hay que

considerar que en este trabajo se utilizó un concentración diez veces menor de la proteína

completa.

La máxima actividad proteolítica determinada en los medios de cultivo se registró a

los 45 días de iniciado el cultivo, y a partir del día 60 la actividad comienza a decaer, lo cual

coincide con el decremento en la proteína total, como se observa en la Figura 5.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 15 30 45

Días de cultivo

Act

ivid

ad p

rote

olíti

caU

T/L

x 10

-5

Figura 6. Efecto de la caseína (inductor) 0.005% (p/v) en la actividad proteolítica

determinada en el medio de cultivo en donde crecieron las células de J. mexicana en suspensión. Medio MS9 con 0.25 mg/L de BAP y 0.1 g/L de mioinositol:( ) sacarosa 4 %, caseína 0.05 g/L; ( ) sacarosa 4%, sin caseína; (▲) sacarosa 6%, caseína 0.05 g/L;

(●) sacarosa 6 %, sin caseína.



34

Los resultados del efecto de la caseína y la concentración inicial de sacarosa en la

producción de biomasa se reportan en la Figura 7. El crecimiento celular de las células en

suspensión de J. mexicana es similar en los medios de cultivo donde la concentración de

sacarosa es del 6%. (p/v). Estos resultados indican que aunque con una concentración

mayor de sacarosa las células tienen disponible más fuente de carbono, éstas no la utilizan

para producir más biomasa. También se muestra que la presencia de caseína no tiene un

efecto importante en el crecimiento celular, ya que en los medios adicionados con caseína al

0.005% p/v se obtiene una biomasa en peso seco similar con respecto a los controles sin

caseína.

En esta misma figura es posible apreciar que el crecimiento celular incrementó

gradualmente con el tiempo y continúa de este modo hasta los 90 días de cultivo sin

presentar una fase de crecimiento estacionaria.

0

2

4

6

8

10

12

0 15 30 45 60 75 90

Días de cultivo

Cre

cim

ient

o ce

lula

r g

/L (P

S)

Figura 7. Efecto de la caseína (inductor) 0.005% (p/v) en la producción de biomasa de

los cultivos de células de J. mexicana en suspensión. Medio MS9 con 0.25 mg/L de BAP y 0.1 g/L de mioinositol:( ) sacarosa 4 %, caseína 0.05 g/L; ( ) sacarosa 4%, sin

caseína; (▲) sacarosa 6%, caseína 0.05 g/L; (●) sacarosa 6 %, sin caseína.



35

Los resultados concernientes al consumo de sacarosa como fuente de carbono, se

muestran en el Cuadro 3, donde se observa que el consumo de sacarosa es mayor en

presencia del inductor (0.005 % de caseína) con respecto a los cultivos sin inductor en

ambas concentraciones de sacarosa (4% y 6% p/v). Estos resultados coinciden con la mayor

producción de enzimas proteolíticas como se discutió anteriormente (Figura 6), de esta

manera la presencia de caseína en los cultivos induce un mayor consumo de fuente de

carbono y así como una mayor síntesis y/o liberación de proteasas cisteínicas al medio de

cultivo. Así parece evidente que en presencia de caseína como inductor, las células

incrementaron su consumo de sacarosa como fuente de carbono para lograr una mayor

síntesis de estas enzimas.

También se puede apreciar que el consumo de sacarosa es similar al comparar los

medios de cultivo 1 y 3, así como los medios 2 y 4, donde la única diferencia es la

concentración inicial de sacarosa. Estos resultados apoyan los obtenidos en cuanto al

crecimiento celular (Figura 7), ya que no se observó una influencia en la producción de

biomasa al variar la concentración inicial de sacarosa (4 y 6% p/v) en los medios de cultivo.

La sacarosa es la fuente de carbono más utilizada en los cultivos celulares in vitro, la

cual es rápidamente convertida en glucosa y fructosa antes de su asimilación. Se ha

reportado que los azúcares además de ser utilizados en el crecimiento, estarían cumpliendo

un papel como compuestos en la señal de inducción del metabolismo (Smeekers, 2000). Los

niveles de sacarosa han mostrado que tienen un efecto sobre la producción de metabolitos

secundarios en el cultivo. Se ha postulado que las altas concentraciones de sacarosa (5% al

7% p/v) producen un estrés osmótico vía jasmónico, pero no se descarta que a bajas

concentraciones de sacarosa un mecanismo de señalización esté involucrado. Sin embargo

En este estudio la concentración de sacarosa no tiene un claro efecto en la

producción de enzimas proteolíticas que son metabolitos primarios y que están parcialmente

relacionados al crecimiento celular. Sin embargo a pesar de que una alta concentración de

este compuesto representa un factor de estrés que desataría una mecanismos de defensa

donde se encuentran involucradas las enzimas proteolíticas, con una concentración de

sacarosa de 6% (p/v) no se observó un aumento en la síntesis de enzimas proteolíticas



36

Cuadro 3. Efecto de la caseína (inductor) al 0.005% (p/v) en el consumo de sacarosa en los

cultivos en suspensión de células de J. mexicana.

Consumo de sacarosa %a

Medio MS9b 1 2 3 4

15 55.2 32.6 49.2 32.6

30 47.1 32.2 60.4 33.4

37 56.2 25.4 32.6 33.5

51 38.0 17.1 12.1 39.4

Día

s de

cul

tivo

65 55.9 34.4 60.0 50.7 a Porcentaje de sacarosa consumido a los x días de cultivo [(g consumidos de sacarosa /g iniciales

de sacarosa)*100]; bMedio MS9 con BAP 0.25 mg/L, 2,4-D 0.5 mg/L; (1) sacarosa 4% y caseína 0.005% (p/v); (2) sacarosa 4% sin caseína; (3) sacarosa 6% y caseína 0.005% (p/v); (4) sacarosa

6% sin caseína

En el Cuadro 4, se muestra la actividad antioxidante del radical DPPH por efecto del

medio de cultivo donde crecieron las células de J. mexicana. El tiempo t=0 días es el testigo

correspondiente al medio nuevo sin células. Como se puede observar, la actividad

antioxidante del testigo es aproximadamente del 88%. La cual es bastante alta debido a la

naturaleza del medio de cultivo que contiene compuestos antioxidantes como vitaminas,

reguladores de crecimiento, ácidos orgánicos, iones, etc. Mismos que favorecen el desarrollo

del cultivo.

Después de un mes de iniciado el experimento, la actividad antioxidante en las cuatro

formulaciones del medio MS9 probadas aumenta con respecto al testigo en un pequeño

porcentaje. Sin embargo, después de 65 días la actividad antioxidante es entre 8 y 9% mayor

con respecto al medio donde no han crecido células de J. mexicana. Los resultados

anteriores dan indicio de que J. mexicana es capaz de sintetizar compuestos con actividad

antioxidante en cultivos in vitro.

Como se puede apreciar también en este cuadro, no hay una diferencia significativa

entre la actividad antioxidante de los diferentes medios donde crecieron las células de J.

mexicana, lo que indica que la presencia de caseína y la concentración de sacarosa no

influyen en la producción de compuestos antioxidantes.



37

Cuadro 4. Actividad Antioxidante determinada en los medios de cultivo en suspensión de células de J. mexicana.

% Inhibicióna Medio MS9b 1 2 3 4

0 88.6 87.8 88.1 88.3

15 93.0 89.3 88.5 88.6

30 94.6 94.1 93.8 94.1

37 96.6 96.5 95.6 96.0

51 97.2 96.4 94.7 96.4 Día

s de

cul

tivo

65 97.1 96.9 95.9 96.5

a Determinada por el método de la reducción del radical DPPH (2-2-difenil-1-picril-hidracilo), muestras al 0.5 % (v/v). bMedio MS9 con BAP 0.25 mg/L, 2,4-D 0.5 mg/L; (1) sacarosa 4% y caseína 0.005% (p/v); (2) sacarosa 4% sin caseína; (3) sacarosa 6% y caseína 0.005% (p/v); (4) sacarosa 6% sin

caseína.

Los resultados anteriores parecen confirmar que la adición de caseína al 0.005%

(p/v) aumenta la producción de proteasas que se liberan al medio de cultivo. Así pues, la

concentración de sacarosa para la realización de los estudios con este inductor a nivel

biorreactor es al 4% (p/v), ya que con esta se obtiene mayor actividad proteolítica y

aparentemente no afecta el desarrollo del cultivo.

6.3 Preparación del inóculo para el cultivo en biorreactor

Los resultados de la cinética del inóculo que sirvió para el establecimiento de los cultivos en

biorreactor con inductor y control, son mostrados en las Figuras 8 a 12. Es importante

mencionar que se cambió medio fresco a los 14 días de establecido el cultivo y que el medio

de cultivo semilla no contenía caseína. Las muestras se tomaron cada siete días y al medio

de cultivo sin células se le determinó actividad proteolítica, biomasa, consumo de sacarosa,

proteína y actividad antioxidante.



38

En la Figura 8 se presenta la determinación de la actividad proteolítica en el medio de

cultivo, como se puede apreciar a los15 días de cultivo se observa un máximo de actividad

proteolítica la cual se mantiene hasta el día 28. Los resultados demuestran que las células

de J. mexicana estaban produciendo enzimas proteolíticas.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 5 10 15 20 25 30

Días de cultivo

Act

ivid

ad p

rote

olíti

caU

T/L

x 10

-4

Figura 8. Actividad proteolítica del cultivo celular de Jacaratia mexicana (inóculo).

En la Figura 9, se observa el incremento de la biomasa a causa de la división y

alargamiento celular. Como se aprecia, el desarrollo celular presenta una fase de crecimiento

exponencial que inicia desde el establecimiento del cultivo. Es importante mencionar que no

se observó la fase lag de crecimiento durante la cinética del cultivo celular de J. mexicana, la

cual posiblemente se evitó al iniciar el cultivo con una alta densidad celular de

aproximadamente 10% (p/v) en peso fresco.

Los resultados indican que la biomasa utilizada para establecer el cultivo celular se

encontraba en óptimas condiciones fisiológicas para el crecimiento en el biorreactor y para la

producción del metabolito deseado.



39

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 5 10 15 20

Días de cultivo

Cre

cim

ient

o ce

lula

r g/

L (P

S)

Figura 9. Desarrollo de la biomasa del cultivo celular de Jacaratia mexicana (inóculo)

La figura 10 muestra que el consumo de sacarosa durante el desarrollo del cultivo de

J. mexicana fue de aproximadamente 30% en 7 días. Al día 14 de cultivo se encontró un

consumo de sacarosa del 60%, pero después la velocidad de consumo disminuye hasta los

28 días de cultivo. Estos resultados nos proporcionan información acerca de la velocidad de

consumo de sacarosa de las células de J. mexicana, que es el nutriente limitante.

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20 25 30

Días de cultivo

Saca

rosa

resi

dual

%

p/v

Figura 10. Consumo de sacarosa del cultivo celular de Jacaratia mexicana (inóculo).



40

En la Figura 11 se muestra la concentración de proteína determinada en el medio de

cultivo donde crecieron las células de J. mexicana y se observa que la concentración de

proteína aumentó durante el desarrollo del cultivo hasta los 21 días y después se observa un

ligero decremento que coincide con los resultados de la actividad proteolítica. La

concentración a los 14 días es ligeramente menor, esta disminución puede atribuirse a un

error experimental, ya que para los 21 días, la proteína aumenta nuevamente.

0

30

60

90

120

0 5 10 15 20 25 30

Días de cultivo

Prot

eína

m

g/L

Figura 11. Determinación de proteína del cultivo celular de Jacaratia mexicana (inóculo).

La actividad antioxidante del radical DPPH por efecto del medio de cultivo donde

crecieron las células de J. mexicana, se muestra en la Figura 12. Como se puede observar, a

partir del día 7 la actividad antioxidante por efecto de los componentes del medio de cultivo

aumentó conforme avanzó el tiempo de la cinética, mostrando una mejora de entre 8 y 10%

aproximadamente con respecto al tiempo inicial, donde la inhibición del radical DPPH es del

85% ± 0.02. La mayor actividad antioxidante se reporta a los 21 días de cultivo con una

inhibición del radical DPPH de 95.3% ± 0.01.



41

0

20

40

60

80

100

0 7 14 21 28

Días de cultivo

% In

hibi

ción

del

DPP

H

Figura 12. Actividad Antioxidante del cultivo celular de Jacaratia mexicana (inóculo).

Muestras al 0.5%(v/v).

El cultivo celular fue capaz de reaccionar al momento del cultivo y de llevar una

multiplicación vegetativa importante. Estos resultados indican que el cultivo se encontraba en

óptimas condiciones metabólicas para ser usado como inóculo para el cultivo a nivel

biorreactor.

6.4 Cultivo celular de Jacaratia mexicana en un biorreactor Air-lift de 0.5 L con un inductor

Los resultados de los cultivos celulares de J. mexicana en un biorreactor Air-lft de 0.5 L

(Figura 13) se presentan en las Figuras 14 a 18. Los cultivos se mantuvieron durante 21 días

en el medio MS adicionado con 4% de sacarosa, 0.25 mg/L de BAP y 0.50 mg/L de 2,4-D; un

cultivo se operó en presencia de inductor (caseína al 0.005% p/v) y otro sin inductor que fue

el cultivo control. Las condiciones de trabajo de ambos biorreactores fueron: una velocidad

de aireación de 0.3 vvm, un volumen de operación de 500 mL y una temperatura de 25 ± 2ºC

Los biorreactores se operaron simultáneamente y fueron inoculados con el mismo cultivo

semilla, el cual no contenía caseína.



42

Figura 13. Cultivos celulares de Jacarita mexicana en un biorreactor Air-lift de 0.5 L

En la Figura 13 se muestra la actividad enzimática proteolítica determinada en el

medio de cultivo donde crecieron las células de J. mexicana. Se observa que la actividad

proteolítica del cultivo con caseína al 0.005% (p/v) es 1.6 veces con relación al cultivo control

(sin caseína) en todo el transcurso del desarrollo del cultivo, este incremento coincide con el

obtenido a nivel matraz. Sin embargo la actividad muestra una disminución en el día 14 de

haber iniciado el cultivo en ambos biorreactores, este mismo fenómeno ocurrió en el trabajo

reportado por Barrera-Martínez (2006) en un biorreactor Air-lift de 2 L. Esta disminución se

puede atribuir al periodo de adaptación de las células al cultivo en biorreactor o al

agotamiento de los nutrientes en el medio de cultivo, principalmente sacarosa, ya que

cuando se alimentó con medio fresco al día 21, la actividad se incrementa a lo largo del

cultivo.



43

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 5 10 15 20

Días de cultivo

Act

ivid

ad p

rote

olíti

caU

T/L

x 10

-4

Figura 14. Actividad proteolítica determinada en el medio de cultivo donde crecieron las células de Jacaratia mexicana en un biorreactor Air-litf de 0.5 L: ( ) con 0.005% (p/v) de

caseína y (□) cultivo control

El crecimiento celular de J. mexicana es mostrado en la Figura 14. La biomasa

incrementó durante el transcurso de la cinética mostrando un comportamiento exponencial

que continúa hasta los 21 días de cultivo sin presentar una fase de crecimiento estacionaria.

Asimismo, no se observó la fase lag, lo cual confirma que el inóculo estaba en buenas

condiciones fisiológicas y las células respondieron adecuadamente a las condiciones del

cultivo en biorreactor.

De igual manera, se puede observar que la producción de biomasa en el medio

adicionado con caseína al 0.005% (p/v) es similar al cultivo control y tal como ocurrió en los

cultivos en matraz, la presencia de caseína al 0.005% (p/v) no tiene un efecto importante en

el desarrollo del cultivo.



44

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20

Días de cultivo

Cre

cim

ient

o ce

lula

rg/

L (P

S)

Figura 15. Crecimiento celular de Jacaratia mexicana en un biorreactor Air-lift de 0.5 L: con

( ) 0.005% (p/v) de caseína y (□) cultivo control

Los resultados del consumo de sacarosa como fuente de carbono, se muestran en la

Figura 16, donde se observa que dicho consumo es similar en el cultivo con inductor (0.005

% de caseína) y en el cultivo control sin caseína. Sin embargo, estos resultados no coinciden

con la mayor producción de enzimas proteolíticas como se discutió anteriormente (Figura

14).

El consumo de sacarosa en el cultivo en el biorreactor fue de entre 60 y 70 % a los 7

días de cultivo, a diferencia del cultivo en matraz que fue de 30%. El incremento de la

velocidad de consumo de sacarosa en los cultivos en biorreactor, puede deberse a una

mayor producción de biomasa. Por otro lado, la presencia de caseína parece no tener efecto

en el desarrollo celular y sólo actúa como inductor incrementando la actividad proteolítica.



45

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20

Días de cultivo

Saca

rosa

resi

dual

% P

/V

Figura 16. Consumo de sacarosa de las células de Jacaratia mexicana creciendo en un

biorreactor Air-lift de 0.5 L: ( ) con 0.005% (p/v) de caseína y (□) cultivo control

La Figura 17 muestra la concentración de proteína en el medio de cultivo donde

crecieron las células de Jacaratia mexicana en el biorreactor. Se observa que la

concentración de proteína aumentó durante el desarrollo del cultivo hasta los 21 días de

cultivo en el biorreactor con inductor (caseína 0.005% p/v) a diferencia del cultivo control

donde la proteína va en decremento. La concentración de proteína al día 21 en el cultivo con

caseína es 2.8 veces mayor con respecto al control sin inductor.

Los datos anteriores coinciden con los resultados de la determinación de la actividad

proteolítica en el cultivo en biorreactor (Figura 14), así como con los resultados obtenidos a

nivel matraz, donde la adición de caseína al 0.005% p/v provocó un incremento en la

actividad proteolítica y en la concentración de proteína en el medio de cultivo.



46

0

10

20

30

40

0 5 10 15 20

Días de cultivo

Prot

eína

mg/

L

Figura 17. Proteína total determinada en el medio de cultivo donde crecieron las células de Jacaratia mexicana en un biorreactor Air-lift de 0.5 L: ( ) con 0.005% (p/v) de caseína y (□)

cultivo control

En el Cuadro 5, se muestra la actividad antioxidante del radical DPPH por efecto del

medio de cultivo donde crecieron las células de J. mexicana en un biorreactor tipo Air-lift de

0.5 L. Como se puede observar, la actividad antioxidante al tiempo 0 días es

aproximadamente del 90%, debido a los componentes del medio de cultivo. Al alcanzar el

día 7 de cultivo se obtuvo un incremento del 8 al 10% en la inhibición del radical DPPH con

relación al tiempo inicial. Sin embargo, esta inhibición decae a partir del día 14 de cultivo.

Estos resultados pueden deberse a las condiciones de aireación en el cultivo en biorreactor

que podrían ocasionar estrés oxidativo a las células de J. mexicana, las cuales tienen una

demanda de oxígeno baja. Es importante indicar que la aireación es necesaria para

mantener la homogeneidad de la concentración de nutrientes en el medio de cultivo y para

evitar la formación de agregados celulares. Pero como la oferta de oxígeno es superior a la

demanda de las células, el medio de cultivo tiende a mostrar características oxidativas.

Por este lado, se tienen reportes que en plantas del género Arabidopsis, la

generación de especies reactivas de oxígeno se incrementa en respuesta a un estrés

oxidativo continuo (Tiwari y col., 2002).



47

Cuadro 5. Actividad Antioxidante determinada en los medios de cultivo donde crecieron las células de J. mexicana en un biorreactor Air-lift de 0.5 L

% Inhibicióna

Días de cultivo Caseína 0.05 g/L Control

0 86.14 92.34

7 96.97 94.12

14 90.40 89.62

21 90.53 90.15 a Determinada por el método de la reducción del radical DPPH (2-2-difenil-1-picril-hidracilo), muestras

al 0.5 % (v/v).

Como se aprecia en la Figura 18 los cultivos de células de J. mexicana creciendo en

un biorreactor Air-lift son heterogéneos en cuanto a su tamaño, forma y agregación celular.

Se evidencia la existencia de varias formas de ellas: que van desde redondas, elípticas y

alargadas, sin embargo cabe mencionar que en el transcurso del cultivo la forma de las

células tiende a ser alargada y la presencia de células individuales es mayor.

Asimismo las células de J. mexicana cultivadas en el biorreactor no mostraron

demasiado daño celular y se mantuvo en aumento la cuenta de células viables.

Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos en un trabajo previo en el cual

se estableció un cultivo celular de J. mexicana en un biorreactor tipo Air-lft de 2 L con una

velocidad de aireación de 2.86 vvm, donde se obtuvo desarrollo celular y síntesis de enzimas

proteolíticas, en forma continua durante 77 días. Por lo tanto deducimos que los cultivos

celulares de J. mexicana no son tan frágiles para crecer en biorreactor (Martínez-Guillén,

2006). Cabe señalar que en el presente trabajo los cultivos en biorreactor se operaron a 0.3

vvm, es decir, las células estaban sometidas a menos estrés hidrodinámico, ya que la

velocidad de aireación es casi nueve veces menor.



48

Figura 18. Células de Jacaratia mexicana creciendo en un Biorreactor Air-lift de 0.5 L a los 7

días de cultivo (A) Caseína 0.005% p/v (B) Control a 100X

Para cuantificar viabilidad conforme al tiempo, se midió la fracción de células viables

en función del tiempo de cultivo, tal como se muestra en la Figura 19. La comparación de

datos de la fracción de células viables de J. mexicana creciendo en un biorreactor Air-lift de

0.5 L con caseína al 0.005% y sin caseína, muestran un comportamiento muy similar. Tanto

el cultivo con caseína como el cultivo control presentan un decremento en la proporción de

células viables. Es posible observar que la velocidad en la disminución de viabilidad es casi

constante durante la fase exponencial de crecimiento. Sin embargo, a partir del día 21, la

fracción viable aumenta, lo cual implica que las células son más susceptibles a daños por

fuerzas hidrodinámicas solo al inicio del cultivo. Además, el análisis microscópico reveló un

mayor número de células rotas o deformadas durante los primeros días de cultivo.

Es necesario mencionar que conforme avanzó el cultivo en biorreactor, la viscosidad

del medio de cultivo fue en aumento, lo cual se puede deber al aumento de la densidad

celular. Adicionalmente se ha reportado que los cultivos de células vegetales, sometidos a

condiciones de estrés liberan proteínas y polisacáridos en el medio de cultivo que

desempeñan un papel de protección a las células crecidas en biorreactor.

Cabe señalar que aunque las células visiblemente deformadas o rotas se tiñeron de

azul oscuro con el colorante azul de tripano, algunas células intactas se tiñeron también.

A B



49

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20

Días de cultivo

Frac

ción

de

célu

las

viab

les

(%)

Figura 19. Fracción del número de células viables de J. mexicana contra el tiempo de cultivo

en un biorreactor Air-lift de 0.5 L: ( ) con 0.005% (p/v) de caseína y (□) cultivo control

La Figura 19 muestra la cuenta de células vivas del cultivo de J. mexicana en el

biorreactor, la cual se incrementó entre 4.3 y 2.8 veces a los 21 días del cultivo. Este

crecimiento acelerado indica que la densidad inicial de inóculo fue adecuada, así como el

flujo de aireación (0.3 vvm).

Se observa el mismo comportamiento obtenido con la cuantificación de biomasa por

peso seco (Figura 15). De esta manera se confirma que no existe una diferencia aparente en

el crecimiento celular entre los cultivos con caseína (0.005% p/v) y si ella, tanto a nivel

matraz como biorreactor.



50

0.E+00

2.E+05

4.E+05

6.E+05

0 5 10 15 20 25

Días de cultivo

Cuen

ta v

iabl

e (c

élul

as/m

L)

Figura 20. Cuenta de células viables de J. mexicana contra el tiempo de cultivo en un

biorreactor Air-lift de 0.5L: ( ) con 0.005% (p/v) de caseína y (□) cultivo control

Se consiguió el establecimiento del cultivo en biorreactor y las condiciones

adecuadas para el mantenimiento de las células para la producción de enzimas proteolíticas.

Hasta el día 21 de cultivo la actividad enzimática va en incremento, sin embargo se ha

reportado que esta actividad decae después del día 40 (Barrera-Martínez, 2006). Las células

de ambos cultivos se encontraban en una etapa de crecimiento acelerado y también la

actividad proteolítica aumentó considerablemente. Los resultados corroboran que las

proteasas son un metabolito parcialmente asociado al crecimiento.

6.5 Determinación de peso molecular de las proteasas por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Las muestras de proteasas recuperadas del medio de cultivo donde crecieron las células de

Jacaratia mexicana, después de un proceso de liofilización, diálisis y ultrafiltración, se

sometieron a una electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%, con SDS. El patrón

electroforético de la Figura 19, muestra que el P-IV proveniente del extracto del látex de J.

mexicana presentó una banda de aproximadamente 24 kDa correspondiente al peso

molecular de la “mexicaína” (carriles 4 y 5). Los medios de cultivos celulares de J. mexicana

concentrados, también mostraron una banda de aproximadamente 24 kDa (carriles 2 y 3); lo



51

cual indica que las células de J. mexicana cultivadas in vitro son capaces de producir las

mismas proteasas presentes en el látex de dicha planta. Como se puede observar, en los

cultivos celulares de J. mexicana se producen otras proteínas extracelulares, pero la fracción

que muestra actividad proteolítica es la que se encuentra en mayor proporción.

Figura 21. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% con SDS. Carril 1. Marcador de

masa molecular de 26.6 a 180 kDa. Carriles 2 y 3. Medio de cultivo en donde crecieron las células de J. mexicana. Carriles 4 a 7. “mexicaína” (P-IV) purificada del látex de J.

mexicana. Carriles 8 y 9. Látex de J. mexicana.

1 2 3 4 5 6 7 8 9180 116 90

58

48.5

36.5 26.6

24 kDa



52

7. CONCLUSIONES

− En los cultivos de callos de J. mexicana se observó que con 0.1 g/L de

mioinositol hay una mayor tasa de crecimiento que con 0.2 g/L. Sin embargo

este compuesto no tiene una influencia en síntesis de enzimas proteolíticas. − La presencia de caseína al 0.005% (p/v) en los cultivos de callos de J.

mexicana aumenta la producción de enzimas proteolíticas que se liberan al

medio de cultivo.

− Los callos con 0.25 mg/L de BAP tuvieron una tasa de crecimiento 1.2 veces

mayor que con 0.50 mg/L y la producción de enzimas proteolíticas aumentó

1.6 veces.

− La adición de caseína al 0.005% (p/v) en los cultivos celulares de J. mexicana

tanto a nivel matraz como biorreactor, incrementó 1.6 veces la producción de

enzimas proteolíticas excretadas al medio de cultivo donde crecieron dichas

células y aparentemente no se afectó el crecimiento celular.

− El incremento en concentración de la sacarosa del 4 al 6% no favorece el

crecimiento del cultivo celular en suspensión de J. mexicana. Sin embargo con

4 % de sacarosa es mayor la producción de enzimas proteolíticas.

− Los resultados muestran que J. mexicana es capaz de sintetizar compuestos

con actividad antioxidante en cultivos in vitro a nivel matraz.

− Se logró establecer un cultivo celular de J. mexicana en un biorreactor Air-lift

de 0.5L, el cual se mantuvo durante 21 días en forma continua con desarrollo

celular y síntesis de enzimas proteolíticas.

− Las proteasas obtenidas en los cultivos celulares de Jacaratia mexicana son

similares a las del látex de la planta completa.



53

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56

9. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

No ACTIVIDAD

Ener

o

Febr

ero

Mar

zo

Abr

il

May

o

Juni

o

Julio

Ago

sto

Sept

iem

br

e

Oct

ubre

Nov

iem

br

e

Dic

iem

bre

Ener

o

Febr

ero

1 Revisión bibliográfica X X X X X X X X X X X X X X

2 Cultivo de callos de Jacaratia mexicana en medio MS X X X

3 Estudio del efecto de un inductor en la tasa de crecimiento de callos y en la producción de enzimas proteolíticas en medio semisólido.

X X X X

4 Estudio del efecto de un inductor en la producción de enzimas proteolíticas y compuestos antioxidantes en cultivos en células en suspensión de J. mexicana en matraz

X X X

5 Establecimiento de cultivo de células de J. mexicana en un biorreactor

X X X

6 Evaluación de la producción de biomasa, enzimas proteolítica y compuestos antioxidantes en cultivo de células de J. mexicana en un biorreactor

X X X

10 Identificación de enzimas proteolíticas por PAGE X X

11 Escritura y presentación del informe final X X


_____________________________________________________________________________

10. ANEXO

Medio Knop

Reactivo g/L

Mg SO4 · 7H2O 0.2

KNO3 0.2

KH2PO4 0.2

CaNO3 · 4H2O 0.8

Agar 5.0

pH 5.5

Medio de Murashige y Skoog (MS)

Reactivo g/L

Sacarosa 20

Mioinositol 0.1

Agar noble 6.0

mL/L

Vitaminas 1.0

* Micronutrientes 100

* Macronutrientes 100

pH 5.6-5.7

*Macronutrientes MS 10X

Reactivo mg/L

NH4NO3 16500

KNO3 19000

CaCl2·H2O 4400

MgSO4 · 2H2O 3700

KH2PO4 1700

NaH2PO4 · H2O 850

*Micronutrientes MS 10X

Reactivo mg/L

KI 8.3

H3BO3 62

MnSO4·4H2O 223

ZnSO4·4H2O 86

NaMoO5·2H2O 2.5

CuSO4·5H2O 0.25

CoCl2·6H2O 0.25

Na2EDTA·2H2O 372

FeSO2·7H2O 278

Vitaminas MS 1000X

Vitaminas y orgánicos g/L

Mioinositol 100

Ácido nicotínico 0.5

Piridoxina HCl 0.5

Tiamina HCl 0.1

Glicina 2.0



58

Regulador de Fosfatos 0.05 M pH 7.6

Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4)...............................5.961 g/L

Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4).....................................7.098 g/L

Se preparan cada uno por separado a una molaridad de 0,05 M. Se ajusta el pH del fosfato

de sodio dibásico con el fosfato de sodio monobásico hasta alcanzar un pH de 7.6.

Caseína 1%

Caseína....................................................................................2 g

Regulador de fosfatos 0,05 M pH 7.6 ....................................190 mL

Cisteína 0.8 M

Cisteína-HCl............................................................................0.441 g

Regulador de fosfatos 0.05 M pH 7.6 ....................................3.5 mL

La cisteína se disuelve en regulador de fosfatos 0.05 M, pH 7.6, ajustado con NaOH 10 N y

se afora a 20 mL con el mismo regulador.

Ácido tricloroacético (ATC) 5%

Ácido tricloroacético .............................................................5 g

Agua destilada........................................................................aforar a100 mL

Solución de Azul de Tripano. Azul de Tripano al 20 % en PBS (Azul de tripano solución Sigma T-8154, Solución 0.4%,

preparada en 0.81 % de NaCl y 0.6% de fosfato de potasio dibásico), PBS (regulador de

fosfatos: NaCl 8.75g/L, Na2HPO4 2.25g/L, KH2PO4 0.2g/L, KCl 0.2g/L a pH 7.2 - 7.3).

Cálculo: Número de células por mililitro = Promedio obtenido de los conteos x 10,000 x

dilución

Reactivo de Bradford. Azul brillante de Coomasie G-25...........................................100 mg

Etanol al 95%.........................................................................50 mL

Ácido fosfórico al 85% (p/v) .................................................100 mL

Los 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 se disuelven en 50mL de etanol al 95%. A

esta solución se le añaden 100 mL de ácido fosfórico al 85% (w/v). La solución resultante se



59

diluye a un volumen final de 1 litro. Las concentraciones finales en el reactivo son 0.01%

(w/v) del colorante, 4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de ácido fosfórico.

Albúmina bovina (200 µg/mL) Albúmina bovina ...................................................................0.01 g

Agua destilada ......................................................................50 mL

Reactivo de Antrona Antrona .................................................................................150 mg

Ácido sulfúrico diluido..........................................................100 mL

Disolver la antrona en ácido sulfúrico diluido (70 mL de ácido sulfúrico y 36 mL de agua). Antibiótico Claforan inyectable sin lidocaína………………................120 µL/300 mL de medio de cultivo

Por cada litro de medio de cultivo adicionar 100 mg de antibiótico.

Antimicótico Ácido bórico…………………………..……………........….0.05 % (p/v)

Por cada 1000 mL de medio de cultivo adicionar 0.50 g de antimicótico.

Elaboración de geles con SDS 1. Preparar el gel separador de acrilamida al 12 % (Para un volumen de 5 mL: 1.7 mL de

H2O, 2 mL de Acrilamida-bisacrilamida (30:0.8), 1.25 mL de Tris 2 M pH 8.8, 25 µL PSA,

2.5 µL TEMED, 50 µL SDS al 10 %).

2. Vaciar la acrilamida y dejar que polimerice por aproximadamente 20 minutos.

3. Preparar el gel concentrador de acrilamida al 4 % (Para un volumen de 2 mL: 1.25 mL de

H2O, 0.275 mL de Acrilamida-bisacrilamida (30:0.8), 0.525 mL de Tris 2 M pH 6.8, 10 µL

PSA, 2 µL TEMED).

4. Vaciar la acrilamida, colocar el peine y dejar polimerizar por 20 minutos.

5. Sacar el peine, limpiar los pozos y colocar 30 µL de la muestra preparada [40 µL de

muestra, 10 µL de regulador de muestra (200 mM Tris-HCl pH 6.8, 0.4 % azul de

bromofenol y 40% glicerol)].



60

Las muestras se corrieron a 80 mV durante la etapa de concentración y a 120 mV durante la

etapa de separación utilizando amortiguador de Tris-Glicina con SDS como amortiguador de

corrida.

Curva tipo para la determinación de proteína por el método de Bradford La curva tipo para la determinación de proteína por el método de Bradford se construyó de

acuerdo al cuadro mostrado a continuación:

Cuadro 6. Elaboración de la curva tipo de proteína por el método de Bradford.

BSA 200

µg/mL (mL) 0 0.05 0.1 0.15 0.20 0.25

Agua destilada (mL) 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.0

Reactivo de Bradford (mL) 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75

Concentración de BSA (µg/mL) 0 40 80 120 160 200

Después de cinco minutos de agregado el reactivo de Bradford, leer la absorbancia a 595

nm. La cantidad de proteína contenida en las muestras es determinada interpolando la

absorbancia en la curva tipo elaborada con la albúmina de suero bovino (BSA).

Figura 22. Curva tipo de proteína por el método de Bradford.

y = 0.0045x + 0.0578R2 = 0.9752

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 50 100 150 200

Albúmina de suero bovino (µg/mL)

Abs

orba

nci

a 59

5



61

Curva tipo para la determinación de actividad enzimática por el método de Kunitz modificado

A partir de una solución 500 M de tirosina (la solución contiene 2 partes de regulador de

fosfatos pH 7.6 y 3 partes de ATC 5%). Hacer una curva tipo con 10 diferentes alícuotas (0.3,

0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 1.8, 2.1, 2.4, 2.7 y 3.0 mL) de la solución de tirosina, adicionar la mezcla de

regulador-ATC para llevar a un volumen final de 3.0 mL, y efectuar la lectura de absorbancia

a 280 nm. Elaborar la curva por triplicado.

Figura 23. Curva tipo de tirosina.

Curva tipo para la determinación de sacarosa por el método de la antrona La curva tipo para la determinación de sacarosa por el método de la antrona se construyó de

acuerdo al cuadro mostrado a continuación:

Cuadro 7. Elaboración de la curva tipo de sacarosa por el método de la antrona.

SACAROSA (mL) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1

Agua destilada (mL) 0.023 0.021 0.019 0.017 0.015

KOH (mL) 0.025

Reactivo de antrona (mL) 0.750 0.750 0.750 0.750 0.750

Concentración de sacarosa mg/mL 20 40 60 80 100

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 100 200 300 400 500 600

Tirosina (µmol/mL)

Abs

orba

ncia

y = 1.1595x + 0.0053R2 = 0.9995


_____________________________________________________________________________

Realizar la curva tipo usando cada una de las diluciones indicadas en el cuadro 5 por

triplicado. Agregar KOH e incubar durante de 10 minutos a ebullición. Dejar enfriar a

temperatura ambiente y adicionar el reactivo de la antrona, incubar a 40º C durante 10

minutos. Dejar enfriar a temperatura ambiente y leer la absorbancia a 620 nm. Calcular la

ecuación de la recta.

y = 0.0076x + 0.0081R2 = 0.9989

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 20 40 60 80 100Sacarosa [µg/mL]

Abs

orba

nci

a 62

0

Figura 24. Curva tipo de sacarosa por el método de la antrona.

producciÓn de enzimas proteolÍticas y compuestos

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