prezentacja programu powerpoint · migracja cząstek obdarzonych ładunkiem pod wpływem...

Elekrtoforeza kapilarna

Katedra i Zakład Biologii Molekularnej i KomórkowejPrzygotowała dr Agnieszka ChwiłkowskaSeminarium z biologii molekularnej II r. Analityki medycznej

Migracja cząstek obdarzonych ładunkiem pod wpływem przyłożonego pola elektrycznegoCząsteczki naładowane ładunkiem poddane analizie elektroforetycznej będziemy nazywać również analitem.

Rys. zmieniony po Marcin Moczulski | Sr Field Applications Specialist, SCIEX CE & BioPharma EMEA

anoda katoda

Zasada działania elektroforezy

DetektorWlot kapilary Wylot

kapilary

Stanowisko pracy

Źródło wysokiego napięcia – 0-30kV

elektrodaelektroda

Zbiornik wlotowy

Zbiornik wylotowy

elektrolit


Schemat elektroforezy kapilarnej

poliimidowawarstwa ochronna

(15 µm)

kapilara ze stopionej krzemionki

Budowa kapilary

Otwór kapilary

Najczęściej stosowane są kapilary ze stopionej krzemionki, pokryte poliimidową warstwą ochronną, o średnicy wewnętrznej 20-200 µm (375 µm średnica zewnętrzna) i długości od 20 do 100 cm.

Przykładowe systemy do elektroforezy kapilarnej

C100HT Biologics Analyzer

PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System

GenomeLab GeXP Genetic Analysis System

• Wysokowydajne narzędzie analityczne:dokładność, powtarzalność, analiza ilościowa• duża wydajność analityczna - maksymalna wydajność przekraczająca 1 000 000 płytek teoretycznych• nanolitrowa objętość wstrzyknięcia• „Green technology” - minimalne wymagania dotyczące odczynników, niska produkcja odpadów• Elastyczność separacji poprzez wybór kapilar i buforów• Podstawą rozdział jest różnicująca migracja naładowanych cząsteczek w pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego• Szeroka gama dostępnych detektorów• bogaty asortyment gotowych aplikacji• Otwarty układ

Zalety elektroforezy kapilarnej

Podstawą rozdziału elektroforetycznego jest różnica prędkości migracji naładowanych cząsteczek w stałym polu elektrycznym

E = natężenie pola elektrycznegoV = różnica napięć [V]Lt = całkowita długość kapilary [cm]

vep = szybkość ruchliwości cząsteczki Ld = długość kapilary do detektora – długość efektywna [cm]tm = czas migracji [s]

µep = ruchliwość elektroforetycznalub

Pole elektryczne i prędkość elektroforezy

Prędkość cząstki jest równoważona siłą oporu.

Siły działające na naładowane cząsteczki poruszające się w polu elektrycznym

KatodaAnoda

siła oporu lepkości siła oporu lepkości

siła elektryczna F = (+Q)*E siła elektryczna F = (-Q)*E

pole elektryczne

Siła elektryczna vs. siła lepkości


Równowaga siły elektrycznej i siły lepkości

ruchliwość elektroforetyczna µe - niezależna od pola elektrycznego

E = natężenie pola elektrycznego [v∙cm-1]η = lepkość ośrodka [Pa∙s]q = ładunek analitu [C]r = promień Stokesa tego analitu [pm]ve = szybkość migracji analitu [m∙s-1]

FE = siła elektryczna → napędFF = siła lepkości → tarcie

=>

Siła elektryczna vs. siła lepkości

Podstawowy parametr rządzący elektroforezą kapilarną!

✓ wielkością charakterystyczna dla danego analitu✓ Zależy od stosunku ładunku / masy analitu✓ Ładunek analitu związany z pH buforu!

Dobierając odpowiednio skład chemiczny elektrolitu podstawowego możliwe jest kontrolowanie selektywności rozdzielania składników próbki poprzez zmianę ruchliwości poszczególnych analitów. Przykładowo, wzrost stężeniai siły jonowej buforu powoduje zmniejszenie ruchliwości analitów, a dodatek rozpuszczalników organicznych zmienia lepkość roztworu.

Ruchliwość elektroforetyczna µep

Przepływ elektroosmotyczny (Electroosmotic Flow, EOF) - jonizacja kapilary

Struktura stopionej krzemionki

W elektroforezie kapilarnej stosuje się kapilary ze stopionej krzemionki (ang. fused silica), która zawiera grupy silanowe zmostkowane tlenem (Si-O –Si). Mogą one hydrolizować w konsekwencji zetknięcia się wewnętrznych ścianek kapilary z roztworem elektrolitu o pH>4 i następuje jonizacja grup silanolowych (–Si-OH).


Dodatnio naładowane cząstki z elektrolitu podstawowego gromadzą się więc w pobliżu tworząc podwójna warstwę elektryczną o potencjale elektrokinetycznym ξ. Składa się ona z części bezpośrednio przylegającej do powierzchni kapilary - warstwy przylegającej oraz z warstwy dyfuzyjnej, rozciągającej się w głąb roztworu o nadmiarowym ładunku dodatnim.Gdy taki układ umieszczony zostanie w polu elektrycznym o natężeniu E, hydratowane kationy z warstwy dyfuzyjnej poruszać się będą w kierunku katody, powodując obserwowalny makroskopowo przepływ cieczy w kapilarze. Czyli obecność elektrycznych podwójnych warstw na granicy faz roztwór / ściana kapilarna jest przyczyną przepływu elektroosmotycznego, a kationy warstwy dyfuzyjnej, które są przyciągane przez katodę ujemną i w efekcie są solwatowane przez cząsteczki rozpuszczalnika „chwytają” i poruszają z całą masą roztworu (elektrolitu) zawartego w kapilarach tworząc efekt elektroosmotyczny.

Przepływ elektroosmotyczny (Electroosmotic Flow, EOF) - jonizacja kapilary

Jonizacja grup silanolowych wytwarza ładunek ujemny ściany

Formowanie podwójnej warstwy elektrycznej

warstwa przylegająca

Przestrzeń podziału

warstwa dyfuzyjna (mobilna)

Zmienność przepływu elektroosmotycznego

µeof = ruchliwość elektroosmotyczna

ε= stała dielektryczna (buforu) - współczynnik przenikalnościη = stała lepkości (buforu)ζ = elektrokinetyczny potencjał zeta

veof = szybkość elektroosmotyczna

E = natężenie pola elektrycznego

Tam, gdzie kapilara ma naładowaną powierzchnię, przepływ elektroosmotyczny będzie zachodził w płynie polarnym wypełniającym kapilarę pod wpływem pola elektrycznego.

Ruchliwość pozorna

Czas migracji jest miarą ruchliwości pozornej

Przepływ elektroosmotyczny (EOF) wpływa na ruchliwość pozorną analitu:


Rozdział oparty na elektroforezie

Rozdział elektroforetyczny bez udziału przepływu elektroosmotycznego (EOF)


Rozdział oparty na elektroforezie i elektroosmozie

Rozdział elektroforetyczny z udziałem przepływu elektroosmotycznego (EOF)


Optymalizacja przepływu elektroosmotycznego (EOF)

Optymalizację przepływu elektroosmotycznego (EOF) przeprowadza się w celu osiągnięcia odpowiedniej rozdzielczości w jak najkrótszym czasie, natomiast stabilność EOF jest warunkiem koniecznym do uzyskania powtarzalnych wyników.

W celu optymalizacji warunków separacyjnych możliwe jest kontrolowanie przepływu elektroosmotycznego:

• Zwiększenie stężenia buforu/ siły jonowej wpływa na zmniejszenie potencjału ζ i ostatecznie zmniejsza EOF – (zmniejszenie ruchliwości jonów). Zbyt wysokie stężenie buforu powoduje wzrost wydzielanego ciepła Joule’a, a przez to zwiększenie dyfuzji.• Wraz ze wzrostem pH buforu wzrasta jonizacja grup silanolowych, a zatem i ujemnyładunek na ściankach kapilary (zwiększenie EOF).• Obecność rozpuszczalników organicznych (np. Acetonitrylu, metanolu) obniża lepkość buforu (zmniejszając EOF przez zmniejszenie stałej dielektrycznej).• EOF można zmniejszyć i / lub zmienić przez obecność kationowych środków powierzchniowo czynnych.• EOF można zmniejszyć i / lub usunąć poprzez dodanie modyfikatorów wewnętrznej ściany kapilary.• Temperatura zwiększa mobilność o ok. 2% na stopień.

Podstawowe zasady rozdziału w elektroforezie kapilarnej

▪ Podstawą rozdziału jest migracja różnicowa cząsteczek w przyłożonym polu elektrycznym.▪ Elektroforeza jest procesem dwukierunkowym, który obejmuje naładowane cząstki; poruszają się zarówno cząsteczki analitu, jak i składniki buforu.▪ Elektroforeza, NIE jest chromatografią!

▪ technika uzupełniająca w stosunku do LC,▪ czas migracji NIE jest czasem retencji!▪ mechanizm separacji jest inny, proces jest przeprowadzony w otwartej kapilarze.

▪ Użytkownik kontroluje środowisko w obrębie kapilary!

Parametry elektroforezy kapilarnej (CE)

Parametry CE

Analit(próbka)

ElektrolitPole

elektryczneKapilara

Rozmiar i kształtStężenie

Absorbancja/fluorescencja

Usieciowanie

Gaz w roztworze /drobiny

Interakcje próbka – kapilaraInterakcje między

składnikami próbki

Temperatura

pH

Siła jonowa

Lepkość

Stała dielektryczna

Zastosowane napięcie

Długość kapilary Powłoka

Wymiary

Ładunek powierzchniowy


Proces elektroforezy kapilarnej (CE)

• Przygotowanie aparatu• Przygotowanie próbki do analizy• Równoważenie / napełnianie naczyń włosowatych za pomocą elektrolitu • Wstrzyknięcie próbki• Przyłączenie napięcie• Proces rozdzielanie cząsteczek• Detekcja analitów• Oznaczanie i identyfikacja analitów• Czyszczenie / regeneracja naczyń włosowatych

Przygotowanie próbki do analizy

Większość próbek ma zbyt duże stężenie• Rozcieńczanie do optymalnego stężenia

- np. stężenie 20-100 ppm dla anionów, 20 ppm dla kationów• oznaczenie siły jonowej

- Siła jonowa Próbka / Elektrolit : 1/10• W razie potrzeby dodaj rozpuszczalniki organiczne (metanol, ACN)

- Ich Obecność w roztworze próbki nie powinna przekraczać 30%- Dodaj rozpuszczalnik organiczny do Elektrolitu

Oznaczyć pH próbki- skorygować pH, jeśli jest to konieczne; zwiększyć pH przez dodanie NaOH lub NH4OH, zmniejszyć za pomocą HCl,

Przesączyć lub odwirować i / lub odgazować próbkę, jeśli to konieczne

Stosowane detektory i techniki detekcji

Spektrofotometryczna detekcja• UV (pojedyncze długości fali i detektory diodowe (DAD - diode array detector)• fluorescencja (LIF and LEDIF)

Elektrochemiczna detekcja• konduktometrycznie• amperometrycznie

Spektrometria masowa

Czas

Ab

sorb

ancj

a

Potencjalny elektroferogram - zapis sygnału detektora w czasie.

A typical electropherogram demonstrating the order of elution of cations and anions. Adapted from J. Sáiz, I. J. Koenka, T. Duc Mai, P. C. Hauser, C. García-Ruiz, TrAC, 2014, 62. 162.

Detekcja pojedynczej fali

• Możliwość jednoznacznego określenia długości fali - Światło jest filtrowane przez filtr o paśmie 10 nm

• Wykrywa emisję analitu

• Energia światła jest mniejsza

• Ekonomiczne rozwiązanie

• Może być stosowany z powleczonymi (neutralnymi) naczyniami włosowatymi

Detekcja matrycy diod

• Charakterystyka pełnego zakresu widma

• Wiele elektroforogramów

• Znacznie lepsza elastyczność pomiaru

• Brak ograniczeń dotyczących długości fali

• Niezalecany dla naczyń włosowatych pokrytych LPA (zbyt duża energia lampy może zniszczyć strukturę polimerową

ściany naczyń włosowatych)

Spektrofotometryczna detekcja

Zalety LIF

• Duża czułość

• Specyficzność

• Testy immunologiczne o wysokiej czułości

Wady LIF

• Potrzebuje osobnych laserów dla każdej długości fali

• W tej chwili ograniczenie co do długości fal (według PMT)

•Zwykle wymagana jest derywatyzacja analitów (przeprowadzenie analitów w odpowiednie pochodne o właściwościach

umożliwiających ich oznaczenie)

Alternatywnie LEDIF

• Więcej ograniczeń związanych z dostępnością długości fali

Detekcja fluorescencji indukowanej laserem (LIF - laser-induced fluorescence)

Elektroferogram przy użyciu detektora fluorescencji. Źródło: Li Ma, Shuping Liang, Russell L. Jones, and Ying-Tang Lu, Characterization of a NovelCalcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase from Tobacco, Plant Physiol. 2004 Jul; 135(3): 1280–1293. doi: 10.1104/pp.104.041970

Elektroferogram z zastosowaniem spektrometrii mas. Źródło: Rodríguez JL, Pascual J, Viejo M, et al. Basic procedures for epigenetic analysis in plant cell and tissue culture. Methods Mol Biol. 2012;877:325-41. doi: 10.1007/978-1-61779-818-4_25.

Typy technik wykorzystujących elektroforezę kapilarną

• strefowa elektroforeza kapilarna, Capillary Zone Electrophoresis (CZE)

• żelowa elektroforeza kapilarna, Capillary Gel Electrophoresis (CGE)

• izoelektryczne ogniskowanie kapilarne, Capillary Isoelectric Focusing (CIEF)

• izotachoforeza kapilarna, Capillary isotachophoresis (ITP)

• elektrokinetyczna chromatografia, Electrokinetic Chromatography (EKC)

• micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna, Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MEKC)

• mikro emulsyjna elektrokinetyczna chromatografia Micro Emulsion Electrokinetic Chromatography (MEEKC)

• kapilarna elektrochromatografia, Capillary Electrochromatography (CEC)

• elektroforeza kapilarna w warunkach niewodnych, Non-Aqueous Capillary Electrophoresis (NACE)

• elektroforeza strefowa (CZE z ang. capillary zone electrophoresis) - jest najczęściej stosowaną techniką CE, umożliwia ona rozdzielanie naładowanych cząstek, na podstawie różnicy w ich ruchliwościach w wolnym roztworze. Poszczególne składniki mieszaniny ustawiają się w oddzielnych strefach.

• elektroforeza żelowa (CGE z ang. capillary gel electrophoresis) - stosowana jest do rozdzielania makrocząsteczek biologicznych, rozdzielanie mieszaniny dokonuje się na podstawie różnicy w ich wielkościach, na odpowiednim polimerze, pełniącym rolę sita molekularnego.

• izoelektroogniskowanie (CIEF z ang. capillary isoelektric focusing) - wykorzystywana jest do rozdzielania białek i peptydów na podstawie ich punktu izoelektrycznego. Gradient pH w kapilarze powstaje dzięki wprowadzeniu do buforu amfolitów (substancji obojnakich posiadających w swojej cząsteczce zarówno ugrupowania o charakterze zasadowym jak i kwasowym).


• izotachoforeza (CITP z ang. capillary isotachophoresis) - próbkę umieszcza się między dwoma buforami: wiodącym i zakańczającym. Bufory dobiera się tak, aby ich efektywne ruchliwości obejmowały efektywne ruchliwości jonów w próbce. Po przyłożeniu pola elektrycznego następuje przepływ buforu w kapilarze i dochodzi do uszeregowania jonów zgodnie z ich ruchliwościami w przylegające do siebie strefy, które migrują ze stałą prędkością.

• kapilarna elektrochromatografia (CEC z ang. capillary electrochromatography) - łączy cechy chromatografii z elektroforezą. Kapilara, podobnie jak w chromatografii, wypełniona jest fazą stałą, ale w odróżnieniu od chromatografii, gdzie ruch fazy ruchomej jest wymuszony ciśnieniem przyłożonym z zewnątrz, w elektrochromatografii migracja następuje w wyniku przepływu elektroosmotycznego.

• micelarna elektrokinetyczna chromatografia (MEKC z ang. micellar electrokinetic chromatography) -przedstawicielka szerokiej grupy technik nazwanych elektrokinetyczną chromatografią (EKC), umożliwia rozdzielanie cząstek obojętnych, dzięki wprowadzeniu do roztworu buforowego związku powierzchniowo czynnego, po przekroczeniu tzw. krytycznego stężenia micelarnego monomery surfaktanta tworzą micele. Rozdzielenia składników mieszaniny dokonuje się na podstawie różnicy w stopniu ich powinowactwa do miceli.


✓ CE jest elektroforetyczną techniką analityczną komplementarną do HPLC, ale zasadniczo inną.

✓ CE ma zastosowanie do cząsteczek naładowanych lub polarnych.

✓ CE działa na kapilarze z otwartym światłem.

✓ Podstawą separacji jest migracja różnicowa cząsteczek w stosowanym polu elektrycznym

✓ wydzielanego ciepła Joule’a jest skutecznie kontrolowane przez cyrkulację płynnego płynu chłodzącego.

✓ Użytkownik kontroluje środowisko separacji, wybierając elektrolit, kapilarę, napięcie, temperaturę i inn.

Podsumowanie

prezentacja programu powerpoint · migracja cząstek obdarzonych ładunkiem pod wpływem...

Documents