PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI

ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA

U ČOVJEKA

Pristupnica: Danijela Kalibović Govorko, dr.med.dent.

Mentorica: prof.dr.sc. Mirna Saraga-Babić, dr.med.

Zavod za anatomiju, histologiju i embriologiju, Sveučilište u Splitu, Medicinski fakultet, Studij dentalne medicine

Split, 25. ožujka, 2011.g.

SADRŽAJ PREZENTACIJE

uvod problematika i cilj istraživanja materijali i metode rezultati zaključci

UVOD

PREUZETO IZ:Thesleff I, Nieminen P. Tooth morphogenesis and cell differentiation. Curr Opin Cell Biol, 1996. 8(6): p. 844-50.

Ektoderm prvog

ždrijelnog luka

Zubna osnova

Ektomezenhim neuralnog

grebena

Caklinski organ

Zubna papila

Zubni vrećica (folikul)

Vratna petlja

Vanjski caklinski

epitel

Caklinska mrežica

Intermedijarni (središnji)

slojUnutrašnji caklinski

epitelCaklinski

čvorić

Hertwig-ova korjenska ovojnica

Oblik korijena

Ameloblasti Caklina

Reducirani zubni epitel

Osteoblasti

Fibroblasti

Cementoblasti

Cement

Parodontni ligament

Alveolarna kost

Odontoblasti

Nediferencirane

mezenhimne stanice

Fibroblasti

Dentin

Pulpa

Primarni epitelni

pričvrstak

Uzorak krune

PORIJEKLO DIJELOVI ZUBNEOSNOVE

STANICE ZUBNE OSNOVE

PROIZVODI

CAKLINSKI ČVORIĆ

Nakupina stanica u sredini unutarnjeg caklinskog epitela

Proizvodi niz signalnih molekula (FGF, BMP, Shh, Wnt) koje utječu na rast epitela i ektomezenhima, oblikovanje zuba, prostorni raspored, broj i oblik kvržica

Primarni caklinski čvorić nastaje na vršku zubnog pupoljka, a odstranjuje se apoptozom

Sekundarni caklinski čvorići nastaju na vrhovima budućih kvržica molara te reguliraju njihov položaj i oblik

Caklinski čvorić

PREUZETO IZ:Koyama, E., et al., Polarizing activity, Sonic hedgehog, and tooth development in embryonic and postnatal mouse. Dev Dyn, 1996. 206(1): p. 59-72.Vaahtokari, A., et al., The enamel knot as a signaling center in the developing mouse tooth. Mech Dev, 1996. 54(1): p. 39-43.

PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA

Nedostatak istraživanja o ranim stadijima razvoja zuba u čovjeka

Istraživanja na pokusnim životinjama pokazala su značajne razlike u prostorno-vremenskom izražaju proliferacijskih, pro-apoptotskih i anti-apoptotskih čimbenika tijekom razvoja zuba

PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA

Poremećaji proliferacije, apoptoze i diferencijacije tijekom razvoja zuba i čeljusti dovode do pojave raznih patoloških promjena (često u sklopu sindroma):

› Anomalije oblika, broja, veličine, građe, vremena nicanja i položaja zuba u čeljusti

› Razvojnih cista i tumora

CILJEVI ISTRAŽIVANJA

PROLIFERACIJSKI

ČIMBENICI

PRO-APOPTOTSKIČIMBENICI

ANTI-APOPTOTSKIČIMBENICI

ČIMBENICIDIFERENCIJACIJACI

JE

Ki-67 Bcl-2

Bax

Sindekan-1

Hsp70

Kaspaza-3

p53

CILJEVI ISTRAŽIVANJA

Istražiti pojavu, raspodjelu i promjenu proliferacijske aktivnosti stanica primjenom Ki-67 biljega tijekom različitih stadija ranog razvoja zuba

Istražiti prisustvo, prostorni i vremenski slijed pojavljivanja pro-apoptotskih čimbenika kaspaze-3 i p53 u različitim dijelovima zuba tijekom razvoja

CILJEVI ISTRAŽIVANJA

Utvrditi prostorni i vremenski slijed pojavljivanja anti-apoptotske bjelančevine Bcl-2, sindekana-1 i Hsp70 kao mogućih poticatelja proliferacije i diferencijacije

Dvostrukim bojenjem dokazati moguću istovremenu prisutnost različitih čimbenika u istoj stanici: › Bax i Bcl-2› Ki-67 i Bcl-2› Ki-67 i sindekan-1› sindekana-1 i Hsp70

METODE ISTRAŽIVANJA

Sakupljanje tkiva i određivanje starosti zametaka

› Tkivo normalnih ljudski zametaka starosti 5-12 tjedana (iz postojeće arhivske zbirke Zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju te tkivo sakupljeno u Kliničkom zavodu za patologiju, sudsku medicinu i citologiju KBC Split, a uz suglasnost Etičkog povjerenstva za biomedicinska istraživanja MF u Splitu)

› Kriteriji očuvanosti tkiva: bez vanjskih znakova maceracije, promjene boje i anomalija

› Određivanje starosti: na temelju podataka o ovulacijskoj dobi, mjerenjem (CRL) te uspoređivanjem sa stadijima Carnegie instituta

METODE ISTRAŽIVANJA

Vođenje, uklapanje i rezanje tkiva:

› Mikrosekcija (odvajanje tkiva koje sadrži zubne zametke)

› Fiksacija u 4% formaldehidu, ispiranje u PBS-u, dehidracija, ksilol, uklapanje u parafinu

› Rezanje na sagitalne, frontalne ili transverzalne rezove debljine 5-7 µm

› Lijepljenje na predmetna stakla, orijentacijsko bojenje svakog desetog stakla H&E (razina reza, očuvanost tkiva)

METODE ISTRAŽIVANJA

Imunohistokemijsko bojenje rezova

› Primarna protutijela: Ki-67 Bax Bcl-2 p53 kaspaza-3 sindekan-1 Hsp70

› Sekundarna detekcija primarnih protutijela: Bojanje DAB-om Imunofluorescencija (TRITC i FITC)

METODE ISTRAŽIVANJA

Kvantifikacija Ki-67 pozitivnih stanica i statistički postupci:

› Brojenje pozitivnih stanica (smeđe obojenje stanice DAB-om) i računanje njihovog udjela u ukupnom broju stanica

› Određivanje moguće statistički značajne razlike u postotku pozitivnih stanica: Među razvojnim tjednima Među različitim dijelovima zuba

› Mann-Whitney test: neparametrijski test za dva nezavisna uzorka (dolaze li dva nezavisna uzorka iz iste distribucije)

› Kruskal-Wallis i Dunnov posthoc test: neparametrijski, proširenje MW testa za tri i više grupa

› Razina značajnosti je 0.05

METODE ISTRAŽIVANJA

Semi-kvantifikacija:› određivanja intenziteta obojenja i prostorne raspodjele

stanica pozitivnih na: jezgrine biljege p53 i kaspazu-3 (zanemariv broj pozitivnih

stanica koje se javljaju samo mjestimično) citoplazmatske biljege Bcl-2, Bax, sindekan-1 i Hsp70

(problem razlučivanja citoplazmi pozitivnih stanica)

Kolokalizacija: › određivanje prisustva dvaju čimbenika u istoj stanici

primjenom dvostruke imunofluorescencije te određivanje stanica koje pokazuju dvostruki izražaj

REZULTATI

Imunohistokemijsko bojenje DAB-om › Ki-67› Bcl-2› kaspaza-3› p53› sindekan-1› Hsp70

Imunofluorescentno bojenje (dvostruko bojenje) › Bax i Bcl-2 › Ki-67 i Bcl-2 › Ki-67 i sindekan-1› sindekan-1 i Hsp70

REZULTATIMORFOLOŠKE OSOBITOSTI RAZVOJA LJUDSKOG ZUBA IZMEĐU 5. I 12. TJEDNA RAZVOJA

6. tj. 8. tj.

9. tj. 10. tj.

12. tj.

Postotak Ki-67+ stanica u zubnom grebenu i zubnom zametku (DC) te okolnom ektomezenhimu (M)• u 6.-7. tj. DC 39%, M 37% • u 8. tj. DC 41%, M 28%• u 8.-9. tj. DC 35%, M 24%• u 10. tj. DC 14%, M 25%• od 8.-10. tj. postoji statistički značajna razlika u % Ki-

67+ stanica između DC i M (Mann-Whitney, P<0.0001)

Postotak Ki-67+ stanica u različitim epitelnim dijelovima zubnog zametka u 10. tjednu razvoja• IEE 37%• OEE 39%• ER 33%• DC 10% • postoji statistički značajna razlika u %Ki-67+ stanica

između IEE i DC i OEE i DC (Kruskal-Wallis, Dunn-ov posthoc test, P<0.001)

Postotak Ki-67+ stanica u ektomezenhimu zubnog zametka (M1) i ektomezenhimu čeljusti (M2)• u 6.-7. tj. M1 50%, M2 34% • u 10. tj. M1 28%, M2 27%• u 6.-7. tj. postoji statistički značajna razlika

u % Ki-67+ stanica između M1 i M2 (Mann-Whitney, P<0.05)

Postotak Ki-67+ stanica u područjima između zubnih zametaka: zubni greben (DC), ektomezenhim oko DC (M1) i ektomezenhim čeljusti (M2)• DC 35%• M1 23%• M2 15%• postoji statistički značajna razlika u %Ki-67+ stanica

između DC i M1 te DC i M2 (Kruskal-Wallis, Dunn-ov posthoc test, P<0.001)

Kaspaza-3

P53

6.-7. tj. 7.-8. tj. 9.-10. tj. 11.-12. tj.

Izražaj kaspaze-3 i p53 bjelančevine u zametku ljudskog zuba između 6.-12. tj.

Izražaj Bcl-2 bjelančevine u zubnom zametku između 6. i 10. tj.

6. tj. 8. tj.

10. tj.8. tj.

Izražaj sindekana-1 u zametku zuba između 6. i 12. tjedna razvoja

6.-7. tj. 7.-8. tj.

9.-10. tj. 11.-12. tj.

Izražaj Hsp70 u zametku ljudskog zuba između 6. i 12. tjedna razvoja

6.-7. tj. 7.-8. tj.

9.-10. tj. 11.-12. tj.

Bcl-2

Ki-67

merge

merge

BaxBcl-2

Dvostruko imunofluorescentno bojenje Bcl-2 i Ki-67 (7. tj.) te Bcl-2 i Bax (9. tj.) biljezima

Ki-67

Ki-67

merge

merge

sindekan-1

sindekan-1

Dvostruko imunofluorescentno bojenje biljezima Ki-67 i sindekan-1(7. i 9. tj.)

Dvostruko imunofluorescentno bojenje biljezima Hsp70 i sindekan-1

Hsp70 sindekan-1 merge

7. tj.

10. tj.

12. tj.

Syndecan-1/Hsp70 merge

ZAKLJUČCI

PROLIFERACIJSKA AKTIVNOST STANICA ZUBNOG ZAMETKA (Ki-67)

Intenzivna proliferacijska aktivnost u zubnom zametku rasla je od 6. do 8. razvojnog tjedna, a zatim značajno pala u 10. tj. razvoja. Takav uzorak proliferacijske aktivnosti stanica mogao bi biti povezan s rastom i ranim oblikovanjem osnove ljudskog zuba od stadija pupoljka, preko stadija kape do ranog stadija zvona

Od 9. tjedna nadalje, u području caklinskog čvorića nije nađena proliferacijske aktivnosti, što bi moglo ukazivati na početnu diferencijaciju specifičnih dijelova caklinskog organa u smjeru odontoblasta i ameloblasta

ZAKLJUČCI

U 10. tjednu razvoja, stanice zubnog grebena imale su značajno nižu proliferacijsku aktivnost od one u ranijim razvojnim stadijima, što bi se moglo povezati s postupnim nestajanja zubnog grebena

Postotak proliferirajućih stanica bio je veći u dijelovima ektomezenhima koji se uključuje u buduću osnovu zuba od dijelova ektomezenhimu buduće čeljusti

ZAKLJUČCI

ANTI-APOPTOTSKA I APOPTOTSKA AKTIVNOST U STANICAMA ZUBNOG ZAMETKA

Bcl-2 Izražaj anti-apoptotske Bcl-2 bjelančevine bio je jači u

stanicama koje proliferiraju tj. u Ki-67 pozitivnim stanicama, što ukazuje na ulogu Bcl-2 u poticanju proliferacije i preživljenju stanica

Izražaj Bcl-2 bjelančevine prevladavao je u dijelovima zubnog zametka (unutrašnji caklinski epitel, caklinski čvorić) od kojih će nastati specifični dijelovi zrelog zuba, potičući njihovu diferencijaciju

ZAKLJUČCI

Vrlo slab izražaj Bcl-2 bjelančevine u ektomezenhimu zuba podudarao se s nižom proliferacijskom aktivnošću u istom području, što je sukladno s kasnijom diferencijacijom ektomezenhimskih od epitelnih dijelova zubne osnove

ZAKLJUČCI

Bax

Izražaj apoptotske Bax bjelančevine prevladavao je u stanicama zubne osnove čija je sudbina da tijekom razvoja nestanu procesom stanične smrti (vanjski caklinski epitel, caklinska pulpa)

Iste stanice zubnog zametka pokazivale su istovremenu prisutnost i pro-apoptotskog Bax i anti-apoptotskog Bcl-2 čimbenika, a razlika u njihovom prostorno-vremenskom izražaju ovisila o razvojnoj sudbini stanice

Ravnoteža navedenih razvojnih čimbenika važna je za normalno oblikovanje zuba

ZAKLJUČCI

Kaspaza-3

Raspodjela kaspaza-3 pozitivnih stanica u epitelnoj osnovi zuba (u području caklinskog čvorića i caklinske pulpe) ukazuje na ulogu stanične smrti u nestanku primarnog caklinskog čvorića i caklinske pulpe kao preduvjeta normalnog oblikovanja zuba

Prisustvo kaspaza-3 pozitivnih stanica u ektomezenhimu zuba i čeljusti, govori u prilog sudjelovanju ovog razvojnog čimbenika u oblikovanju ektomezenhimskih dijelova zuba, odnosno procesu okoštavanja čeljusti

ZAKLJUČCI

P53

Raspodjela p53 pozitivnih stanica u ektomezenhimu zuba ukazuje na njegovu ulogu u oblikovanju korijena, odnosno u diferencijaciji zubne vrećice u cementoblaste i fibroblaste

Prisustvo p53 pozitivnih stanice u blizini primarnog caklinskog čvorića, govori u prilog sudjelovanja ovog čimbenika u nestanku čvorića, tj. kontroli stanične proliferacije bez koje nema normalnog oblikovanju zuba

ZAKLJUČCI

DIFERENCIJACIJA STANICA ZUBNOG ZAMETKA

Hsp70

Jaki izražaj Hsp70 bjelančevine u epitelnoj osnovi zuba od 6.- 10. tjedna razvoja u skladu je s intenzivnom proliferacijskom aktivnošću u tom području

Jaki izražaj Hsp70 u područje caklinskog čvorića, u kojem se intenzivno sintetiziraju razne signalne molekule, ukazuje na njegovu ulogu u regulaciji stanične homeostaze i zaštiti stanice od apoptoze

ZAKLJUČCI

Slabiji izražaj Hsp70 u ektomezenhimu zuba poklapao se s nižom proliferacijskom aktivnošću u istom području, što potvrđuje kasniju diferencijaciju ektomezenhimskih dijelova zuba u odnosu na njegove epitelne dijelove

ZAKLJUČCI

Sindekan-1

Istovremena prisutnost izražaja sindekana-1 i proliferacijskog biljega Ki-67 u stanicama zubnog pupoljka, podudara se s njegovom ulogom u poticanju stanične proliferacije i rasta zubnog zametka

Izražaj sindekana-1 bio je najintenzivniji u području epitelno-mezenhimskih interakcija i pojačavao se s napredovanjem razvoja zuba, što govori u prilog njegovoj ulozi u staničnoj diferencijaciji

HVALA NA PAŽNJI

Hvala djelatnicima Zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju Studija medicina i dentalna medicina Medicinskog fakulteta Sveučilišta u

Splitu