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Inmovilización de enzimas
Procesos de Química Sostenible utilizando enzimas como catalizadores
Curso Posgrado Ciencias y Tecnologías Químicas
VENTAJAS DE INMOVILIZAR ENZIMAS • Enzimas en forma de catalizadores heterogéneos
• Posibilidad de reutilización del catalizador
• No necesidad de separar la enzima de los productos de reacción
• Mayor versatilidad en elección de reactores
• Mejora de las propiedades (actividad, estabilidad y selectividad)
• Mejora del control de los procesos
Curso Posgrado 2012
ESTABILIZACION POR INMOVILIZACIÓN PURA
Las burbujas de gas o gotas de disolvente no pueden penetrar en los poros
Las moléculas de enzima están dispersas
No hay agregación No hay interacciones con interfases No hay posibilidad de proteolisis
Curso Posgrado 2012
MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
No todos los métodos de inmovilización estabilizan todas las enzimas
Curso Posgrado 2012
• Método muy simple
• Este método permite valores elevados de carga enzimática
• Las interacciones implicadas son resultantes de fuerzas de van der Waals, efectos hidrofóbicos y de carga iónica
• La selección del soporte pasa por su capacidad de retener la enzima, sin dejar desorber nuevamente al seno del liquido, actividad enzimática obtenida, posibilidad de regeneración y costo.
• Como ejemplos de soporte tenemos materias orgánicas neutras (carbón activo y celulosa) y cargadas (quitina, intercambiadores aniónicos y catiónicos), además de materia inorgánica (bentonita, alúmina, vidrio y sílica porosa).
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR MÉTODOS DE ADSORCIÓN Curso Posgrado 2012
+ + + +
- - -
-
-
- - -
- -
- - -
MECANISMO DE LOS PROCESOS DE ADSORCIÓN
Adsorción por mecanismo de intercambio multipuntual
Curso Posgrado 2012
DISEÑO DE NUEVOS SOPORTES PARA LA INMOVILIZACIÓN
MUY SENCILLA Y REVERSIBLE DE ENZIMAS
Reuso del soporte/ reactor Adsorciones físicas muy fuertes
Efecto estabilizante: Adsorción multisubunidades de proteínas multiméricas
Soportes muy estables
Condiciones de inmovilización muy suaves
No es necesario bloquear
Curso Posgrado 2012
INMOVILIZACIÓN REVERSIBLE SOBRE
SOPORTES RÍGIDOS RECUBIERTOS DE POLÍMEROS POLIFUNCIONALES
Gran concentración de grupos: adsorción fuerte
Biotechnol. Bioeng. 2000. 68, 98-105.
Biotechnol. Progr. 2004. 20, 284 - 288
Biotechnol. Progr. 2004. 20, 1134-1139.
COO -
SO4-2
NH3+
Curso Posgrado 2012
COMPARACIÓN DE SOPORTES PEI FRENTE A SOPORTES CONVENCIONALES:
ADSORCIÓN DE INVERTASA DE SACCHAROMYCES CEREVISAE
Biotechnol. Progr. 2003. 18, 1221-1226.
Sobrenadante
ADSORCIÓN A SOPORTES PEI
Suspensión
0
25
50
75
100
0 1 2 3 4 5
Tiempo (min)
Acti
vid
ad
, %
DESORCIÓN A pH 7
0
25
50
75
100
0 200 400 600 800 1000
[NaCl] (mM)
Acti
vid
ad
deso
rbid
a,
%
Curso Posgrado 2012
INACTIVACIÓN TÉRMICA DE INVERTASA ADSORBIDA SOBRE
SEPABEADS - PEI
Enzimas multiméricas : Adsorción multi-subunidades
Tª 55º C pH 7
Biotechnol. Progr. 2003. 18, 1221-1226.
0
25
50
75
100
0 5 10 15 20 25Tiempo (h)
Act
ivid
ad r
eman
ente
, (%
)
Sepabeads-PEI
DEAE
Enzima soluble
Curso Posgrado 2012
SOPORTES RECUBIERTOS DE POLÍMEROS
Adsorciones muy rápidas y sencillas
Adsorción más fuerte que soportes convencionales
Adsorción muy poco distorsionante (actividad 100%)
Adsorción estabilizante: adsorción multi-subunidades
estabilización frente a disolventes
Permiten reuso del soporte/reactor
Métodos sencillos y eficientes de mejorar las propiedades de las enzimas
Curso Posgrado 2012
Adsorción de Proteínas Recombinantes sobre Quelatos Metálicos
Adsorción multipuntual a través de varios grupos quelato
Adsorción unipuntual a través de una interacción muy fuerte con único quelato
COO
Me
His
His
His
His
His
His
COO
-
-
+2
Proteínas recombinantes con colas poli-His
Proteínas naturales
His
His
Curso Posgrado 2012
Enzimas recombinantes
con colas poli-His
COO-
COO- Zn+2
His
His
His
His
Adsorción unipuntual a través de una interacción muy fuerte
Adsorción multipuntual a través de varios grupos quelato
Enzimas naturales His
His
Curso Posgrado 2012
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS MEDIANTE COORDINACIÓN A METALES
UNION COVALENTE
Posibilidad de estabilización por unión multipuntual La unión de la enzima al soporte es muy fuerte
Útil cuando la enzima requiere ser estabilizada previa a su utilización
Tras inactivación hay que eliminar el soporte y la enzima
Curso Posgrado 2012
MECANISMOS DE INACTIVACIÓN DE ENZIMAS
+ + +
Alta temperatura Disolventes pHs extremos
M. acuoso pH neutro 4º C
ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS MEDIANTE PROCESOS DE INMOVILIZACIÓN
Rigidificación de la estructura 3-D Estabilización de la estructura cuaternaria
Curso Posgrado 2012
MECANISMOS DE ESTABILIZACIÓN POR INMOVILIZACIÓN
RIGIDIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA 3D
ESTABILIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA CUATERNARIA
+
Curso Posgrado 2012
Muchos residuos de la enzima Brazos espaciadores muy cortos Soporte rígido
Posiciones relativas invariables durante cualquier cambio conformacional inducido por cualquier agente distorsionarte
ESTRATEGIA GENERAL DE ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS POR INMOVILIZACIÓN COVALENTE MULTIPUNTUAL
ESTABILIZACIÓN 3-D
COMO CONSEGUIR ESTE TIPO DE INMOVILIZACIONES
Curso Posgrado 2012
RIGIDIFICACIÓN DE DIFERENTES REGIONES
Región cercana al centro activo Región más rica en lisinas
Bucle inestable
Curso Posgrado 2012
GRUPOS AMINO
NH2 ¨ Muy reactivo cuando está ionizado
Mayoritariamente en la superficie
Abundante
Amino terminal (pK=7.5) … muy reactivo a pH neutro Lisinas (pK=10.5) ……… poco reactivas a pH neutro
Curso Posgrado 2012
Reactividad mayor en el amino más reactivo (pk 7,5 <<< 10.7 (lys)
Muy difícil rigidificar la superficie a pH alcalino
INMOVILIZACIÓN SOBRE SOPORTES CON GRUPOS MUY REACTIVOS (glutaraldehído, CNBr, etc)
NH2 ¨
NH3
+
NH3
+
NH3
+
NH3
+
-OH
Curso Posgrado 2012
+
+
NaBH4
GRUPOS MUY POCO REACTIVOS
Reaccion intermolecular muy lenta
Bases de Schiff muy inestables
En principio muy poco útiles para la unión covalente enzima-soporte a pH neutro pero los hemos convertidos es los mejores para inmovilización estabilización
Curso Posgrado 2012
LOS RESIDUOS Y LA REGION
Los grupos amino: un amino terminal muy reactivo y numerosos residuos lisina poco reactivos
- NH2 (muy buen nucleófilo sin necesidad de activación)
..
La región : a.- el amino mas reactivo b.- las mas ricas en grupos amino
Curso Posgrado 2012
INMOVILIZACIÓN POR EL AMINO MÁS REACTIVO
NH
NH2
NH3 NH3
O
O
O
NH2
NH
O
O
O
NH2
OH
NH2
NH3+
NH3+
Curso Posgrado 2012
INMOVILIZACION DE ENZIMAS A TRAVÉS DE SUS GRUPOS AMINO
H2N R H2N R’
O CH2 C
O
H + H2N R
H2N
NH3
+ NH3
+
+
Curso Posgrado 2012
LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS Y SOPORTES GLIOXIL
pH 8.0 (NO) pH 10.0 (NO)
pH 10.0 (SI)
Regiones muy ricas en grupos aminos
NH2
NH2
H2N
H2N
H2N
H2N
NH2
H2N
H2N
H2N
H2N
Curso Posgrado 2012
EL PROCESO DE MULTI-INTERACCIÓN ENZIMA - SOPORTE
.........
Tiempo hasta 72 horas después del final de la primera inmovilización Temperatura (25 ºC >>> 4 ºC)
Curso Posgrado 2012
PUNTO FINAL DE LA MULTI-INTERACCION ENZIMA-SOPORTE
NaBH4
1mg/ml
O CH2
C
O
H
O CH2
C
O
H
NO CH2
CH
NO CH2
CH
NO CH2
CH NHO CH2
CH2
O CH2
CH2OH
NHO CH2
CH2
NHO CH2
CH2
O CH2
CH2OH
Curso Posgrado 2012
LOS GRUPOS GLIOXIL: SOPORTE-O- CH2 - CHO
Muy estables y muy cercanos al soporte rígido Reacción unipuntual reversible con grupos amino a.- orientación adecuada para inmovilización multipuntual b.- multi-interacción no distorsionarte
O CH2
C
O
H
.. NH2
Modificación química mínima
Ausencia de impedimentos estéricos
E NH2
CH2
CH2
O+ +
E NH3
Soportes completamente inertes e hidrofílicos
Curso Posgrado 2012
SOPORTES GLIOXIL PARA LA ESTABILIZACION DE ENZIMAS
Soportes formados por grandes superficies con un elevado grado de activación Brazos espaciadores muy pequeños La enzima se inmoviliza siempre por regiones muy ricas en NH2 Los grupos glioxil son muy estables y no tienen impedimentos estéricos durante la multi-interacción La modificación química de la enzima es mínima
C
O
H
C
O
H
C
O
H
C
O
H
C
O
H
C
O
HC
O
H
alta densidad superficial de grupos glioxil, Eq. / m2
Curso Posgrado 2012
ENZIMAS ESTABILIZADAS POR INMOVILIZACION MULTIPUNTUAL SOBRE SOPORTES GLIOXIL
>>>
estable
Tripsina Quimotripsina Penicilina G acilasa de E. Coli Penicilina G acilasa de K. citrophila Ferredoxina NADP reductasa de Anabaena Lipasa de C. rugosa Glutamato racemasa Esterasa de B. stearothermofilus Termolisina de B. thermoproteolyticus
ENZIMA
75% 70% 70% 70% 60% 50% 70% 70% 100%
ACTIVIDAD
10.000 60.000 8.000 7.000 1.000 150 1.000 1.000 100
ESTABILIZACION
Curso Posgrado 2012
Orientacion correcta: regiones muy ricas en aminos
No inmoviliza soportes muy activados a pH 7.0 No inmoviliza soportes poco activados a pH 10.0 Inmovilizacion muy rapida sobre soportes muy activados a pH 10.0 Inmovilizacion muy rapida de tripsina (autolisada) sobre soportes muy activados a pH 7.0 Efecto espectacular de la concentracion de grupos activos sobre la velocidad inmovilización Efecto espectacular de la temperatura sobre la velocidad de inmovilización Estabilización muy elevada de todas las enzimas evaluadas
glioxil muy diferente de BrCN, glutaraldehido…
Curso Posgrado 2012
Unión de enzimas con varios aminos terminales a soportes activados con grupos glioxil pH 7
Hipótesis multiméricas:
NH2
NH2
pH 8
NH2
Si hubiera varios aminos terminales en un mismo plano de la proteína esta se podría inmovilizar multipuntualmente sobre glioxil a pH 7-8
Ésta inmovilización debería involucrar a muchas subunidades
Curso Posgrado 2012
Curso Posgrado 2012
Grupos estables Posibilidad de reacción con muchos residuos de la enzima Brazos espaciadores cortos Muchos grupos activados
NH2 SH
OH
H2N
NH2 NH2
LOS SOPORTES EPÓXIDO PARA LA UNIÓN COVALENTE
MULTIPUNTUAL.
O
O
O
O
O
Curso Posgrado 2012
O
O
O
O
O
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS SOBRE SOPORTES EPÓXIDO
Inmovilización extremadamente lenta
NH2
Reacción amino-epoxido : Intermolecular muy lenta Intramolecular muy rápida e intensa
NH2
O
O
NH2
NH2
..
.. ..
..
Curso Posgrado 2012
MECANISMO DE INMOVILIZACIÓN-ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS A
SOPORTES EPÓXIDO
pH 7.0
Adsorción física
pH 10
NH2
..
pH 7.0
NH2
..
NH3+
NH3+
NH3+
Inmovilización covalente
O
O
O
O
NH2
..
NH3+
NH3+
NH3+
O
O
O
O
O
O
O
NH3+
NH3+
NH3+
Interacción multipuntual
Biomacromolecules. 2000. 1, 739-745 Nature Protocols. 2007. 2, 1022-33
Curso Posgrado 2012
2) Me+2
O
O
OH
+H2N
NH3+
O
O
NH+COO-
COO-
OH
OH
+H2N
B
OHHO
O
O
O
O
NH+COO-
COO-
Me+2
OH
Biomacromolecules. 2000. 1, 739-745
NH2
NH2
H2N+
COO-
COO-1)
O
O
O
H2N+
COO-
COO-
NH2
BOH
OH
Curso Posgrado 2012
INMOVILIZACIÓN COVALENTE DE ENZIMAS DE UN EXTRACTO CRUDO
DE Escherichia coli EN DIFERENTES SOPORTES
EPÓXIDO HETERO-FUNCIONALES.
Un alto porcentaje de enzimas se pueden inmovilizar sobre diferentes soportes .... diferentes orientaciones.
La utilización secuencial de 3 soportes permite la inmovilización de “todas” las proteínas del extracto.
Condiciones: pH 7 y 25ºC * 1 M de fosfato sódico
SOPORTE
Proteína
inmovilizada
Eupergit
Hidrofóbico* Eupergit Cu+2 Eupergit boronato Eupergit – NH3
+
70% >85% 75% 65%
Biomacromolecules. 2000. 1, 739-745
Curso Posgrado 2012
Epóxido
hidrofóbico
NH2-Epóxido M+2-Epóxido
Lipasa C. rugosa 100 95 70
PGA E. coli 75 nd 75
-galactosidasa A.oryzae 0 95 0
-galactosidasa
Thermus.sp.T2
40 35 95
Epóxido hidrolasa A.niger 30 95 0
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN FUNCIÓN DEL SOPORTE
Biomacromolecules. 2000. 1, 739-745
Curso Posgrado 2012
ESTABILIDAD TÉRMICA DE DIFERENTES DERIVADOS SEPABEADS
EPÓXIDO HETEROFUNCIONALES DE -GALACTOSIDASA DE Thermus sp. T2
Soluble
Boronato-Epóxido
M+2-Epóxido
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60
Act
ivid
ad, (
%)
Tiempo (horas)
NH2-Epóxido
Hidrófobico - Epóxido
pH 6,5; 70ºC
Biotechnol. Progr. 2004. 20, 388 – 392.
Curso Posgrado 2012
OPTIMIZACIÓN DE LOS SOPORTES HETEROFUNCIONALES
Suficientes grupos nuevos para favorecer la adsorción y muchos grupos epóxido fácilmente
accesibles para favorecer la inmovilización covalente.
O
O
O
O
O
O
O
O
O
+
O
+
+
+ +
+ +
+
+
+
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 20 40 60 80 100
% EPOXIDOS MODIFICADOS
AD
SO
RC
ION
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
INM
OV
ILIZ
AC
ION
CO
VA
LE
NT
E
Curso Posgrado 2012
Máxima densidad de grupos amino Máxima densidad de epóxidos
Nuevo soporte comercial Resindion
Biomacromolecules. 2003. 4, 772-777.
Patente aplicada industrialmente por la empresa Resindion S.R.L. (200300428)
O
NH2
+
O
NH2
+
O
NH2
+
O
NH2
+
-
-
NH2
NH2
-
-
NH2
NH2
HO
NH2
+
HO
NH2
+
Incubación a pH 10
pH 7 pH 7
TERCERA GENERACIÓN DE SOPORTES EPÓXIDOS
Curso Posgrado 2012
UNA MISMA ENZIMA POR DIFERENTES REGIONES
+ + +
+
- - - -
+ + +
+
- - - -
+ + +
+
- - - -
BOLSILLO HODROFÓBICO
ZONA RICA EN HISTIDINAS
Curso Posgrado 2012
CUARTA GENERACIÓN DE SOPORTES EPÓXIDO:INTERCAMBIADORES TIOL-DISULFURO
La mayoría de las proteínas no tienen cisteínas superficiales Podemos introducir cisteína en la región más conveniente Inmovilización dirigida de la enzima Posibilidad de rigidificación dirigida
Grupos reactivos
Biotechnol Bioeng. 2005, 90, 597-605
O
O
S S R SH
O
O
S S
pH 7
Incubación a pH 10
Curso Posgrado 2012
Amplia gama de soportes Epoxido heterofuncionales
Derivados con muy alta actividad y estabilidad
Rigidificación de diferentes regiones de la superficie de enzimas industriales
Curso Posgrado 2012
SOPORTES GLIOXIL HETEROFUNCIONALES
NaOH
NaIO4
Curso Posgrado 2012
NH3+
NH3+
NH3+
NH2 ¨
NH2 ¨
NH3+
NH3+
NH3+
NH2 ¨
NH3+
NH3+
NH3+
pH 7.0
Adsorción física
Incubación a pH 10
Inmovilización covalente multipuntual muy intensa Inmovilización covalente
intramolecular suave
Incubación a pH 7
INMOVILIZACIÓN EN TRES PASOS
Curso Posgrado 2012
BTL2 inmovilizada en aminos sin groups glioxil (■); BTL2 inmovilizada en soportes amino-glyoxyl a pH 8 durante 12 h (▲); BTL2 inmovilizada en amino-glioxil a pH 8 e incubada durante 3 horas a pH 10 (♦).
Curso Posgrado 2012
Support ( pH of immobilization)
Immobilized BTL (%) (A)
Recovered Activity after
adsorption (%) (B)
Recovered Activity after incubation of adsorbed enzyme at
pH 10 (%) (B)
Chelate-glyoxyl (pH 7.0)
94 21 11
Amino-glyoxyl (pH 7.0)
100 90 90
Monofunctional glyoxyl (pH 10.0)
100 60 60
Boronate-glyoxyl (pH 7.0)
95 71 67
Table 3: Immobilization of BTL on different glyoxyl supports.
A.- percentage of soluble enzyme incorporated to the activated support. B - percentage of activity regarding to the soluble enzyme that has been incorporated to the activated support
Curso Posgrado 2012
SOPORTE ACTIVADO CONDICIONES EXPERIMENTALES ORIENTACIÓN DE LA ENZIMA
Glioxil monofuncional pH 10 Región más rica en lisinas
Glioxil monofuncional
pH 8 Región con más de un amino terminal
Glioxil monofuncional
pH 8 + compuestos tiolados (DTT) Región del amino terminal
Ionizado amino-glioxil pH 7 + baja fuerza iónica Región con mayor carga negativa neta
Ionizado carboxi-glioxil pH 7 + baja fuerza iónica Región con mayor carga neta positiva
Metal quelato-glioxil pH 7; 200mM NaCl Región más rica en histidinas
Grupo hidrofóbico-glioxil pH 7; alta fuerza iónica Región más rica en residuos hidrofóbicos
Baja densidad de grupos capaces de adsorber y alta densidad de grupos glioxil
pH 7; baja fuerza iónica Región que expone la mayor superficie
Curso Posgrado 2012
Activation of agarose gels with epiclorhydrine : glyceril-epoxy supports
Modification of epoxy groups with ligands bearing nucleophiles
Oxidation of glyceryl groups with periodate: glyoxil groups
Adsorption of enzymes at pH 7.0 ( through different regions) on different immobilized ligands
Long-term incubation at pH 7.0: mild intramolecular covalent immobilization with glyoxyl groups
Long-term incubation at pH 10: intense intramolecular multipoint covalent attachment
Mild borohydride reduction to stabilize amine-glyoxyl attachments
PROTOCOLO DE ACTIVACIÓN-INMOVILIZACIÓN
Curso Posgrado 2012
DERIVADOS SIN SOPORTE
Todo el sólido es proteína
No hay gasto de soporte
Estabilización operacional
Rigidificación ?
Microambiente ?
Curso Posgrado 2012
POSIBILIDADES
CLECs Enzimas puras y cristalinas Necesidad de enzima pura Estabilizacion de proteinas multimericas
CLEAs Enzimas con trazas de impurezas Coagregacion de enzimas Agregacion de enzima y polimero Estabilizacion de enzimas multimericas
Crosslinked Enzyme Crystals Crosslinked Enzyme Aggregates
Curso Posgrado 2012
CLECs (Cross Linked Enzyme Crystals)
Ventajas: - Alta actividad catalítica - Posibilidad de estabilización de estructuras multiméricas Inconvenientes: - Necesidad de enzimas puras y cristalizables - Necesidad de procesos sencillos de cristalización
Entrecruzante
Curso Posgrado 2012
CLEAs
PREPARACIÓN DE CLEAs
Agente entrecruzante
precipitante PEG
sales, disolventes
Curso Posgrado 2012
Alta actividad volumétrica
Co-agregación enzimas-polímeros Estabilización
CLEAs
Co-agregación de enzimas
No necesario soporte
Curso Posgrado 2012
CLEA: Disociación de subunidades no es posible
Inmovilización convencional de enzimas: Disociación de subunidades es posible
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7
Clea1/10
Clea1/100
soluble1/10
soluble1/200
Effect of dilution on the thermal stability of CLEA from M. lysodeiktycus catalase
Tiempo (h)
Act
ividad r
esidua
l (%
)
Las condiciones experimentales fueron: 60ºC , pH 7, 10000 IU/ml
Curso Posgrado 2012
AGREGADOS DE ENZIMAS Y POLÍMEROS:
CLEAS CON MICROAMBIENTES
Entrecruzamiento Agregación
Estabilización frente a disolventes • Estabilización frente a oxígeno
Biocatal. Biotransfor. 19, 489-503
Curso Posgrado 2012
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350
e/eo
Time(hours)
Cinética de inactivación de CLEAs, a 4 ºC en 75 % (v/v) dioxano en 100 mM de tampón fosfato a pH 7.0.
PENICILLIN G ACYLASE
Curso Posgrado 2012
+
LENTIKATS
Usado normalmente con células Enzima soluble escapa
Curso Posgrado 2012
CLEA CLEA LentiKatsTM Enzima soluble
PVA CLEA G
PRECIPITACIÓN ENCAPSULACIÓN
Enzima precipitada
ENTRECRUZAMIENTO
REPRESENTACION DE LA PRODUCCIÓN DE LENTIKATS® A PARTIR DE CLEA. Curso Posgrado 2012
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 100 200 300 400
e/e
o
Time(hours)
INACTIVACIÓN POR CODISOLVENTE. Experimento hecho a 4 ºC en 75 % (v/v) dioxano y 25 % (v/v) 100 mM de tampón fosfato a pH 7.0.
Curso Posgrado 2012
ESTABILIZACIÓN DE NITRILASA USANDO
MICROAMBIENTES EN ATMÓSFERA DE OXÍGENO
0
25
50
75
100
0 20 40Tiempo, (h)
Act
ivid
ad, %
J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 2006, 38, 154-57.
OH
CN
OH
COOHNitrilasa
Curso Posgrado 2012
DESARROLLO DE CLEAs
Permite obtener catalizadores muy activos Estabilización de enzimas: (multiméricas, disolventes, O2, etc) Coagregación de varias enzimas Coagregación de enzimas y polímeros
Curso Posgrado 2012