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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE

DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU

VARIABILIDADE DE Colletotrichum gloeosporioides e Colletotrichum acutatum EM SERINGUEIRA (Hevea brasiliensis)

JUAN FERNAN SIERRA HAYER Mestre, PhD. Agronomia – Proteção de Plantas

BOTUCATU – SP Novembro – 2015

ANTRACNOSE

SIERRA-HAYER & FURTADO, 2010 Flutriafol, Tebuconazol, Epoxiconazol + Piraclostrobina, Azoxistrobina + Ciproconazol e Propiconazol

Folhas, Ramos e Inflorescência

(Silveira & Cardoso, 1987)

ANTRACNOSE

ANTRACNOSE

Painéis de sangria (Silveira et al., 1992)

ANTRACNOSE

Furtado

Fruto (Furtado,

2008)

ANTRACNOSE

Furtado, 1989

Mirassolândia

Furtado, 2009

OBJETIVO PRINCIPAL

C. gloeosporioides

C. acutatum

Filogenéticas

Populacionais

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção e Preservação dos Isolados

Identificação Espécie Hospedeiro Tecido Local Sigla

J01 C. gloeosporioides Hevea brasiliensis Galhos Brasil - São Paulo BRA-SP J02 C. acutatum Hevea brasiliensis Galhos Brasil - São Paulo BRA-SP J03 C. acutatum Hevea brasiliensis Galhos Brasil - São Paulo BRA-SP J04 C. gloeosporioides Hevea brasiliensis Painel Brasil - São Paulo BRA-SP J05 C.gloeosporioides Hevea brasiliensis Fruto Brasil - São Paulo BRA-SP J06 C. acutatum Hevea brasiliensis Galhos Brasil - São Paulo BRA-SP J07 C. acutatum Hevea brasiliensis Folha Brasil - São Paulo BRA-SP J09 C. acutatum Hevea brasiliensis Fruto Brasil - São Paulo BRA-SP J10 C. acutatum Hevea brasiliensis Galhos Brasil - São Paulo BRA-SP J11 C. acutatum Hevea brasiliensis Painel Brasil - São Paulo BRA-SP J12 C. acutatum Hevea brasiliensis Folha Brasil - São Paulo BRA-SP J13 C. gloeosporioides Hevea brasiliensis Fruto Brasil - São Paulo BRA-SP J14 C. acutatum Hevea brasiliensis Galhos Brasil - São Paulo BRA-SP J15 C. gloeosporioides Hevea brasiliensis Painel Brasil - São Paulo BRA-SP J16 C. gloeosporioides Hevea brasiliensis Galhos Brasil - São Paulo BRA-SP J17 C. gloeosporioides Hevea brasiliensis Galhos Brasil - São Paulo BRA-SP J18 C. acutatum Hevea brasiliensis Folha Brasil - São Paulo BRA-SP J19 C. acutatum Hevea brasiliensis Galhos Brasil - São Paulo BRA-SP

Identificação Molecular

5.2.1 Isolamento do DNA genômico

(NaCl 0,5M; EDTA 0,05M; Tris-HCl 0,1M pH 8,0; β-mercaptoetanol 0,2%)

Dellaporta et al,. 1983

Quantificação e diluição do DNA

Análise por PCR

Calnt2 (5’- GGG GAA GCC TCT CGC GG-3’) ITS4 (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’) Sreenivasaprasad et al., (1996).

Cglnt (5’- GGC CTC CCG CCT CCG GGC GG-3’) ITS4 (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') Mills, Sreenivasaprasad e Brown (1992).

Análise por PCR

ITS1 (5’- TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) ITS4 (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') White et al., (1990)

(O’Donnell, 1992)

Purificação dos produtos de PCR

Reação de Sequenciamento

Análise das Sequências

Sequências consenso

Metodologia da análise MB ML NJ

Confecção da matriz

Análises filogenéticas

Análise populacional e estatística

Resultados

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78 C

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JX902423 Colletotric

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hum cymbidiico

la

FJ968604 Colletotrichum boninense

JN715846 Colletotric

hum karsti

i

JQ005174 Colletotric

hum colombiense

JQ005173 Colletotrichum colombiense

JN715844 Colletotrichum brassicicola

9590 JQ926743 Colletotrichum boninense

C. gloeosporioides J78


JQ658875 Colletotrichum boninense


HQ022474 Colletotrichum aff boninense

JQ005206 Colletotrichum karstii

JQ005222 Colletotrichum annellatum



100100

100

AY266404 Colletotrichum gloeosporioides

HM999897 Colletotrichum gloeosporioides

JN050243 Colletotrichum thailandicum


10010099 JN715847 Colletotrichum kahawae subsp ciggaro

FJ972608 Colletotrichum kahawae



JN715838 Colletotrichum kahawae subsp ciggaro

KC845289 Colletotrichum crassipes

JX009426 Colletotrichum spGU066671 Colletotrichum gloeosporioidesGU066645 Colletotrichum gloeosporioidesC. gloeosporioides J01 GU066699 Colletotrichum gloeosporioidesJX515292 Colletotrichum ignotum isolateC. gloeosporioides J05KC845285 Colletotrichum siamense isolateFJ968596 Colletotrichum gloeosporioides

EU294027 Colletotrichum gloeosporioides

C. gloeosporioides J52 FJ968590 Colletotrichum gloeosporioides

FJ968589 Colletotrichum gloeosporioides

JX010286 Colletotrichum theobromicola

FR717698 Colletotrichum fragariae

JN390867 Colletotrichum sp




JX844081 Colletotrichum gossypii



JQ658886 Colletotrichum musae


JX476955 Colletotrichum gloeosporioides

KF112043 Colletotrichum gloeosporioides


99

KC820802 Colletotrichum queenslandicum

KC820802 Colletotrichum queenslandicum 2

EF025955 Colletotrichum gloeosporioides


100

JQ814344 Colletotrichum gloeosporioides

JN715843 Colletotrichum fructicola isolate

AF488777 Colletotrichum gloeosporioides


FJ972614 Colletotrichum siamense



AB704781 Colletotrichum gloeosporioides

FJ884085 Colletotrichum sp




GU223176Glomerella cingulata

GU223178 Glomerella cingulata


GU223177 Glom

erella cingulata

9999

100

DQ463366 Colletotrichum gloeosporioides

DQ463367 Colletotrichum

gloeosporioides

JQ814342 Colletotrichum

gloeosporioides

FR717706 Colletotrichum fructicola


theobromicola


JN390876 C

olletotrichum gloeosporioides

HQ

022392 Colletotrichum

cf gloeosporioides

KC845290 C

olletotrichum fructicola

JN007803 C


JQ814343 C


JQ814365 C


JQ814340 C


AY739025 Colletotrichum

gloeosporioides

KC


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HQ


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HM


gloeosporioides

HM


gloeosporioides

FJ884083 Colletotrichum

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AY


gloeosporioidesC

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gloeosporioides


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JX010194 Colletotrichum

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gloeosporioides


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olletotrichum asianum

100


GU


gloeosporioides


siamense

JQ814363 C


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AY245021 Glom

erella cingulata


gloeosporioides

FJ798596 Glom

erella cingulata

FJ798598 Glom

erella cingulata

100


FJ798602 Glomerella cingulata

80


HQ264184 Colletotrichum gloeosporioides

GU066676 Colletotrichum gloeosporioides

HE655511 Colletotrichum siamense

FR717705 Colletotrichum gloeosporioides

89

100

100

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C. acu

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J53

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C. acu

tatum J03

C. acutatum J7

7

C. acutatum J8

3

C. acutatum J31

EU16890 Glomerella acutata

AM404279 Glomerella acutata

JN715834 Colletotrichum godetiae isolate

AM991134 Glomerella acutata


KC845287 Colletotrichum fioriniae100

FN566877 Glomerella acutata


AF521210 Glomerella acutata

JN543070 Glomerella acutata 86

FJ025802 Glomerella acutata

C. acutatum J1181

C. acutatum J20C. acutatum J81 C. acutatum J97 C. acutatum J50

C. acutatum J49 C. acutatum J43C. acutatum J58C. acutatum J42C. acutatum J85C. acutatum J79 C. acutatum J82 C. acutatum J51C. acutatum J23C. acutatum J48C. acutatum J07

C. acutatum J86 C. acutatum J32C. acutatum J12C. acutatum J35C. acutatum J84 C. acutatum J38C. acutatum J33

C. acutatum J69

C. acutatum J02

C. acutatum J24

C. acutatum J25

C. acutatum J29

C. acutatum J91

C. acutatum J10

C. acutatum J96

C. acutatum J87

C. acutatum J80 92

C. acutatum J18

C. acutatum J09

JN543069 Glomerella acutata


AF534467 Glomerella acutata strain

N715840 Colletotrichum sp

C. acutatum J06

C. acutatum J39

C. acutatum J55

C. acutatum J40

C. acutatum J72

JQ814354 Glomerella acutata

C. acutatum J14

C. acutatum J47

AB269945 Glomerella acutata

C. acutatum J92

KC816048 Colletotrichum acutatum

C. acutatum J41



JQ948290 Colletotrichum laticiphilum

C. acutatum J59


C. acutatum J37

C. acutatum J26


HQ330982 Glomerella acutata

GU120390 Glom

erella acutata

EF221832 Glom

erella acutata

EF221831 Glom

erella acutata

EU727318 Glom

erella acutata

EU727317 Glom

erella acutata

AF488778 Glom

erella acutata

DQ

463362 Glom

erella acutata

JQ948289 C

olletotrichum laticiphilum

FJ968598 Glom

erella acutata

EF025968 Glom

erella acutata

100

C. acutatum

C. gloeosporioides

Mister Bayer

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59

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hum boninense




92 JQ005206 Colletotrichum karstii

HQ022474 Colletotrichum aff boninense



94 C. gloeosporioides J75

JQ005222 Colletotrichum annellatum

7597

JN715844 Colletotrichum brassicicola



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FJ968604 Colletotrichum boninense

JX902424 Colletotrichum cymbidiicola

JX902423 Colletotrichum cymbidiicola

93 FJ968605 Colletotrichum boninense

JN715846 Colletotrichum karstii

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KC845289 Colletotrichum crassipes

C. gloeosporioides J13C. gloeosporioides J15 FJ968590 Colletotrichum gloeosporioidesFJ968589 Colletotrichum gloeosporioidesFJ884081 Colletotrichum gloeosporioidesFR717698 Colletotrichum fragariae54 JX010285 Colletotrichum theobromicolaJN390867 Colletotrichum spJX010286 Colletotrichum theobromicola


C. gloeosporioides J27JX844081 Colletotrichum gossypii

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AB269945 Glomerella acutata

C. acutatum J26C. acutatum J41C. acutatum J59C. acutatum J14

KC816048 Colletotrichum acutatumC. acutatum J25 C. acutatum J18C. acutatum J33C. acutatum J12C. acutatum J02 C. acutatum J69 C. acutatum J58C. acutatum J31C. acutatum J53C. acutatum J38C. acutatum J76

C. acutatum J66 C. acutatum J83 C. acutatum J82 C. acutatum J84 C. acutatum J96 C. acutatum J97 C. acutatum J50

C. acutatum J03

C. acutatum J10

C. acutatum J77



C. acutatum J92



C. acutatum J20

C. acutatum J09

C. acutatum J29

C. acutatum J24

C. acutatum J42



C. acutatum J11



59



C. acutatum J86

C. acutatum J32

C. acutatum J43

C. acutatum J49

C. acutatum J91


C. acutatum J47

C. acutatum J48

C. acutatum J07

C. acutatum J51

C. acutatum J23

C. acutatum J87

C. acutatum J80

C. acutatum J88

C. acutatum J62

C. acutatum J19

C. acutatum J85

C. acutatum J79

JQ814354 G

lomerella acutata

JQ814355 G

lomerella acutata

C. acutatum J40

C. acutatum

J55

C. acutatum

J39

C. acutatum

J72

C. acutatum

J37

C. acutatum

J35

C. acutatum

J81

99

Máxima Verossimilhança

C. acutatum

C. gloeosporioides

GU8

1050

9 G

lom

erel

la c

ingu

lata

C. g

loeo

spor

ioid

es J

1795

JX66

9449

Col

leto

trich

um g

loeo

spor

ioid

66

JQ65

8869

Col

leto

trich

um c

livia

e st

rain

65

JX66

9445

Col

leto

trich

um g

loeo

spor

ioid

e

77

JX66

9450

Col

leto

trich

um g

loeo

spor

ioid

e

90

JN05

0238

Col

leto

trich

um b

revi

spor

um

JN05

0239

Col

leto

trich

um b

revi

spor

um

EU62

2278

Col

leto

trich

um la

gena

rium

9910

0

100

JX54

6816

Col

leto

trich

um li

ndem

uthi

anum

JX54

6817

Col

leto

trich

um lin

dem

uthi

anum

JX54

6819

Col

leto

trich

um lin

dem

uthi

anum

JX54

6818

Col

leto

trich

um lin

dem

uthi

anum

9610

0

61

JN05

0241

Col

leto

trich

um tr

opici

cola

JN05

0240

Col

leto

trich

um tr

opici

cola

100

HQ02

2474

Col

leto

trich

um a

ff bo

nine

nse

JQ65

8876

Col

leto

trich

um b

onin

ense

JQ65

8875

Col

leto

trich

um b

onin

ense

52

JQ00

5206

Col

leto

trich

um k

arst

ii

C. g

loeo

spor

ioid

es J

75

73

JQ00

5222

Col

leto

trich

um a

nnel

latum

C. g

loeos

porio

ides

J73

C. g

loeos

porio

ides

J74

JQ92

6743

Coll

etot

richu

m b

onine

nse

C. g

loeos

porio

ides J

78

87

FJ96

8605

Coll

etot

richu

m b

onine

nse

JQ00

5173

Coll

etotric

hum

colom

biens

e

JQ00

5174

Coll

etotric

hum

colom

biens

e

JN71

5844

Coll

etotric

hum br

assic

icola

52

FJ96

8604

Coll

etotric

hum bo

ninen

se

JN71

5846

Coll

etotric

hum ka

rstii

JX90

2424

Coll

etotric

hum cy

mbidiic

ola

JX90

2423

Coll

etotric

hum cy

mbidiic

ola

91

100

AB7051

52 C

olleto

trichu

m demati

um

HM4501

29 C

olleto

trichu

m caps

ici

83

FJ968

602 C

olleto

trichu

m caps

ici

73

JQ65

8871

Coll

etotric

hum ja

smini

genu

m


ncatum iso

late

EU781666 Colletotrichum ca

psici


psici st

rain

98


psici st

rain


hum capsic

i


hum capsic

i

FJ968579 Colletotrichum capsici

JX971163 Colletotrichum tru

ncatum

JX971162 Colletotrichum tru

ncatum

GU227879 Colletotrichum truncatum

HQ437663 Colletotrichum truncatum

98

99

77





8799

9851

JX567508 Colletotrichum dematium

KC913201 Colletotrichum spaethianum

JX567509 Colletotrichum dematium

98 JQ658887| Colletotrichum sublineola

EU672822 Glomerella graminicola

9962 GU227813 Colletotrichum trichellum

DQ286152 Colletotrichum trichellum

100 AB242422.2 Glomerella tucumanensis

AB242419.2 Glomerella tucumanensis

9950FJ884083 Colletotrichum sp





FJ972607 Colletotrichum kahawaeJN715838 Colletotrichum kahawae subsp ciggaro

FJ972608 Colletotrichum kahawaeFJ968597 Colletotrichum kahawae

55

KC845289 Colletotrichum crassipesJN390867 Colletotrichum spC. gloeosporioides J52C. gloeosporioides J13FJ968590 Colletotrichum gloeosporioidesFJ968589 Colletotrichum gloeosporioides



FR717698 Colletotrichum fragariae





8973


JX476955 Colletotrichum gloeosporioides


FR717705 Colletotrichum gloeosporioides

HE655511 Colletotrichum siamense




61GU066645 Colletotrichum gloeosporioides




96

KC845285 Colletotrichum siamense isolate


JX515292 Colletotrichum ignotum isolate


JX009426 Colletotrichum sp






63




JX010256 Colletotrichum siamense








HQ264184 Colletotrichum gloeosporioides



AY245021 Glom

erella cingulata


KC820803 Colletotrichum asianum

FJ972615 Colletotrichum asianum

68JX402175 Colletotrichum

gloeosporioides

80JX010194 Colletotrichum

asianum


asianum

6194

FJ798598 Glom

erella cingulata

FJ798596 Glom

erella cingulata

79JQ


gloeosporioides

GU223177 G

lomerella cingulata

GU

223179 Glom

erella cingulata

76G

U223178 G

lomerella cingulata

56G

U223176G

lomerella cingulata

90JQ


gloeosporioides

DQ


gloeosporioides

DQ


gloeosporioides


gloeosporioidesEU


gloeosporioidesJQ


gloeosporioidesAF488777 C


JN715843 C

olletotrichum fructicola isolate

AB704781 Colletotrichum

gloeosporioidesC

. gloeosporioides J22FJ972614 C

olletotrichum siam

enseFJ968592 C


JQ814337 C


icola


97

JQ814340 C


80



siamense


FR717706 Colletotrichum fructicola


HQ022504 Colletotrichum

cf gloeosporioides

HQ022503| Colletotrichum

cf gloeosporioides

HM562710 Colletotrichum

gloeosporioides



JN390876 Colletotrichum gloeosporioides

JN007803 Colletotrichum fructicola

HM562711 Colletotrichum

gloeosporioides








JQ814332 Colletotrichum theobromicola


FJ798602 Glomerella cingulata


93

56

100

C. acu

tatum

J50

C. acu

tatum

J97

C. acu

tatum

J81

C. acu

tatum J80

C. acu

tatum J48

C. acu

tatum J96


C. acutatum J1

1



78

C. acutatum J91

C. acutatum J69

C. acutatum J85

C. acutatum J19

C. acutatum J62

C. acutatum J23

C. acutatum J07

C. acutatum J84

C. acutatum J83

C. acutatum J82

C. acutatum J76

C. acutatum J66C. acutatum J53C. acutatum J42C. acutatum J38C. acutatum J33C. acutatum J31C. acutatum J29C. acutatum J24C. acutatum J20C. acutatum J18C. acutatum J12C. acutatum J25C. acutatum J58C. acutatum J09C. acutatum J02C. acutatum J03

C. acutatum J10C. acutatum J77C. acutatum J32C. acutatum J43

EU16890 Glomerella acutataC. acutatum J51


C. acutatum J86

C. acutatum J55

C. acutatum J39


C. acutatum J40

DQ463362 Glomerella acutata

C. acutatum J49


C. acutatum J35

56


C. acutatum J37


C. acutatum J47


C. acutatum J87

C. acutatum J79


C. acutatum J8856

C. acutatum J06


N715840 Colletotrichum sp





GU120390 Glomerella acutata



94


C. acutatum J26

C. acutatum J92





C. acutatum J72

C. acutatum J59

C. acutatum J41

KC816048 Colletotrichum acutatum

C. acutatum J14

AB269945 Glom

erella acutata

FJ968601 Glom

erella acutata

JN715834 Colletotrichum godetiae isolate

AM404279 G

lomerella acutata

AM991134 G

lomerella acutata

EU168904 Glom

erella acutata

KC845287 Colletotrichum fioriniae

5469

100

Neighbour-Joining

C. acutatum

C. gloeosporioides

USA

EU

1689

02C

a

BRASP J14Ca

0.005

Brasil China

Colômbia Equador Tailândia México Vietnã USA

Austrália Índia

Portugal

Neighbour-Joining entre amostras de C. acutatum

Neighbour-Joining entre amostras de C. gloeosporioides

BR

AM

S J5

2Cg

COL AY245021Gc

BR

ASP J22C

g

0.005

Brasil Peru Colômbia Vietnã Índia China USA Malásia Bolívia Nova Zelândia Angola Equador

Sri Lanka México Itália Kênia Guatemala

Tailândia

Neighbour-Joining entre amostras de C. acutatum

BR

AB

A J9

1Ca

0.005

FOLHA

FRUTO PAINEL

GALHOS

Neighbour-Joining entre amostras de C. gloeosporioides

BR

AS

P J0

4Cg

0.01

FOLHA FRUTO PAINEL

GALHOS

DG DN Nh N

America do Sul 0,8187 +/- 0,0454 0,042303 +/- 0,023622 28 68

Ásia 0,9455 +/- 0,0659 0,047866 +/- 0,028640 9 11

Europa 0,6667 +/- 0,3143 0,020408 +/- 0,019241 2 3

America Centro Norte 0,9000 +/- 0,1610 0,036735 +/- 0,026119 4 5

Oceania 0,0000 +/- 0,0000 0,000000 +/- 0,000000 1 3

Tabela 7. Diversidade Gênica (DG), Diversidade Nucleotídica (DN), Número de Haplótipos (Nh) e Número amostral (N) , nos grupos de C. acutatum.

H1

AMERICA DO SUL ÁSIA

EUROPA AMERICA CENTRO NORTE

OCEANIA

C. acutatum calculada pelo método Median-Joining.

DG DN Nh N

Europa 0,0000 +/- 0,0000 0,000000 +/- 0,000000 1 2

Oceania 0,0000 +/- 0,0000 0,000000 +/- 0,000000 1 2

Africa 0,6667 +/- 0,2041 0,017391 +/- 0,014589 2 4

America do Sul 0,8932 +/- 0,0201 0,076364 +/- 0,039305 27 112

America Centro Norte 0,8736 +/- 0,0310 0,105547 +/- 0,054607 8 30

Ásia 0,9227 +/- 0,0111 0,100270 +/- 0,050646 25 128

Tabela 10. Diversidade Gênica (DG), Diversidade Nucleotídica (DN), Número de Haplótipos (Nh) e Número amostral (N), nos grupos de C. gloeosporioides.

C. gloeosporioides calculada pelo método Median-Joining

AMERICA DO SUL

ÁSIA

EUROPA

AMERICA CENTRO NORTE

OCEANIA

ÁFRICA

CONCLUSÕES

Estudos de análises filogenéticas e estudo populacional revelam a confiabilidade dos resultados. Mostrando que é possível visualizar grupos de haplótipos distintos dentro de espécies;

O haplótipo H1 de C. acutatum é uma linhagem aparentemente exclusiva da região americana;

A rede de haplótipos permite a visualização dos haplótipos em grupos e sua dispersão genética nas localidades;

CONCLUSÕES

A análise de rede de haplótipos de tecidos não foi estatisticamente significativa, pelo número de amostras serem insuficientes;

Dentro do trabalho podemos observar como existe uma alta variabilidade genética e diversidade espalhada por todo o mundo;

Então vamos plantar!!!!

Muito obrigado

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