preparo de amostras visando a determinação de...

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Preparo Preparo de de amostras amostras visando visando a a determinação de determinação de proteínas proteínas Marco Marco Aurélio Aurélio Z Z ezzi ezzi Arruda Arruda www. www. gepam gepam . . iqm iqm . . unicam unicam . . br br zezzi zezzi @ @ iqm iqm .unicamp. .unicamp. br br

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Preparo Preparo de de amostras amostras visando visando a a determinação de determinação de proteínasproteínas

Marco Marco AurélioAurélio ZZezziezzi ArrudaArrudawww.www.gepamgepam..iqmiqm..unicamunicam..brbr

zezzizezzi@@iqmiqm.unicamp..unicamp.brbr

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

GENOMA GENOMA sseqüenciamentoeqüenciamento de bases do DNA de bases do DNA (Genoma humano: 3 bilhões de bases e 40.000 genes)(Genoma humano: 3 bilhões de bases e 40.000 genes)

Genoma: lista de peças de um carro Genoma: lista de peças de um carro -- não explica não explica como as peças funcionam juntas como as peças funcionam juntas

Marco A. Z. Arruda

Marco A. Z. ArrudaINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOPROTEOMA PROTEOMA representação funcional do genomarepresentação funcional do genoma

Um genoma com diferentes Um genoma com diferentes proteomasproteomasProteoma Proteoma é um sistema dinâmicoé um sistema dinâmico

Proteínas Proteínas papel crucial em processos biológicos: papel crucial em processos biológicos: catálise, transmissão de sinais e apoio estruturalcatálise, transmissão de sinais e apoio estrutural

Determinar as proteínas expressas, suas composições, Determinar as proteínas expressas, suas composições, estruturas e funçõesestruturas e funções

Marco A. Z. ArrudaINTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

Nobel de química (2004)Nobel de química (2004)

Irwin Irwin Rose (Rose (UnivUniv. Califórnia, EUA). Califórnia, EUA)Aaron Aaron CiechanoverCiechanover e e Avram Hershko Avram Hershko

(Instituto (Instituto TechnionTechnion, , HaifaHaifa, Israel), Israel)

degradação de proteínas no corpo humanodegradação de proteínas no corpo humanoubiquitinaubiquitina

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArrudaINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOO PREPARO DA AMOSTRA VISAO PREPARO DA AMOSTRA VISA

1) Solubilizar as proteínas de forma efetiva;1) Solubilizar as proteínas de forma efetiva;

2) Evitar a agregação;2) Evitar a agregação;

3) Remover os interferentes;3) Remover os interferentes;

4) Elevar a concentração da proteína de interesse para 4) Elevar a concentração da proteína de interesse para possibilitar a sua determinação;possibilitar a sua determinação;

5) Evitar modificações químicas5) Evitar modificações químicas

pH, temperatura, enzimas e armazenamento;pH, temperatura, enzimas e armazenamento;

6) Purificar as proteínas6) Purificar as proteínas

detdet. seqüências de aminoácidos, formação de . seqüências de aminoácidos, formação de cristais cristais real unidade funcionalreal unidade funcional

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

Diferentes estratégias Diferentes estratégias no no preparopreparo de de amostras visando amostras visando a a

determinaçãodeterminação de de proteínasproteínas

Salting outSalting outDiáliseDiáliseExtração mediada por surfactantesExtração mediada por surfactantesCromatografia Cromatografia de de filtração emfiltração em gelgelCromatografia Cromatografia de de trocatroca--iônicaiônicaCromatografia Cromatografia de de afinidadeafinidadeHPLCHPLCEletroforeseEletroforese emem gel gel 1 D e 2 D1 D e 2 DEletroforese capilarEletroforese capilar

Marco A. Z. Arruda

Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínasproteínas

AmostraAmostra

Ruptura celularRuptura celular

SolubilizaçãoSolubilização

CentrifugaçãoCentrifugação

FracionamentoFracionamento

Análise/Análise/DetDet..Marco A. Z. Arruda

Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínasproteínas

AmostraAmostra

Ruptura celularRuptura celular

SolubilizaçãoSolubilização

CentrifugaçãoCentrifugação

FracionamentoFracionamento

Análise/Análise/DetDet..Marco A. Z. Arruda

RupturaRuptura CelularCelularA proteína têm de ser liberada da célula A proteína têm de ser liberada da célula

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

Evaluation of Protein Extraction Evaluation of Protein Extraction Procedures in Procedures in PhytotherapicPhytotherapic Medicines

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

MedicinesCristianaCristiana Schmidt de Magalhães, Lira Celeste Alves, Marco Aurélio Schmidt de Magalhães, Lira Celeste Alves, Marco Aurélio ZezziZezzi ArrudaArruda

PPóó ((ChinaChina))

CapsulasCapsulas, lot, lote #e #333962, 333962,

LabLab. . HerbariumHerbarium

Amostras:Amostras:

••Ginkgo Ginkgo bilobaebilobae

••Spirulina maximaSpirulina maxima

••Aesculus hippocastanumAesculus hippocastanum I.

Folhas de uma Folhas de uma áárvore (rvore (EFOAEFOA););

Extrato seco (Extrato seco (ChinaChina))

PPóó (Alemanha)(Alemanha)

inin natura natura (adquirida em (adquirida em mercado local Amercado local Alfenaslfenas)

I.

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda )

APLICAÇÕESAPLICAÇÕESEvaluation of Protein Extraction Evaluation of Protein Extraction

Procedures in Procedures in PhytotherapicPhytotherapic MedicinesMedicinesCristianaCristiana Schmidt de Magalhães, Lira Celeste Alves, Marco Aurélio Schmidt de Magalhães, Lira Celeste Alves, Marco Aurélio ZezziZezzi ArrudaArruda

agitação centrifugação 0oC

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

1

2

3

4

5

6

diálise centrifugação 0oCagitação

centrifugação 0oC

diálise centrifugação 0oC

centrifugação 0oCagitação

centrifugação 0oC

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

Determinação de proteínas totais (mg g-1): Bradford (n=3)

221.800 ±0.405132.280 ±0.36557.640 ±0.36591.940 ±0.36566.360 ±0.25073.920 ±0.488132.940 ±0.48854.780 ±0.23299.424 ±0.379Spirul.pó

159.800 ±0.405123.060 ±0.36568.020 ±0.36589.400 ±0.365144.360 ±0.12276.220 ±0.488157.600 ±0.488118.620 ±0.232116.340 ±0.379Spirul.caps.

2.736 ±0.0152.699 ±0.0262.595 ±0.0464.462 ±0.0617.899 ±0.0181.439 ±0.0123.643 ±0.0353.800 ±0.0174.282 ±0.027Ginkgo folhas

34.630 ±0.10126.875 ±0.09122.480 ±0.09121.400 ±0.09115.672 ±0.0313.639 ±0.01214.220 ±0.06110.704 ±0.02912.536 ±0.047Ginkgo ext. seco

22.760 ±0.10112.250 ±0.18315.068 ±0.06115.881 ±0.06113.682 ±0.0258.263 ±0.04114.782 ±0.0412.970 ±0.0199.343 ±0.031Aesc.pó

55.210 ±0.10135.890 ±0.18315.115 ±0.06133.790 ±0.09123.047 ±0.04217.412 ±0.08130.273 ±0.08112.221 ±0.03918.137±0.063Aesc.natura

6 tampão

3 tampão

1 tampão

6água

5 água

4 água

3 água

2água

1 água

Amost.

melhor resultadopior resultado

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínasproteínas

AmostraAmostra

Ruptura celularRuptura celular

SolubilizaçãoSolubilização

CentrifugaçãoCentrifugação

FracionamentoFracionamento

Análise/Análise/DetDet..Marco A. Z. Arruda

SolubilizaçãoSolubilização

Adição de tampãoAdição de tampão((surfactantessurfactantes, , caotrópicoscaotrópicos,,

redutores e inibidores)

ββ--MercaptoetanolMercaptoetanol ououDitiotreitol Ditiotreitol reduzir pontes reduzir pontes

dissulfdissulfíídricasdricas e separae separaçãçãoode cadeias polipeptde cadeias polipeptíídicas

redutores e inibidores)dicas

TemperaturaTemperatura

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

8500 g8500 g(13000 (13000 rpmrpm))

5 min

300 mg300 mg+ 300 + 300 µµL L tampão*tampão*

pH 6,8pH 6,8

Agitação porAgitação porefeito efeito vortexvortex

20 min20 min

100100ooCC10 min10 min

75 mg75 mg

75 mg75 mg

Calo deCalo deCitrusCitrus

0 0 ooCC

APLICAÇÕESAPLICAÇÕESVerbiVerbi, F. M. , F. M. etet alal., JBBM, aceito., JBBM, aceito

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

AplicaçãoAplicaçãono gelno gel

*tampão: 60 *tampão: 60 µµL SDS, 30 L SDS, 30 µµL glicerol, L glicerol, 15 15 µµL L ββ--mercaptoetanolmercaptoetanol, 8 , 8 µµL L bromofenolbromofenol, 38 , 38 µµL L tristris--HClHCl,,

150 150 µµL L áágua 5 mingua

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

ChanChan etet alal. . ProteomicsProteomics, 2(2002)1169, 2(2002)1169

•• Otimizaram as condiOtimizaram as condiçõções de preparo para es de preparo para Prorocentrum triestinum Prorocentrum triestinum (dinoflagelado) visando an(dinoflagelado) visando anáálise lise por eletroforese 2por eletroforese 2--D.D.

•• ParParââmetros avaliados: rompimento celular, extrametros avaliados: rompimento celular, extraçãção o independente e seqindependente e seqüüencial, soluencial, soluçõções es solubilizantessolubilizantes e e agentes redutores.agentes redutores.

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

Células de P. triestinumcom tampão TRIS

Homogeneização usando esferas de vidro Sonicação

Extração Seqüenciada

Precipitado

Tampão (uréia, tiouréia, CHAPS, TRIS e inibidor) (3)

SOBRENADANTES

Tampão ( uréia, CHAPS, TRIS e inibidor) (2)

Precipitado

Tampão TRIS (1)

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

Extrações Extrações independentesindependentes

Tampão (1)Tampão (1) PrecipPrecip. TCA/. TCA/AcetAcet..

CentrifugaçãoCentrifugação

SOBRENADANTESSOBRENADANTESPrecipitadoPrecipitado

SolubilizaçãoSolubilização(uréia e CHAPS)(uréia e CHAPS)

Tampão (2)Tampão (2) Tampão (3)Tampão (3)

SOBRENADANTESSOBRENADANTES

CentrifugaçãoCentrifugação

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArrudaAPLICAÇÕESAPLICAÇÕES

Células de Células de P. P. triestinumtriestinumcom tampão TRIScom tampão TRIS

PrecipitadoPrecipitado

AgAg. redutores DTT, TBP (. redutores DTT, TBP (tributilfosfinatributilfosfina) e ) e TCEP (TCEP (triscarboxietilfosfinatriscarboxietilfosfina) )

SOLUÇÕES SOLUBILIZANTESSOLUÇÕES SOLUBILIZANTES

a) 9,5 mol/L de uréiaa) 9,5 mol/L de uréiab) 8 mol/L de uréiab) 8 mol/L de uréiac) 5 mol/L de uréia + 2 mol/L de c) 5 mol/L de uréia + 2 mol/L de

tiouréiatiouréiad) 7 mol/L de uréia + 2 mol/L de d) 7 mol/L de uréia + 2 mol/L de

tiouréia tiouréia

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

•• RUPTURA CELULAR RUPTURA CELULAR –– sonicasonicaçãçãoo –– 10x mais eficiente 10x mais eficiente –– mais fmais fáácil de ser executadacil de ser executada

•• EXTRAEXTRAÇÃÇÃOO

–– SeqSeqüüenciada enciada -- 575 575 spotsspots..

–– Independente Independente -- 407 407 spots spots (TRIS)(TRIS)

•• SOLUSOLUÇÃÇÃO SOLUBILIZANTE O SOLUBILIZANTE –– 8 mol/L de ur8 mol/L de urééia;ia;tiourtiourééia ia -- apresentou apresentou spotsspots artificiais. artificiais.

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda•• AGENTE REDUTOR AGENTE REDUTOR -- TCEP TCEP

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

•• O procedimento otimizado foi usado em amostras O procedimento otimizado foi usado em amostras cultivadas em diferentes condicultivadas em diferentes condiçõções.es.

•• Foi possFoi possíível observar diferenvel observar diferençças na expressas na expressãão o protprotééica.ica.

COMENTCOMENTÁÁRIOSRIOS

•• Trabalho amplo Trabalho amplo –– avaliaram vavaliaram váários parrios parââmetros;metros;

•• Conseguiram estimar a eficiConseguiram estimar a eficiêência de cada ncia de cada procedimento.procedimento.

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínas

Marco A. Z. Arruda

AmostraAmostra

Ruptura celularRuptura celular

CentrifugaçãoCentrifugação

Análise/Análise/DetDet..

SolubilizaçãoSolubilização

proteínas

FracionamentoFracionamento

Marco A. Z. Arruda CentrifugaçãoCentrifugaçãoCoefCoef. de sedimentação. de sedimentação

s = m (1 s = m (1 -- υρυρ)/f)/f

massamassa coefcoef. de atrito. de atrito

força de flutuaçãoforça de flutuação(exercida pelo meio líquido)(exercida pelo meio líquido)

ProteínaProteínaInibidor pancreáticoInibidor pancreático

de tripsinade tripsinaCitocromo Citocromo CCMioglobinaMioglobina

Lactato desidrogenaseLactato desidrogenase

S (unidades S (unidades SvedbergSvedberg))11

1,831,831,971,977,54

PM (PM (kDakDa))6,5206,520

12,3112,3117,8017,80146,2se

dim

enta

ção

sedi

men

taçã

o

7,54 146,2

Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínasproteínas

AmostraAmostra

Ruptura celularRuptura celular

Marco A. Z. Arruda

CentrifugaçãoCentrifugação

FracionamentoFracionamento

Análise/Análise/DetDet..

SolubilizaçãoSolubilização

FracionamentoFracionamento

Marco A. Z. Arruda

ELETROFORESEELETROFORESE

•• Técnica de separação Técnica de separação –– custo reduzido;custo reduzido;

•• Suporte Suporte –– PAGE;PAGE;

•• AplicaAplica--se um campo elétrico;se um campo elétrico;

•• 11--D D –– IEF ou PM;IEF ou PM;

•• 22--D D –– IEF e PM.IEF e PM.

Preparo de AmostrasPreparo de Amostras

Presença de interferentes que afetam a migração:Presença de interferentes que afetam a migração:

-- elevadas concentrações salinas;elevadas concentrações salinas;

-- adição de DTT.adição de DTT.

Eletroforese 1Eletroforese 1--DD

Eletroforese Eletroforese –– SDSSDS--PAGEPAGEυυ = = EzEz/f/f

υυ = = velvel. de migração. de migraçãoE = E = intensintens. do campo. do campo

z = carga global da proteínaz = carga global da proteínaf = f = coefcoef. de atrito

SDSSDS--proteínas (cargas negativas)proteínas (cargas negativas)migramigraçãção no sentido o no sentido ananóódicodico

(parte baixa do gel)(parte baixa do gel)Poliacrilamida Poliacrilamida (?): a(?): açãção de peneiramentoo de peneiramento

separaseparaçãção conforme tamanhoo conforme tamanhoBoa sensibilidade: Boa sensibilidade: caca. 2 . 2 pmoles

. de atritopmoles

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

Eletroforese Eletroforese 22--DD

11aa dimensãodimensão

11aa dimensãodimensão::Separa de acordo com o ponto Separa de acordo com o ponto isoelétrico.isoelétrico.

22aa dimensãodimensão::Eletroforese Eletroforese -- SDSSDSSeparaSepara de acordo com o pesode acordo com o pesomolecular.

22aadi

men

são

dim

ensã

omolecular.

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

Eletroforese Eletroforese 22--D D possui resolução possui resolução para identificar milhares de para identificar milhares de spotsspotsde proteínas de proteínas

Marco A. Z. ArrudaEletroforese Eletroforese 22--DD

Marco A. Z. Arruda Eletroforese Eletroforese 22--DD -- ResultadosResultados

FracionamentoFracionamentoExtração mediada por surfactantes Extração mediada por surfactantes -- Ponto NuvemPonto Nuvem

As moléculas de surfactante possuem duas regiões distintas:uma delas apolar e outra polar ou iônica.

Cabeça Hidrofílica ⇒ parte damolécula de natureza POLAR ouiônica. (esta região apresenta solubilidade significativa em água)

neutro

iônico

catiônicos

aniônicos

anfóteros

Cauda Hidrofóbica ⇒ parte da molécula de natureza APOLAR (esta região não apresenta solubilidade em água) Marco A. Z. Arruda

FracionamentoFracionamentoExtração mediada por surfactantes Extração mediada por surfactantes -- Ponto NuvemPonto Nuvem

Estes agregados são denominados

micelas

A concentração onde inicia o processo de

formação das micelas é chamada de

concentração micelarcrítica, cmc (sendo uma propriedade

intrínseca de todos os surfactante)

Micelas:responsáveis

pela solubilização de

gorduras; interagem com

substâncias hidrofóbicas

Uma das características de

todos os surfactantes é a capacidade de

formar agregadosem solução aquosa

a partir de uma determinada

concentração

Marco A. Z. Arruda