presentación biomol 2

..\Genetica del color(1).pptx



Relevancia

del

Aislamiento

del ADN

La extracción de ADN es el primer

paso en la tecnología del ADN.

• Determinación del perfil de ADN

• Clonación

• Diagnóstico de enfermedades

• Determinación de secuencias de ADN

• Transferencia génica: Organismos Modificados Genéticamente (OMG), agricultura, farmacéutica

• Pruebas ambientales, bioterrorismo

• AISLAMIENTO DE ADN DE CELULAS BUCALES

Resumen del

Protocolo:Extracción

de ADN Genómico

• • Utilización de agua como enjuague para la recogida de las células bucales

• • Añadir el búfer de lisis para romper las membranas nucleares y celulares y liberar el contenido nuclear

• • Utilización de la proteasa para digerir las proteínas celulares

• • Precipitación del ADN con alcohol frío y alta concentración de sal.

Extracció

n de ADN : Paso-a-

Paso

• Puesto común (Puesto del Maestro)

• Baño a 500C

• Botella de isopropanol 91% o etanol 95%, en hielo

• Puesto de trabajo de los alumnos Número• (4 Estudiantes/Puesto de trabajo )

• Tubos de15 ml con 3 ml de agua 4

• Microtubo rosa marcado “prot”, • con 1.25 ml de proteasa rehidratada con sal

1

• Tubo de 15 ml tubo marcado “lisis” con 10 ml de búfer de 1

• Pipetas de plástico 6

• Gradilla de hule espuma para los tubos 1

• Marcador de tinta indeleble 1

• Taza de papel dispensable o un beaker para sostener los 1• tubos de 15 ml y la subsiguiente colección de basura

• Materiales para hacer el collar de ADN o un micortubo de1.5ml 1

• Guía rápida 1

Extracción y

Precipitación

de ADN

Listado de Materiales

4 Estudiantes/Puesto de

trabajo para un total de

36 Estudiantes

Es de vital

importancia

realizar una

abundante

recogida de

células.

•Para mejores resultados, asegúrese que los alumnos empleen la suficiente cantidad de tiempo recogiendo las células de la mucosa bucal.

•Pueda que la colección de muestra en el tubo de 15 mL sea difícil. Puede utilizar un vaso pequeño para dispensar y coleccionar la muestra.

Protocolo de Práctica de Laboratorio

1. Obtenga del instructor un tubo de 15 mL que contenga 3 ml de agua. Marque el tubo con sus iniciales.

• 2. Cuidadosamente mordisquee el interior de los cachetes por 30 segundos. ¡No sirve de nada sacar sangre!

• 3. Tome el agua del tubo de15 mL, y con el agua enjuague por 30 segundos.

• 4. Cuidadosamente escupa el liquido de regreso al tubo de 15 mL.

Pasos 1 − 4

Protocolo de Práctica de

Laboratorio

5. Obtenga el tubo de búfer de lisis del puesto de

trabajo y añade 2 mL de búfer de lisis a su tubo

que contiene el extracto celular.

6. Cierre el tubo e inviértalo suavemente para

mezclar los componentes. (¡No lo mezcle muy

duro!). Observe su tubo — ¿Ve algunos

cambios? Anótelos.

Pasos 5 − 6


Laboratorio

• 7. Obtenga el tubo de proteasa (marcado “prot”) de su puesto de trabajo. Añade 5 gotas de proteasa a su tubo.

• 8. Cierre el tubo y voltéelo suavemente varias veces.

• 9. Coloque su tubo en la gradilla o en un beaker en el baño de agua y déjelo incubar por 10 minutos a 50°C.

Pasos 7 − 9

Extracció

n y

precipita

ción de

ADN

• ¿Por qué se lleva a cabo cada paso?

1. Colección

de células

El mordisqueo del

interior de la boca, en

combinación con el

enjuague de agua

funciona para separar

las células del epitelio

alineando la boca.

Es crítico recoger la

cantidad suficiente de

células.

2. Búfer de Lisis¿Qué es el Búfer de Lisis?

• 50 mM Tris-HCI, pH 8.0• 1% SDS

Búfer deTris para mantener el pH de la

solución en el cual ADN se mantiene estable

1% SDS para romper y abrir las membranas celulares y nucleares permitiendo que

el ADN quede libre en la solución.

El detergente SDS desnaturaliza y desdobla las proteínas dejándolas

accesibles para las proteasas.

O

S

O

O

O

-

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH3

SDS

Na+

3. ¿Por qué

utilizamos la proteasa?

• • La proteasa se utiliza para destruir

las proteínas nucleares que crean un

enlace con el ADN y para destruir

enzimas citoplasmáticas que degradan y

destruyen el ADN.

• • El tratamiento con proteasa

incrementa la cantidad de ADN intacto

que es extraído.

4. Adición de la

solución salina

• • La solución de proteasa ya contiene sal.

• • Los iones de Na+ del NaCI forman

enlaces con los grupos de fosfato de las

moléculas de ADN, neutralizando las

cargas eléctricas del ADN.

• • La adición de NaCI permite que las

moléculas de ADN se junten en lugar de

repelerse una a la otra. De esta manera

se facilita la precipitación del ADN de la

solución al añadir el alcohol.

5. Precipitación

del ADN con

alcohol frío

• • El ADN no se disuelve en alcohol.

• • El añadir alcohol hace que el ADN se agregue y se precipite de la solución.

• Las moléculas del ADN precipitadas parecen un material fibroso, como los hilos blancos de una telaraña.

• Las burbujas microscópicas de oxígeno, que se generan al mezclar, se “agregan” al precipitarse el ADN.

• Las burbujas visibles más grandes, levantan el ADN fuera de la solución y lo llevan de la fase acuosa a la fase orgánica (fase del alcohol).


Laboratorio • 10. Lentamente añade 10 ml de alcohol frió manteniendo el tubo a un ángulo de 45°. Este paso va a requerir de varias adiciones utilizando la pipeta de transferencia desechable.

• 11. Deje el tubo en posición vertical en la gradilla, a temperatura ambiente y en reposo, durante 5 minutos ¿Que ve?

• 12. Cierre el tubo y voltéelo de lado y de regreso en posición vertical, con mucho cuidado, unas 10 veces, hasta que las fases de agua y alcohol queden mezcladas y el ADN salga de solución.

Pasos 10 − 12

EXTRACCIÓN DE ADNBIOMOL 2012

FMVZFRUTAS

• Extraer el material genético (ADN) de células de guineo y/o fresas.

• Establecer la relación entre el proceso de extracción y propiedades quίmico-fίsicas del ADN

Solución amortiguadora o “buffer”

• 6 mL de detergente líquido de fregar

• 5 g de sal de mesa

• 44 mL de agua destilada

• Una pizca de ablandador de carne

Preparación de la solución

Mida 6 mL del detergente en una probeta de 10 mL. Vierta en un beaker de 100 mL.

Mida 44 mL de agua destilada. Vierta en el “beaker” de 100 mL que ya contiene el detergente. Evite la formación de burbujas.

Finalmente, aňada 5g de sal de mesa y el ablandador de carne. Mezcle bien.

•Remueva la cáscara de un pedazo de guineo de una pulgada.

•Eche el guineo en una bolsa plástica con cierre de seguridad. Cierre la bolsa.

•Macere el guineo (puede ser con la mano) hasta obtener una consistencia bien blanda.

Continuación: Procedimiento

Añada los 50 mL de la solución amortiguadora. Cierre bien. Evite la formación de burbujas. ¿Por qué?

Con cuidado, coloque la bolsa en posición horizontal sobre papel toalla. Asegúrese que el macerado de guineo esté cubierto con la solución amortiguadora. Espere 5 minutos.

¿Por qué el macerado debe estar cubierto por la solución amortiguadora?

¿Por qué debe esperarse 5 minutos?

Continuación: Procedimiento Mientras esperan que

transcurran los cinco minutos, presenten posibles contestaciones a las siguientes preguntas:

¿Cuál es la función del detergente?

¿Cuál es la función de la sal?

¿Cuál es la función del ablandador de carne?

Coloque el paño sobre el vaso plástico y filtre el macerado de guineo. Luego, descarte el paño con el macerado. ¿Por qué hay que filtrar?

Utilice la regla para marcar dos tubos de ensayo a una distancia de 1” y de 2” desde abajo hacia arriba.

Aňada a cada tubo de ensayo un volumen del filtrado hasta que llegue a la marca de 1”.


Añada al tubo de ensayo un volumen

de alcohol etílico 70%-90% frío hasta llegar a la marca de 2”.

Sin mezclar, coloque el tubo de ensayo en una gradilla o en un vaso plástico. Espere por 5 minutos.


Inserte en el tubo de ensayo una varilla decristal o removedor de café para remover elADN de la capa superior del alcohol. Coloqueel ADN en otro tubo de ensayo.Continuación

: Procedimient

o

Preguntas de análisis y discusión

¿Cuál, piensas tú, es la función del detergente en la solución amortiguadora?

Cuando el detergente entra en contacto con la célula, captura los lípidos y las proteínas.

¿Cuál es la función de la sal en la solución amortiguadora?

¿Cuál es la función del alcohol etílico?

Fundamentos, variantes y

aplicaciones

REACCION EN CADENA DE LA

POLIMERASA (PCR)

1985 - Mullis & Falloona

Amplificación enzimática de un fragmento de DNA

(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.

PCR

amplificación

DNA

(molecule sencilla)

Muchas

moleculas

Síntesis de ácidos nucleicos: generalidades

• La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en dirección 5’ 3’

• Las RNA polimerasas pueden iniciar la síntesis de una cadena nueva utilizando una hebra molde

• Las DNA polimerasas además de la hebra molde, necesitan un iniciador (primer o cebador de extensión)

• La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa RNA-dependiente.

ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN LA SINTESIS DEL DNA POR PCR

Hebra Templado

Iniciador (cebador, primer): secuencia corta denucleótidos complementaria a la hebra templado. La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesisde una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.

dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados

DNA Polimerasa

PCRMelting

94 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

5’3’

3’5’DNA de cadena doble

PCRMelting

94 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

3’5’

5’3’

CalorDNA de cadena simple

PCRMelting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oCTem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

3’5’

5’3’5’

5’

Melting

94 oC

Hibridaciónde primers

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oCTem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

30 ciclos

3’5’

5’3’

Calor

Calor

5’

5’

5’

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oCTem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oCTem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

Calor

Calor

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oCTem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Fragmentos de

tamaño definido

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oCTem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR.

0

# ciclos

Numero de copias

1

3

8

2

4

1

2

4

16

5

32

6

64

VENTAJAS DE PCR SOBRE

OTRAS TECNICAS

ALTA SENSIBILIDAD

ALTA ESPECIFICIDAD

RAPIDEZ

DESVENTAJA:

PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA

templado específico o productos amplificados previamente)

• Síntesis por DNA polimerasa

•

• -A T G C A T G C A T G C * *

A C G-T


Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser

copiada

5’ 3’


•


A C G T-T


5’ 3’


•


A C G T-T A5’ 3’



•


A C G T-T A C


5’ 3’


•


A C G T-T A C G


5’ 3’


•


A C G T-T A C G T


5’ 3’


•


A C G T-T A C G T A


5’ 3’

Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos

copiada una cadena de DNA

Primer 1 Extensión de la cadena

Cadena original de DNA

¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?


Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta

temperatura (~100°C)


Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta

temperatura (~100°C)

Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva

cadena con la DNA polimerasa

Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay

un rexceso de Primer 1

2

1

Ahora tenemos dos copias de la molécula original


Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias


Fusión

95 C

Hibridización

50-60ºC

Extensión de

La cadena

75ºC

Primer Ciclo

2do Ciclo

95ºC

50 - 60ºC

75ºC

Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de

copias

Hay 7 componentes esenciales en el proceso standard de PCR

• ADN polimerasa termoestable

• Oligonucleotidos iniciadores (“primers”)

• Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs)

• Buffer (para mantener el pH)

• Cationes divalentes

• ADN molde (Templado)

ADN polimerasas termoestables• Llevan a cabo la síntesis de ADN dependiente del

templado.• Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C• Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta• Algunas presentan actividad transferasa terminal en el

extremo 3´, ej. Taq agrega una A al exremo 3´, especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tligeneran extremos romos

• Cantidad usada = 5 x 1012 moleculas (1.5 unidades)• La mas comunmente usada = Taq ADN polimerasa

Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcusfuriosus, Tli Thermococcus littoralis

Oligonucleótidos iniciadores (primers)

• Se conoce su secuencia

• Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del proceso

• Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1 kb)

• Requieren de un cuidadoso diseño

• Reglas de diseño:(a) longitud = 18-25

(b) Contenido de G+C entre 40-60%








(c) Evitar las secuencias repetidas


5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

Dímero de primer

PCR

3´ repetido

5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’

5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’

5’-NNNNNNNNTATA-3’

3’-ATATNNNNNNNN-5’


5´

5´

3´

3´

no hay extensión

PCR

5´ repetido

5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´

5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´

5´-TATANNNNNNNN-3´

3´-NNNNNNNNATAT-5´

5´

5´

3´

3´

Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA


5´

5´

3´

3´

Productos de PCR no deseados

PCR

Formación de horquillas

5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’

5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

5’-NNNNNNNNNNNGCA

3’-CGT

5´

3´









(d) Valores de Tm de no mas de 5°C uno del otro

ADN molde (templado)

• Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o doble cadena)

• ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal

• Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg of plasmídico

• Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

El ciclo de PCR

• Desnaturalización - 94-95°C por 45 segundos si G+C < 55%

• Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o determinada empiricamente para cada par de primers

demasiado alta = poco o nada de producto

demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos

• Extensión -

a la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada

ej.: 72°C para Taq

1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min

solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud deseada, los cuales a partir de allí se tornan en el producto principal

BIOMOL\biomol\Descargas de RealPlayer\PCR - Polymerase Chain reaction.flv

El ciclo de PCR• Desnaturalización - 94-95°C por 45 segundos si G+C < 55%• Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o determinada

empiricamente para cada par de primersdemasiado alta = poco o nada de productodemasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos

• Extensión -a la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada

ej.: 72°C para Taq

1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min

solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud deseada, los cuales a partir de allí se tornan en el producto principal

• Número de ciclos -- algunos componentes se tornan limitantes despues de

30 ciclos (si el número inicial = 105 moléculas)- se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a partir de ADN genómico de mamífero DNA

TECNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR

RT-PCR : detección de mRNA

PCR Nested: amplificación de una secuencia dentro de otra

previamente amplificada

PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea

In situ PCR : detección en tejido mismo, ubicación del fragmento

IC-PCR : inmunocaptura previa a PCR

PCR-RFLP : polimorfismo genético (usado más que RAPDs)

Real Time PCR : cuantificación de copias iniciales – en tiempo real

PCR Multiplex

- Varias secuencias target en forma simultánea.

- La eficiencia de amplificación de ambos targets no esnecesariamente la misma:

- Secuencia de DNA de los diferentes targets(%GC)

- Temperatura de hibridación de los diferentesprimers

- Tamaño de las diferentes secuencias target

- Artefactos / dímeros entre diferentes primers.

Multiplex PCR

• Describe una PCR enla cual hay presentes multiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos. Los mismos pueden verse como múltiples bandas en un gel de agarosa

• Multiplex PCR es frecuentemente usada en diagnóstico médico

• Ahorra templado, tiempo y gastos

• Requiere una cuidadosa optimización

mRNA

cDNA (simple cadena)

cDNA (doble cadena)

PCR

RT-PCR

Consiste en dos pasos:

• Transcripción reversa

• PCR

OBJETIVO:

Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA

Transcripción Reversa

1. Purificación de RNA mensajero

2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)

Nested PCR

• A veces 1 ronda de PCR no da un producto único producto a partir de un templado complejo, apareciendo un “chorreado”

• Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco mas internamente que los primeros

• Realizar una segunda ronda de PCR usando el producto de la primera (chorreado)

• Rinde un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers

Nested PCR

2da PCR

Chorreado de ADN

1era PCR

ADN específico

Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA

Clonado con PCR: clonado T-A

3’-A

A-3’

T-3'

3'-T

AA

T-3'

3'-T

Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor

que ligamiento con extremos romos

ligamiento

Producto de PCR

a partir de Taq Vector con cola-T

Mutagénesis por PCR• Introduce cambios de secuencia dentro de

fragmentos (clonados) de ADN

• El método de extensión solapada requiere 2 primers mutagénicos y otros 2

• Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento 3´ que se solapan. Ambos portan la mutación

• Usa los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa

Dos 1ras

PCRs

separadas

Primer SP6 Primer mutagénico directo (forward)

primer mutagénico inverso (reverse) Primer T7

X

x

x

x

remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar

2da PCR

Mutagenesis con PCR- extension solapada

• Para amplificar copias de cDNA de RNA

• Es especialmente útil cuando solose dispone de pequeñas cantidades de RNA

• Frecuentemente usada para amplificar genes específicos (como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida

• Requiere primer “antisense” y un DNA polimerasa dependendinte de RNA

• Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA

• Primero se hace un cDNA a partir del templado de ARN

• Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el duplex de cDNA por PCR

RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa

RT-PCR

AAAAAAAAAA-3’

TTTTTTTTTT-5’

Transcripción reversa

PCR usando

GSP+GSP1

AAAAAAAAAA-3’

TTTTTTTTTT-5’

mRNA

(sense)

Primer Antisense:

oligo(dT)o

1ra cadena cDNA

GSP1 (sense)

GSP (antisense)

GSP1

GSP

Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1

RAPD of P. aeruginosa

Immuno-PCR

- DETECCION DE ANTÍGENO ESPECÍFICO POR ELANTICUERPO ESPECIFICO

- ALTA SENSIBILIDAD - POR PCR

Immuno-PCR vs ELISA

protein

E

S P

ELISA

antibody with linked enzyme

StB

protein

Immuno-PCR

antibody with linked DNA

B

El Producto de PCR puede ser detectado por electroforesis o por ELISA

APLICACIONES DE PCR EN MEDICINA

• Detección de cantidades mínimas (diagnóstico temprano enpacientes asintomáticos)

•Monitoreo de terapia (por ej. disminución de carga viral)

• Evaluación de terapia - pronostico de recaída

• Detección de cepas resistentes a antibióticos

• Detección temprana de Citomegalovirus y otros patógenos en pacientes con transplante de órganos (por inmunosupresióny mayor riesgo a infecciones latentes)

MUESTRAS QUE PUEDEN PATOGENOS QUE PUEDEN SER

SER EVALUADAS POR PCR DETECTADOS POR PCR

•Sangre - Bacterias

•Mucosa - Hongos

•Tejido - Parásitos

•Orina - Virus

•Heces - Mutaciones en Genes

•Líquido cefalorraquídeo - Ausencia /Deleción de

genes

USOS DE LA TECNOLOGIA MOLECULAR EN LA SOCIEDAD

• Medicina : Diagóstico Molecular:

Enfermedades geneticas

Enfermedades infecciosas

• Identificación genética y filiación (Pruebas de paternidad, medicina forense, pedigree de animales, etc...)

• Mejoramiento genético en animales y plantas

• Productos biomédicos

• Terapia génica

REAL TIME PCR

INTRODUCCION

- PCR (estandar)

- RT-PCR

- PCR Cuantitativo (end point analysis)

- PCR en tiempo real (análisis de la cinética de reacción)

- ventajas

- desventajas

- aplicaciones

Cuantificación de copias de mRNA

1. Diferencias en la expresión de genes (por efecto de drogas por ejemplo)

2. La poca cantidad de mRNA disponible en ciertos procedimientos:•células obtenidas por LCM (laser capture microdissection)•cantidades pequeñas de tejidos•células primarias

REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL

•Cuantificación del número de copias de DNA presentes en la muestra (diagnóstico, monitoreo de carga viral, comparación entre número de copias en diferentes subespecies, etc.)

•Cuantificación del mRNA por RT-PCR en tiempo real (análisis de la expresión de genes en diferentes tejidos o en diferentes condiciones normales vs patológicas, efecto de drogas, etc)

•Análisis de la cinética de la reacción

PCR en tiempo real

• Detección y cuantificación de reporteros fluorescentes.

• La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de producto formado en cada ciclo de PCR.

• Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares, SYBR Green

Real Time PCR

2a. excitation

filters

2b. emission

filters

1. halogen

tungsten lamp

4. sample plate

3. intensifier5. ccd

detector

350,000

pixels

Log phase Level off/ plateau

32

16

8

4

2

Amplification Plot of real-time PCRD

NA

co

py

nu

mb

er

(lo

g)

PCR cycle (Ct)

ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:

• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los

primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en

el DNA o cDNAs de la muestra

• Dímeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando

productos pequeños

PROBLEMAS

PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que

pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida

durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza

SYBR-green.

CURVA DE DENATURACION

Muesta el perfil de denaturación de los productos

amplificados.

Si un producto presenta un perfil de denaturación diferente

(valores de Tm diferentes), significa que es otro producto (no

específico) de amplificación, pueden ser dímeros.

DISEÑO EN PLACA

Ventajas del PCR en tiempo real

• Simple y rápida (semi-automatizada).

• No hay manipulación post-PCR.

• Eliminación de contaminación por amplicones.

• Cuantificación del DNA o RNA molde inicial.

• Muy sensible.

• Detección de productos inespecíficos con la opción “curva de desnaturalización” (Melt-Curve).

• Detección de más de un producto específico en una misma reacción.

• Extraordinariamente específico.

Journal of Virological Methods 102:119-128, 2002

Journal of Clinical Virology 28:233-238, 2003

ELECTROFORESIS EN POLIACRILAMIDA

BIOMOL\biomol\Descargas de RealPlayer\Geles de Poliacrilamida con SDS.flv

Electroforesis 1

BIOMOL\biomol\Descargas de RealPlayer\Electroforesis en gel de Agarosa subtitulado en castellano.flv

ElectroforesisGiovanni\clase 10 feb\electroforesis\Making an Agarose Gel.flv 2

electroforesis\Making an Agarose Gel.flv

..\VIDEOS DE BIOMOL\electroforesis\Making an Agarose Gel.flv





Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE)

E.coli O157:H7

Target

region

for

PFGE

Principle: Strain diversity

Foreign DNA

Host DNA

New Host DNA

Insertion event


Host DNA

New Host DNA

Deletion event

Excised fragment


Host DNA

New Host DNA

Rearrangement event

Practice

24 hour culture

Cell suspension

abs ~1.8

Make agarose plugs

Lyse cells and wash

plugs

Practice

Restrict DNA in plugsSlice 2mm piece of

plug

Load slices onto comb

Pour gel and remove comb

Electric current 18-20 hours

buffer 14 Celectrodes

The End Result

The Analysis Process: Normalization

• Blue Loading Buffer: 33 mM NaCl, 70 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2% (w/v) SDS, 0.01 % (w/v) bromophenol blue, 10% glycerol, pH 6.8 A 25 °C.

Bandas del fragmento mitocondrial ND2-WANCY

gel de agarosa al 1.5% (Sea Kem de Cambrex)

Tinción de Bromuro de Etidio y solución tampón de

1X TBE

1Kb plus DNA ladder( Invitrogen)

Foto Analyst Investigator (Fotodyne)

CR CR CR CR CR PTY PTY CR

• Verificación del producto de PCR.

• Para evidenciar la presencia y calidad de las bandas, se utilizaron 5µl del producto amplificado y se realizó una corrida electroforéticaen un gel de agarosa al 1.5% (Sea Kem de Cambrex) en tinción deBromuro de Etidio y solución tampón de 1X TBE, las bandas sevisualizaron y revelaron por exposición a la luz ultravioleta.Posteriormente se procedió a tomar la foto del gel de corridamediante la revelación por exposición a luz ultravioleta, con unacámara fotográfica Foto Analyst Investigator (Fotodyne) con filtropara Bromuro de Etidio, la foto revelada del gel se imprimió en unaDigital Graphic Printer marca Sony. El tamaño del amplicón severificó mediante la comparación con un marcador de pesomolecular de 1Kb (Invitrogen).

• Autoradiografía (autoradiography) Técnica que detecta moléculas marcadas con radioactividad mediante la creación de una imagen sobre una película fotográfica.

Autoradiografía de hibridizaciónSouthern realizada con ADN de plantas de maíz obtenidas por cultivo de teji

BIOMOL

APLICADA

AL DIAGNÓSTICO

MÉDICO

..\pcr brucella.pdf

Mutaciones

Alteración en la secuencia del ADN de un individuo que se transmite por herencia.

Mu

taci

on

es

Tipo de célula GerminalSomática

Genoma nuclearGenoma mitocondrial

Secuencia no codificante

Secuencia codificanteRegión estructuralRegión reguladora

MagnitudAnomalías cromosómicas

Mutaciones medianas: secuencias repetidas

Mutaciones pequeñas o puntuales

MecanismoEspontáneas

Inducidas por mutágenos externos

Secuencia de acontecimientos de la enfermedad genética

Ej: mutación en un único gen, que afecta a una sola proteína

ARNm alteradoHerencia Expresión

Proteína anómalaenzima

receptor

transportador

hormona

colágeno

factor de transcripción

factor de coagulación

etc.

Función incorrecta

Alteración de:

- estructura

- capacidad de unión

- localización celular

- estabilidad

- concentración

- etc.

Enfermedad

Síntomas Clínicos

Gen normal

Gen mutante

Mutación

Estrategia de Diagnóstico Genético

La patología:

1) ¿Está asociada a una alteración cromosómica?

2) ¿Presenta herencia mendeliana?

3) ¿Locus localizado?

4) ¿Gen identificado?

5) ¿Muchos alelos mutados?

5) ¿Un alelo prevalente?

NoSi

Diagnóstico Citogenético No

Estudios de asociación y factores

de riesgo

Si

Diagnóstico por patrón de segregación

NoSi

SiDiagnóstico indirecto con

marcadores

No

Diagnóstico indirecto con marcadores

Diagnóstico Directo

Estrategia de Diagnóstico Genético

La patología:

1) ¿Está asociada a una alteración cromosómica?

2) ¿Presenta herencia mendeliana?

3) ¿Locus localizado?

4) ¿Gen identificado?

5) ¿Un alelo prevalente?

No

Si

Si

Si



• Máximo nivel de precisión en el diagnóstico:

Secuenciación del locus mutado (inviable su generalización)

• Generalmente el diagnóstico directo de una mutación se realiza mediante el estudio de:

Cambios en la estructura primaria del ADN (secuencia).Variaciones de tamaño; pérdida o ganancia de sitios de restricción.

Variaciones en sus propiedades físico-químicas.Alteración de su movilidad electroforética o sus propiedades de apareamiento.

Cambios en los productos génicos.ARNm inestables o de tamaño distinto. Proteínas truncadas.

Herramientas para la detección de mutaciones

Enzimas de Restricción

Técnicas de separación electroforética de ác. nucleicos

Hibridación de ácidos nucleicos

Amplificación enzimática del ADN (PCR)

Enzimas de Restricción

ALTA ESPECIFICIDAD: reconocen secuencias cortas de ADN doble hebra y cortan ambas cadenas.

Sitio de restricción: secuencia de reconocimiento.

Clasificación:

3 subunidades que reconoce, metila y restringe (corta). El corte ocurre al azar lejos del sitio de reconocimiento.

1 subunidad que reconoce y corta. El corte ocurre en el sitio de restricción o adyacente. Interés en ingeniería genética y análisis de ADN.

Tipo I

Tipo II

2 subunidades y cortan el ADN a 25 pb del sitio de reconocimiento.

Tipo III

Eco RIEscherichia coli

Cepa RY13

1ª enzima descubierta

Papel biológico de las ER en bacterias

Acción de las ER Tipo II

Sitio de restricción Lugar de reconocimiento e hidrólisis del ADN

Secuencia palindrómica de 4-8 pb

Dos tipos de cortes:

romos y cohesivos

RFLP: Polimorfismo del largo de los fragmentos de restricción

Variante usando PCR

RFLP en Análisis Genético Familiar

Mutaciones puntuales asociadas a Trombofilia

• La enfermedad tromboembólica venosa es un problema médico mayorpor su alta frecuencia, importante mortalidad y gran morbilidad.

• El abordaje clínico-terapeútico más racional para disminuir lamorbimortalidad es la prevención.

• Es esencial la identificación de pacientes con riesgo aumentado dedesarrollar trombosis.

Grupo 1: Deficiencias hereditarias de factores inhibidores de la coag.

Pobl. gral. Pacientes Tipo de mutación

Def. Proteína C 0,2-0,5% 2-5% Heterogénea (>160)Def. Proteína S 0,1% 2-5% Heterogénea (>69)Def. Antitrombina <0,1% 1-2% Heterogénea (>79)

Grupo 2: Desórdenes hereditarios asociados a un aumento del nivel de factores de la coagulación

Pobl. gral. Pacientes Tipo de mutación

FV Leiden 1-5% 20-60% PuntualFII 20210A 1-3% 10-15% Puntual

niveles FVIII, IX y XI niveles Lipoproteína A

Otros:Hiperhomocisteinemia - MTHFR C677TDeficiencia plasminógeno

Principales condiciones protrombóticas hereditarias

Mutación de Leiden en Factor V

• RPCA: respuesta anticoagulante pobre del plasma a la proteína C.

• Causa de más del 90% de los casos de resistencia a PCA.

Extracción de ADN a partir de sangre periférica

Amplificación por PCR de la región codificante

del sitio de clivaje para PCA

Digestión del producto de PCR con enzima de restricción Mnl I

Electroforesis en gel de agarosa

Exón 10 Intrón 10

• La transición de G a A en laposición 1691 está asociada a lapérdida de uno de los sitios Mnl I.

Producto PCR: 147 pb

Diagnóstico Molecular de mutación de Leiden

Alelo normal

Alelo mutado

Gel:

N/N M/M N/M

122 pb

85 pb

37 pb

25 pb

• La transición de G a A en laposición 1691 está asociada ala pérdida de uno de los sitiosMnl I.

Diagnóstico Molecular de mutación de Leiden

25 122

25 37 85

PM 1 2 3 4 5 6 7 M C- C+

Mutación 20210A en Factor II

• Mutación puntual: G por A en la posición 20210 de la 3´-UTR

Niveles incrementados de protrombina

plasmática funcional

• Prevalencia en población gral.: 1-3%

• Se detecta en el 10-15% de los pacientes con trombofilia

• Heterocigotas: riesgo incrementado 3-4 veces de sufrir TV.

Mutación 20210A en Factor II

• Mutación puntual: G por A en la posición 20210 de la 3´-UTR

Niveles incrementados de protrombina

plasmática funcional

Diagnóstico Molecular de mutación de 20210A

Extracción de ADN a partir de sangre periférica

Amplificación por PCR de la región 3´-UT

con primer mutado

Digestión del producto de PCR con enzima de restricción Hind III

Electroforesis en gel de agarosa

Producto PCR: 506 pb

Exón 14 3´-UT

---------TTCGAA----

---------AAGCTT----

---------CTCGAA---

---------GAGCTT---

Mutado

Normal

Gel:

406 pb

Alelo normal

Alelo mutado

N/N M/M N/M

383 pb

23 pb

• La transición de G a A en laposición 20210 está asociadaa la aparición de un sitio HindIII.

Diagnóstico Molecular de mutación de 20210A

100 383 23

100 406

Deficiencias hereditarias de inhibidores de la coagulación

• Deficiencia de proteína C, proteína S y antitrombina III.

• Prevalencia: <1% de la población general.

• Juntos representan el 5-10% de las alteraciones genéticas

encontradas en pacientes con trombosis venosa.

• Asociadas a un mayor riesgo de sufrir trombosis, manifestándose

como púrpura fulminante en neonatales homocigotas con deficienciacompleta.

Proteína C: > 160 mutaciones

Antitrombina: > 79 mutaciones

Proteína S: > 69 mutaciones

• Deficiencias difíciles de diagnosticar a nivel molecular

Trombosis venosa como enfermedad multifactorial

• En muchos pacientes se identifican más de un factor de riesgo genético y/o adquirido.

• La combinación de factores genéticos con ambientales ejerce un efecto aditivo sobre el riesgo a desarrollar trombosis.

• Condiciones trombofílicas ambientales o adquiridas:

- inmovilidad - estado post operatorio

- cáncer - uso de anticonceptivos orales

- tabaquismo - embarazo

- obesidad - terapia estrogénica

- síndrome antifosfolipídico

Importancia del diagnóstico de mutaciones asociadas a trombofilia

• Determinar causa del evento trombótico en el paciente.

• Detectar población de riesgo: medicina preventiva.

• ¿A quién se debe realizar el estudio?:

- Trombosis venosa en jóvenes < de 45 años

- Eventos trombóticos reiterados

- Pérdida de embarazo recurrente

- Previo a cirugía mayor, embarazo, anticonceptivos orales o

terapia estrogénica con historia familiar o personal de trombosis

- Familiar portador.

La trombosis venosa debe ser encarada como una

enfermedad crónica, poligénica, donde la ocurrencia

de eventos trombóticos es el resultado de la

interacción de causas genéticas y adquiridas.

DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN EL FUTURO

MAPAS DE RESTRICCIÓN

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

•son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas

Tipos de enzimas de restricción

Sistemas tipo I

Una sola enzima (multimérica que posee 3

subunidades) reconoce la secuencia específica de

ADN, metila y restringe. Pero la restricción no ocurre

en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en

sitios distantes al de reconocimiento.

Sistemas tipo II

Enzimas diferentes realizan la restricción y modificación.

La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó

adyacente. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en

genética molecular puesto que permiten romper el ADN

en sitios específicos, y así, recuperar secuencias conocidas

Sistemas tipo III

Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima

oligomérica que realiza todas las actividades

enzimáticas, y rompen el DNA 25-27 bp, más allá del sitio de reconocimiento.

Ejemplos de enzimas de restricción tipo II

Mapa de restricción

presentación biomol 2

Documents