Procedimientos de Procedimientos de Biología Molecular para el Biología Molecular para el estudio de la infección por estudio de la infección por

el VIHel VIH

Mariam Cortés TormoR3 Análisis clínicos

Hospital Virgen de los LiriosAlcoy

Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH)

Pasos en la infección del VIH

Métodos de detección VIHLos métodos indirectos permiten la detección de anticuerpos específicos anti-VIH siendo la forma habitual de diagnosticar una infección por VIH y se dividen en: Pruebas de screening

Inmunoenzimáticas (EIA)

Pruebas confirmatorias Western Bloot (WB) ≈ Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) Radioinmunoprecipitación (RIPA)

Los métodos directos detectan el virus o alguno de sus componentes: Cultivo vírico Determinación p24 en suero o plasma Técnicas de biología molecular

Métodos de detección indirectosVIH

Pruebas de screening (EIA)

HIV Ag/Ab Combo (ARCHITECT)

HIV combi (MODULAR E-170)

Pruebas confirmatorias ≈ Western Bloot

INNO-LIA HIV I/II Score (INNOGENETICS)

Métodos de detección indirectosVIH

Pruebas de screening (EIA) HIV Ag/Ab Combo (ARCHITECT)

Inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes

No distingue entre VIH-1/ VIH-2

rAg VIH-1/VIH-2mAc p24

SUERO:Ac VIH-1/VIH-2Ag p24

Ac antiAc VIH1/VIH2*mAc p24*

*DIMETIL ACRIDINIO (DMAE)

H₂O₂Sol. Alcalina

Señal directamente proporcional a:Ac VIH-1/VIH-2Ag p24en SUERO

Métodos de detección indirectosVIH

Pruebas de screening (EIA) HIV combi (MODULAR E-170)

Electroquimioluminiscencia en sandwich

No distingue entre VIH-1/ VIH-2

MUESTRA

Ag p24

mAc p24- biotina

mAc p24- rutenio

Micropartículas- estreptavidina

Métodos de detección VIH

Prueba confirmatoria (EIA) INNO-LIA HIV I/II Score (INNOGENETICS)

Tiras de nylon cubiertas con Ag:

sgp120gp41p31p24p17sgp105gp36

VIH-1

VIH-1/ VIH2

VIH-2

En las cubetas de plástico:• Tiras nylon• 1mL Diluyente• 10 µL Muestra• Incubar 16 ± 2h RT• Lavar con Solución Lavado• 1mL Conjugado (30min RT)• Lavar con Solución Lavado• 1mL Sustrato (30 min RT)• 1mL Solución Parada• Secado • Lectura

Métodos de detección directos VIHTécnicas de Biología molecular• Han permitido:

• Observar que el VIH se produce durante todas las fases de la infección

• Nivel de producción relacionado con la progresión de la enfermedad

• Se emplean en:• Diagnóstico cuando el test serológico ha sido equívoco• Sospecha transmisión materno-filial• Estudios variación genómica• Monitorización terapia antirretroviral

• Técnicas empleadas:• PCR altamente sensible• Prueba del DNA ramificado (bDNA)• Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA)

Métodos de detección directos VIH

RT-PCRControl interno de cuantificación: se resuelven los problemas quese han podido dar en las etapas de aislamiento y amplificación.

Detección quimioluminiscencia/fluorescencia

• Microplaca• Pocillos con diluciones seriadas

del producto de reacción• Hibridación• Lectura placa a una λ determinada• Resultados basados en el control

interno

Métodos de detección directos VIH

bDNA Amplificación de una señal que se liga al RNA viral

Ultracentrifugación

Determinación de la carga viral en función de la lectura de la placa muestra y los pocillos control

Métodos de detección directos VIH

NASBAEtapas:

• Extracción y purificación: unión ácidos nucleicos a partículas de sílice o cristal en presencia de tiocianato de guanidinio (lisa y evita la actuación RNAsas y DNAsas)

• Amplificación

T7: promotor de RNApol

Se añaden calibradores internos junto con la muestra (QA/QB/QC en C% relativa de 100/10/1)

Métodos de detección directos VIH

NASBAEtapas:

• Cuantificación:Requiere adición de estándares internos. Métodos:

• Introducción lugar único de restricción en la molécula estándar: • Ventaja: diferencia blanco de estándar por digestión enzimática y no altera eficiencia amplificación

• Inconveniente: amplificación excesiva genera heteroduplex que impiden acción de enz. restricción y sobreestima el pico inicial

• Introducción inserción o deleción en molécula estándar:• Ventaja: buena diferenciación entre blanco y estándar

• Inconveniente: alteración eficiencia amplificación

• Reemplazamiento de una parte del estándar por un tramo único de nucleótidos complementarios a la sonda específica del estándar:

• Ventaja: amplificación no competitiva al presentar distintas regiones de intervención y por lo tanto se evita la hibridación entre las dos cadenas

• Detección:Electroquimioluminiscencia

Métodos de detección directos VIH

Principales diferencias entre las técnicas - Instrumentación

- bADN sólo necesita un lector de placas- RT-PCR, además de un lector de placas emplea un termociclador especial- NASBA se vale de un instrumento semiautomático de detección por electroquimioluminiscencia

Tanto la prueba del bADN como la del NASBA incluyen un programa informático específico

- Volúmenes de muestra necesarios- RT-PCR 200 μL - NASBA 100 μL - bADN 1 mL por duplicado. La disponibilidad de muestra limitaba muchas veces la práctica de esta técnica

- En todos los casos se recomiendan muestras de plasma, aunque el NASBA se puede realizar directamente a partir de suero, sangre total, líquido cefalorraquídeo, semen y orina. La prueba de RT-PCR no puede realizarse a partir de plasma heparinizado, ya que por sus características quelantes, la heparina inhibe la PCR

- El límite de detección- bADN 10.000 copias por mL.. Las pruebas de 2a y 3a generación del bADN pueden detectar hasta 500 y 25

copias por mL, respectivamente con una excelente reproducibilidad. - RT-PCR 200-400 copias de ARN por mL.. Una prueba de RT-PCR de 2a generación permite detectar hasta 20

copias de ARN por mL de plasma. - El NASBA 4.000 copias de ARN del VIH.

- Obtención de resultados- 24 horas para RT-PCR y NASBA- 48 horas para el bADN.

- Rendimiento, se procesan 42 muestras con la técnica del bADN, 22 con la prueba de RT-PCR y 10 con la del NASBA.

Métodos de detección directos VIH

Principales aplicaciones de la Biología Molecular• Estudio de la dinámica viral• Carga viral y monitorización de la terapia

Nuevas técnicas de optimización terapéutica • Tipación de HLA-B5701: Hipersensibilidad a Abacavir en presencia

del alelo• Ensayos de tropismo CCR5/CXCR4 y sensibilidad a Maraviroc

Métodos de detección VIH(procedimiento en nuestro laboratorio)

SUERO/PLASMA

NEGATIVO POSITIVO VIHTA

POSITIVO

NEGATIVO POSITIVO

NEGATIVOEMBARAZO

MUCHASGRACIAS