Proteína Unicelular

Historia

• En 1964 el profesor Wilson del instituto de Tecnología de Massachusetts acuño las palabras Single Cell Protein, SCP (proteína Unicelular), para denominar las proteínas microbianas.

Los microorganismos productores de SCP, tienen la capacidad de crecer en un variedad de medios:

• Bagazo • Almidón • celulosa Estos son residuos agrícolas renovables.

Otros que son no renovables: Alcanos Etanol Metanol

• Uno de los aspectos más críticos de un proceso de fermentación industrial es la recuperación y purificación del producto.

• La selección de las etapas apropiadas de purificación depende de la naturaleza del producto final, su concentración, los productos laterales presentes, la estabilidad del material biológico y el grado de purificación necesario.

• Cuando se discute la recuperación del

producto se debe distinguir entre los conceptos de purificación y concentración.

Ejemplo:

• El propio microorganismo puede ser el

producto final deseado, como por ejemplo en el proceso ICI-Pruteen para la producción de biomasa como proteína de origen unicelular (SCP).

• En este caso si las células son calentadas

se agregan en grandes partículas que pueden ser fácilmente separadas del medio de fermentación por sedimentación.

• La primera etapa en la recuperación del producto es, la separación de la biomasa celular y los ingredientes insolubles del sobrenadante.

• Para este propósito existen varios métodos, que incluyen la floculación, flotación, filtración o centrifugación.

• Las últimas etapas en la recuperación del proceso implican precipitación, cristalización y/o desecación.

Floculación y flotación

• Las células aisladas en el rango de tamaño de 1 a 10 mm sedimentan solo muy lentamente y son difíciles de precipitar incluso con la centrífuga.

• En la mayor parte de los casos se añade

un agente floculante, como una sal inorgánica, un polielectrolito orgánico o un hidrocoloide mineral.

• El proceso reverso a la floculación es la flotación que es más fácil de conseguir introduciendo gas en el líquido. Las células se adsorben a las burbujas de gas y suben a la capa de espuma en la parte superior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del biorreactor.

Sistemas de filtros

• Los dos principales tipos de filtros son denominados filtros profundos y filtros absolutos.

• Un filtro profundo se construye a partir de una matriz filamentosa, como lana de vidrio, papel de filtro o asbestos, llevándose a cabo el proceso de filtración debido a que las partículas que han de ser removidas quedan atrapadas dentro de la matriz.

• Los filtros absolutos son membranas en

las que el tamaño de los poros es más pequeño, que las partículas que van a ser filtradas.

• En cualquier caso la eficiencia de la filtración está influenciada por numerosos factores, como el tamaño de los microorganismos, su morfología, el pH, viscosidad, presencia de capas mocosas, temperatura y presencia de otros organismos como posibles contaminantes.

• Otro tipo de filtro, más adecuado para soluciones en las que la concentración de sólidos es más baja es el filtro de prensa, en el que una pila de placas porosas planas se utilizan como soporte para un filtro, sea de tela o una membrana.

• El volumen de la cámara dentro de las

placas determina la capacidad de biomasa de este tipo de filtro.

• Aunque el micelio (de hongos o de

actinomicetos) puede ser separado con un filtro de tambor, las bacterias unicelulares se separan del medio generalmente utilizando filtros de membrana.

• El método de contracorriente se desarrolló

para reducir la tendencia a las obstrucciones. En este método la solución se bombea en contracorriente a través de una membrana.

• El filtrado pasa a través de la membrana y la biomasa se separa del filtro y se transfiere con el material que se retiene. Con el método de contracorriente puede obtenerse un aumento de la velocidad de filtración de 100veces en comparación con la filtración estática.

Dependiendo del tamaño de las partículas hay: • ósmosis reversa, para partículas de

0.0001-0.001 mm • ultrafiltración, para partículas de 0.001-0.1 mm • microfiltración, para partículas de 0.1-10 mm. La ósmosis reversa implica generalmente a

substancias de pesos moleculares menores de 1.000,

la ultrafiltración a substancias de pesos moleculares mayores de 1.000.

• El proceso de microfiltración concierne principalmente a la separación de células o de fracciones celulares.

• Se utilizan membranas fabricadas con ésteres de celulosa, polivinilfluoruros, policarbonatos, polisulfonas y celulosa.

• Las membranas se preparan en forma de “cassettes”, como módulos en espiral, como manojos de tubos de 1-2cm de diámetro o como capilares.

• Además de su uso en filtración las membranas juegan un papel en el propio proceso de fermentación. Pueden funcionar proporcionando aire estéril y pueden ser utilizadas de otras formas en el fermentador.

Centrifugación

• La centrifugación no se utiliza solamente para separar partículas sólidas de la fase liquida (fluido/separación de la partícula) sino también para la separación de fluido/fluido y fluido/fluido/partícula.

• Se utilizan dos tipos distintos de centrífugas, centrífuga de filtro o tamiz, y centrífuga con deflectores.

• En la centrífuga de filtro o tamiz la separación se produce a medida que las partículas son forzadas contra un material filtrante.

• En la centrífuga de deflectores la separación se produce debido a la diferencia de densidad entre las partículas y el líquido.

• El producto puede ser separado continua

o discontinuamente.

Cromatografía

• Algunas de las etapas más caras en la

recuperación del producto implican el uso de métodos cromatográficos.

• Tales métodos son de especial valor para

la purificación de materiales biológicos sensibles y encuentran un amplio uso en la preparación de materiales farmacéuticos, reactivos de diagnóstico y para investigación.

• Según el mecanismo de separación tenemos: a) Filtración en gel Peso molecular b) Cromatografía de Interacciones adsorción hidrofóbicas c) Cromatografía de Carga intercambio iónico d) Cromatografía de Actividad afinidad biológica e) Electroenfoque Punto isoeléctrico

Extracción

• Muchos productos pueden ser purificados mediante extracción con solventes. Se establece un sistema en dos fases utilizando un solvente que es inmiscible con el caldo acuoso de fermentación.

• Para la separación de proteínas no pueden ser utilizados los solventes orgánicos pero pueden ser utilizados sistemas acuosos de dos fases, preparados en una solución de sales con polímeros hidrofílicos.

• En ambas fases el agua es el componente principal, pero ambas fases no son miscibles. Las células permanecen en una de las fases y los componentes de fermentación es transferida a la otra fase sin pérdida de actividad.

Cristalización y precipitación

• Una vez ha sido separado el producto de

interés puede ser adicionalmente concentrado por evaporación o por transferencia a baja temperatura.

Desecación

• Para materiales biológicos es esencial secar el producto final de tal manera que su actividad no se pierda. La desecación implica esencialmente la transferencia de calor al producto húmedo y el desprendimiento de la humedad con una corriente de gas.

• La transferencia de calor puede ser por contacto directo, por convección o por radiación. Existen en el comercio numerosos aparatos para llevar a cabo los procesos de secado.

• Incluyen secadores de convección (tales como secadores de pulverización, rotatorios y de bandas) y secadores por contacto (como secadores de capa fina o de cámara).

RENDIMIENTO

• Las pérdidas en la recuperación dependen

de la sensibilidad de las substancias al proceso y del número de etapas de purificación.

• La Tabla 6.5 muestra pérdidas de rendimiento típicas.

• La fracción del coste total atribuido a la

purificación está en un promedio de alrededor del 20% pero en casos extremos, con ciertos tipos de metabolitos intracelulares, puede ser tan alto como el 90%.

Cuantificación de proteínas

• Método de Biuret • Se basa en la formación de un complejo

coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH.

• Método de Bradford • Se basa en la unión de un colorante,

Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja.

• Método de BCA • El ácido bicinconínico, sal sódica, es un

compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino.

Principales métodos para la cuantificación de proteínas,

principales ventaja e inconvenientes Método Ventajas Inconvenientes Métodos de Absorción

No se pierden las muestras

Interfieren muchos compuestos que absorben en el UV

Métodos Derivados Colorimétricos

Biuret Bastante específico para proteínas Muestra pocas interferencias Es barato

Tiene poca sensibilidad

Lowry Tiene bastante sensibilidad

No todas las proteínas reaccionan igual Mustra muchas interferencias como detergentes no iónicos, sulfato amónico etc.

Bradford Muy sensible Muestra interferencias con detergentes BCA Es el método mas sensible

Es el que muestra menos interferencias

Métodos Derivados Fluorimétricos

o-ftalaldehido Muy sensible La interferencia de aminas contaminantes en la muestra No todas las muestras reaccionan igual

Gracias