Molekularne przełączniki

- nie wszystkie procesy przebiegają w komórce

równocześnie – część działa cyklicznie,

kontrolując zachowanie komórki i jej reakcje

w zależności od różnorodnych sygnałów

- takie białka, szczególnie często spotykane

w obrębie szlaków przekazywania sygnałów,

nazywane są molekularnymi przełącznikami

- główną klasą MP są GTPazy (białka G),

kontrolujące włączanie/wyłączanie większości

procesów komórkowych

GNBP - guanine nucleotide binding protein

GAP - GTPase activating protein

GEF - guanine nucleotide exchange factor

GDI - guanine nucleotide dissociation inhibitor

GPR - G protein regulatory motif

ATP - energia dla enzymatycznych

reakcji metabolicznych, fosforylacji

w regulacji wewnątrzkomórkowej

i ruchu motorów molekularnych

GTP - głównie używany w regulacji

procesów z udziałem GNBP (z wyjąt-

kiem dynaminy, septyny, tubuliny

i czynnika elongacyjnego G)

Białka G

– zbudowane z podjednostek , i

– outside-in signaling

Guanine nucleotide binding proteins

– małe białka G, GNBP

– przekazywanie sygnałów wewnątrz komórki

– przełączniki molekularne

Heterotrimeryczne białka G (100 kDa)

Monomeryczne białka G (20-29 kDa)

Nadrodzina Ras

Ras podziały i różnicowanie

komórek

Arf/Sar tworzenie pęcherzyków,

aktywacja PLD

Rab

transport pęcherzykowy

i sekrecja

Ran transport jądrowy,

kontrola cyklu komórkowego

Rho reorganizacja cytoszkieletu,

podziały komórek

Small GTP-binding proteins

of the Rho subfamily (Rho,

Rac, Cdc42) function to

organize the actin

cytoskeleton, including:

filopodium extension,

lamellipodium formation,

generation of actin stress

fibers, focal adhesions

GTPazy z rodziny Rho

Rho GTPases

Cdc42 cells send out

exploratory filopodia

RhoA formation of actin stress fibers

and focal adhesions,

microtubule stabilization

Rac1 extensions of broad

sheet-like lamellipodia,

destabilization of microtubules

membrane

GAP – GTPase

activating protein

GEF – guanine

nucleotide exchange

factor

GDI – guanine

nucleotide

dissociation inhibitor

G protein

cycle

biological

response

effector

proteins

GEF

GDP

GTP

signal

R

GAP

GDP

GTP GDP

inactive

GD

I Rho

Rho GTP

active

http://www.sciencemag.org

Rho GTPases

amplification

integration

time control

precision (No. of genes)

Struktura GNBP - minimalna domena G

Uniwersalny przełącznik

wiązanie γ-fosforanu

przez grupy NH

łańcucha głównego

zachowywanych

ewolucyjnie reszt Thr35

i Gly60

uwolnienie grupy

fosforanowej powoduje

lokalną relaksację,

przekładającą się na

zmianę konformacyjną

pętli switch I i II

Ruchliwość regionów przełącznikowych

Ruchliwość regionów przełącznikowych

Vetter & Wittinghofer, 2000

G domain

Grupa gamma fosforanowa określa strukturę regionów przełącznikowych

Zmiany konformacyjne w białku Ran

w czasie hydrolizy GTP do GDP

Domena G

Dodatkowe domeny w GNBP i ich lokalizacja

względem domeny G

Rho - dodatkowy

13 aa, -helikalny

insert

Gi - niezależnie

zwijająca się

domena -helikalna

hGBP1 (human guanylate

binding protein) - wiele

dodatkowych elemen-

tów II rzęd. i C-ter-

minalna domena typu

coiled-coil

Czynnik elongacyjny Tu (EF-Tu), czynnik inicjacyjny (IF2/eIF5B),

czynnik elongacyjny G (EF-G) - mają odpowiednio dwie, trzy lub cztery

dodatkowe domeny

Mnogość oddziaływań domeny G z efektorami

Regiony przełącznikowe ‘switch’ są zawsze przynajmniej częściowo

zaangażowane w wiązanie efektora

Różne rodziny przełączników molekularnych

– podobieństwo struktury i funkcji

Kinezyna Miozyna Małe białko G

Model for the motor

actions of muscle myosin

Models for the motor

actions of muscle kinesin

membrane

GAP – GTPase

activating protein

GEF – guanine

nucleotide exchange

factor

GDI – guanine

nucleotide

dissociation inhibitor

G protein

cycle

biological

response

effector

proteins

GEF

GDP

GTP

signal

R

GAP

GDP

GTP GDP

inactive

GD

I Rho

Rho GTP

active

Schemat działania białka GEF

Seria szybkich i odwracalnych reakcji:

- binarny kompleks GNBP-nukleotyd

- trimeryczny kompleks GNBP-nukleotyd-GEF

- binarny kompleks GNBP-GEF

Równowaga jest przesuwana na korzyść

związanego GDP czy GTP przez

odpowiednie powinowactwo GDP i GTP

do GNBP; stężenie nukleotydów; powino-

wactwo i stężenie dodatkowych białek (jak

efektory które przesuwają równowagę

w stronę formy związanej z GTP

- strukturalnie białka GEF nie są spokrewnione

i szczegóły „zwalniania” GDP są różne. Jest

kilka mechanistycznych podobieństw:

oddziaływanie ze switch I i II oraz dostarczenie

reszt w obrębie pętli P.

- nie jest jasne, jaka jest kolejność wydarzeń

prowadzących do wymiany GDP/GTP, ani

która cześć nukleotydu jest zwalniana

pierwsza – zasada czy fosforan

Białka GEF

GDI – inhibitor dysocjacji nukleotydu

- zupełnie różne sposoby

zwinięcia poznanych GDI

- wymagają do wiązania

prenylowanego końca GNBP

- kompleks GNBP-GDI tworzy

rezerwuar komórkowy GNBP

i pozwala na jego transport

do różnych błon w obrębie

komórki

- stąd rola GDI jako inhibitora

zdaje się być jedynie

przypadkową konsekwencją

Figure 7. Guanine nucleotide dissociation inhibitors. A. Rac2·RhoGDI (LyGDI) complex (PDB 1ds6). C-

terminal immunoglobulin-like domain is designated LyC, N-terminal - LyN, linker recognized by ICE

protease – ICE. B. Surface and electrostatic potential of LyGDI. Positively charged (basic) regions in blue

and negatively charged (acidic) ones in red. The hydrophobic cavity responsible for binding of the C-

terminally attached isoprenyl moiety is also shown. The switch I (SwI) and switch II (SwII) regions are

buried in the interaction site. C. RabGDI (PDB 1gnd). The GCD domain responsible for Rab binding is

shown.

membrane

GAP – GTPase

activating protein

GEF – guanine

nucleotide exchange

factor

GDI – guanine

nucleotide

dissociation inhibitor

G protein

cycle

biological

response

effector

proteins

GEF

GDP

GTP

signal

R

GAP

GDP

GTP GDP

inactive

GD

I Rho

Rho GTP

active

• GAP dostarcza reszt stabilizujących rejony przełącznikowe I i II, a głównie resztę Arg

stabilizującą Gln-61 (Gln-63 w RhoA), powodując tym samym odpowiednią orientację

cząsteczki wody do hydrolizy -fosforanu. W większości przypadków palec argininowy

(arginine-finger) jest niezbędny, ale są również inne kluczowo ważne dla aktywności

typu GAP reszty. Dla przykładu domena BH p85PI3-kinazy (BHPI3-K) zawiera

zachowywaną Arg, wiąże się do Rho, ale nie posiada aktywności typu GAP.

Wyjątek stanowią: Rap,

PSF, hGBP-1septyna,

dynamina gdzie zamiast

Gln występuje Thr, His,

reszta hydrofobowa

Domena GAP

Mechanizm działania GAP

GAP

GTPaza

GTP

Multifunctional GAP proteins

A. Giα1·GDP·AlF4­­-· RGS4 B. H-Ras·GDP·p120GAP C. Rho·GDP·AlF4­­

-·RhoGAP

Domena GAP

Bardzo podobna architektura regionów ‘switch’ I i II, podobna lokalizacja reszty

glutaminy i nałożenie cis-Arg z G , trans-Arg z Ras i RhoGAP, oraz reszty

tyrozyny z Ran.

Domena GAP

Nałożenie kompleksów białkowych:

Ran–RanBP1–RanGAP (czerwony)

Rho–RhoGAP (pomarańczowy)

Ras–RasGAP (zielony)

G –RGS (niebieski)

RasGAP – zółty, RhoGAP – czerwony,

RacExoS – niebieski, G RGS

Domena GAP

Toksyna ExoS z Pseudomonas aeruginosa

inaktywuje Rho „udając” GAP

- Receptory importowe

(importyny ) i eksportowe

(eksportyny) w jądrze

wiążą się z różnym

powinowactwem do

Ran·GTP i Ran·GDP,

co umożliwia wymianę

ładunku.

- Zwykle jedyną funkcją hydrolizy GTP przeprowadzanej przez małe białka G przy udziale

GAPów jest zmiana stanu białka G – z włączonego na wyłączony

- Zdarzają się jednak przypadki, gdy wytworzona energia może być wykorzystana również

w inny sposób – w przypadku białka Ran hydroliza GTP jest siłą napędową dla transportu

przez por jądrowy

- W cytozolu RanGAP utrzymuje Ran prawie wyłącznie w formie nieaktywnej, natomiast

w jądrze białko Ran nucleotide exchange factor (RCC1) umożliwia przejście z Ran·GDP

do Ran·GTP.

- jest przynajmniej 140 ludzkich

małych białek G

- około 160 ludzkich genów koduje

białka GAP. Stanowi to 0,5%

genomu

- ”drugorzędowa” rola białek G

w cyklu?

-regulacja aktywności białek GAP

(fosforylacja, oddziaływanie białko-

białko, białko-lipid, lokalizacja

komórkowa, proteoliza)

- białka GAP mogą być efektorami

dla GTPaz – integracja sygnałów

Regulacja białek GAP

-aktywność p190-B

RhoGAP jest stymulowana

oddziaływaniem z Rnd3 –

kaskadowe oddziaływanie

GTPaz mediowane przez

białka GAP, podobnie jak

w przypadkach opisanych

dla białek GEF

- wewnątrzcząsteczkowo:

poprzez domenę P (w p120

RasGAP)

Regulacja poprzez oddziaływanie z białkami

Regulacja poprzez fosforylację

http://www.sciencemag.org

Regulacja białek GAP

Tubulina - struktura oznacza

funkcje...

-- dla biochemika jest to

biochemiczna rola białka,

dla genetyka funkcje

wyznacza fenotyp

mutanta, dla fizjologa

spojrzenie na funkcje jest

jeszcze szersze

- (a) wiązanie monomerów

(b) tworzenie

protofilamentów (c)

wiązanie motorów

białkowych (d) siła

napędowa wici (e) sieć

„autostrad” komórkowych

Wiązanie substratu (MAPKK-2)

do czynnika L toksyny wąglika

(anthrax toxin lethal factor)

Rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne

- miejsca wiążące ligandy i centra

aktywne są tworzone w trakcie

zwijania białka poprzez nieidealne

pakowanie się łańcuchów bocznych

- regiony te tworzą mikrośrodowiska,

które znacznie różnią się

od otaczającego rozpuszczalnika (jeśli

reszty budujące kieszeń są hydrofobowe,

jej wnętrze przypomina rozpuszczalnik

organiczny i może ona wiązać np. lipidy)

- kompromis energetyczny kumulacji

reszt o tych samych własnościach

(np. przy tworzeniu naładowanych łatek)

Centrum aktywne racemazy

ze związanym substratem

Rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne

- wyspecjalizowane

mikrośrodowiska miejsc wiążących

są podstawą zdolności

katalitycznych enzymów

- silne pole elektrostatyczne jest

tworzone poprzez bliskość Arg/Lys

i Glu/Asp. W roztworze wodnym

lub strukturze białka powstanie

mostek solny, ale w pewnych

mikrośrodowiskach wymiana

protonu między nimi jest

niekorzystna bliskość reszt Lys164 i 166 obniża ich

powinowactwo do protonu

Białka są cząstkami elastycznymi

- najszybsze ruchy

to wibracje atomów

i rotacja grup metylowych

- tranzycje z jednego

rodzaju zwinięcia

do drugiego zachodzą

niezwykle rzadko

- fluktuacje konformacyjne

w strukturze domen

zachodzą jedynie lokalnie

(ligandy mogą powodować

lokalne uporządkowanie,

zwinięcie się fragmentu białka)

Izomeraza triozofosforanowa

- 8 reszt 10Å

- po związaniu liganda, pętla

„na dwóch zawiasach” zamyka

miejsce wiązania i wchodzi z nim

w interakcje, jednocześnie

osłaniając ligand

od rozpuszczalnika

- ruchy pozostałej części białka są

dużo mniejsze

(„rigid-body movement”)

Mioglobina kaszalota

zacieniowana zgodnie

ze stopniem elastyczności

-białka nazwano cząsteczkami

„półciekłymi” – ruch atomów

większy niż w ciałach stałych

(np. NaCl), ale mniejszy niż

w wodzie

-im ciemniejsze zacieniowanie,

tym bardziej sztywny atom

-powierzchnia nie jest jednakowo

dynamiczna

-grupy metylowe i reszty

aromatyczne wykazują ruchy

kolektywne

Aminotransferaza Asp

forma zamknięta i otwarta

-ruchy indukowane wiązaniem liganda

– o najwyższej wadze funkcjonalnej

-rearanżacja pojedynczej reszty vs.

ruch całej domeny

-indukowane dopasowanie –

związanie substratu powoduje

przejście z formy nieaktywnej

w aktywną (w tym przypadku z 10o

przesunięciem mniejszej domeny

w kierunku głównej części cząsteczki)

siłą sprawczą dla induced fit

jest mostek solny między

Arg domeny mobilnej

a grupą karboksylową

liganda (Asp)

Różnice w temperaturowej zależności aktywności dehydrogenazy 3-

fosforanu D-gliceraldehydu (GAPDH)

z dwóch organizmów są pochodną ich sztywności

Różna elastyczność/sztywność białek

w zależności od ich funkcji i pochodzenia (białka termofilne)

Ścisłe dopasowanie pomiędzy białkiem i ligandem

(Kinaza białkowa A z analogiem peptydowym)

Elastyczność białek

klucz – zamek

indukowane

dopasowanie

(induced fit)

By związać ligand, białko musi

być zdolne do utworzenia miejsca

wiążącego o odpowiedniej dla

partnera stereochemii, konfiguracji

ładunków i potencjale grup

tworzących HB

Białko „otula” ligand

dzięki swej naturalnej

elastyczności

proteaza HIV w kompleksie z trzema różnymi inhibitorami

powodującymi zamknięcie „klapy”

(a) haloperidol (b) crixivan (c) peptydowy analog substratu

-elastyczność białek zapewnia możliwość dopasowania

konformacyjnego do wiązanego liganda (pod warunkiem,

że dojdzie do utworzenia wystarczająco wielu korzystnych oddziaływań,

przewyższających energetyczny koszt dopasowania strukturalnego)

Dopasowanie białka do różnych ligandów

Przykład dużej

zmiany konformacyjnej

(kinaza adenylanowa)

AMP

AMP+ATP

Zmiany konformacyjne wymuszone związaniem liganda

Kompleks hGH z dwoma cząsteczkami receptora,

dwie niezależne powierzchnie oddziaływania hGH

z dwiema identycznymi cząsteczkami receptora

-oddziaływanie poprzez jedną dużą

powierzchnię zagrzebania (setki Å2)

lub kilka oddzielonych obszarów

-trudne do przewidzenia (setki kontaktów)

-ścisłe dopasowanie,

wiele punktów kontaktu

-najczęściej ligand wiązany jest przez

wystające pętle lub w obrębie dużego

zagłębienia (dodatkowe dopasowanie

kształtu), ale zdarzają się też całkiem

płaskie interfejsy oddziaływania

Miejsca wiązania makrocząsteczek – wklęsłe, wypukłe lub płaskie

Dwa kompleksy białko-DNA

(a) represor genu toksyny dyfterytu (rozpoznanie przez helisa-zwrot-helisa)

(b) czynnik transkrypcyjny Gal4 (rozpoznanie przez pętlę stabilizowaną przez Zn)

Miejsca wiązania – wystające helisy i pętle

cyt P450 ze związanym substratem

Wiązanie liganda we wnętrzu

„kieszeni” białka

-elastyczność białek

pozwala znaleźć się w ich

wnętrzu bardzo dużym ligandom

-miejsce wiązania liganda często

można zidentyfikować jako „jamkę”

w strukturze wolnego białka

Dimeryczna dehydrogenaza

bakteryjna 3-izopropylomaleinianu

Położenie miejsc wiążących

Miejsca katalityczne często

występują na styku domen

strukturalnych

i/lub podjednostek

Słabe oddziaływania prowadzą

do łatwej wymiany partnerów

w ścieżce sygnalizacyjnej

(partner swapping)

STAT – signal transducer and

activator of transcription

Wymiana domen w białku kapsydu wirusa papilloma

służy stabilizacji trimeru (domain swapping)

Wiązanie liganda poprzez

oddziaływania hydrofobowe i HB:

siła i/lub specyficzność

-wkład w energię wiązania dzięki

siłom niekierunkowym

(oddziaływania hydrofobowe)

-wkład w specyficzne rozpoznanie

dzięki siłom kierunkowym (HBs)

Białka strukturalne

- komórka jest tworem silnie ustrukturyzowanym a

zarazem dynamicznym

- nadanie i utrzymanie kształtu komórek i organelli,

a także jego zmiany w odpowiedzi na bodźce

zewnętrzne, zależą od białek strukturalnych

- kształt samego tylko rybosomu zależy od ponad

100 różnych białek

- wiele struktur tworzonych przez białka ma

charakter tymczasowy, np. skrzepy krwi, włókna

naprężeniowe

Oddziaływania w białkach

strukturalnych -rusztowania wyłącznie białkowe (α - kolagen,

β - jedwab, elastyna, keratyna, wirusy)

lub mieszane (chrząstka)

-często cross-linking łańcuchów białkowych

(kolagen, elastyna)

Białko będące

rusztowaniem - Ste5p

(scaffold protein)

Białka - szkielety, rusztowania i łączniki

Białka strukturalne

o aktywności katalitycznej

(miozyna II) –

polimeryzacja/depolimeryzacja,

ruch białek względem siebie