preparo de amostras visando a determinação de...
TRANSCRIPT
Preparo Preparo de de amostras amostras visando visando a a determinação de determinação de proteínasproteínas
Marco Marco AurélioAurélio ZZezziezzi ArrudaArrudawww.www.gepamgepam..iqmiqm..unicamunicam..brbr
zezzizezzi@@iqmiqm.unicamp..unicamp.brbr
INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO
GENOMA GENOMA sseqüenciamentoeqüenciamento de bases do DNA de bases do DNA (Genoma humano: 3 bilhões de bases e 40.000 genes)(Genoma humano: 3 bilhões de bases e 40.000 genes)
Genoma: lista de peças de um carro Genoma: lista de peças de um carro -- não explica não explica como as peças funcionam juntas como as peças funcionam juntas
Marco A. Z. Arruda
Marco A. Z. ArrudaINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOPROTEOMA PROTEOMA representação funcional do genomarepresentação funcional do genoma
Um genoma com diferentes Um genoma com diferentes proteomasproteomasProteoma Proteoma é um sistema dinâmicoé um sistema dinâmico
Proteínas Proteínas papel crucial em processos biológicos: papel crucial em processos biológicos: catálise, transmissão de sinais e apoio estruturalcatálise, transmissão de sinais e apoio estrutural
Determinar as proteínas expressas, suas composições, Determinar as proteínas expressas, suas composições, estruturas e funçõesestruturas e funções
Marco A. Z. ArrudaINTRODUÇÃOINTRODUÇÃO
Nobel de química (2004)Nobel de química (2004)
Irwin Irwin Rose (Rose (UnivUniv. Califórnia, EUA). Califórnia, EUA)Aaron Aaron CiechanoverCiechanover e e Avram Hershko Avram Hershko
(Instituto (Instituto TechnionTechnion, , HaifaHaifa, Israel), Israel)
degradação de proteínas no corpo humanodegradação de proteínas no corpo humanoubiquitinaubiquitina
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArrudaINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOO PREPARO DA AMOSTRA VISAO PREPARO DA AMOSTRA VISA
1) Solubilizar as proteínas de forma efetiva;1) Solubilizar as proteínas de forma efetiva;
2) Evitar a agregação;2) Evitar a agregação;
3) Remover os interferentes;3) Remover os interferentes;
4) Elevar a concentração da proteína de interesse para 4) Elevar a concentração da proteína de interesse para possibilitar a sua determinação;possibilitar a sua determinação;
5) Evitar modificações químicas5) Evitar modificações químicas
pH, temperatura, enzimas e armazenamento;pH, temperatura, enzimas e armazenamento;
6) Purificar as proteínas6) Purificar as proteínas
detdet. seqüências de aminoácidos, formação de . seqüências de aminoácidos, formação de cristais cristais real unidade funcionalreal unidade funcional
INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO
Diferentes estratégias Diferentes estratégias no no preparopreparo de de amostras visando amostras visando a a
determinaçãodeterminação de de proteínasproteínas
Salting outSalting outDiáliseDiáliseExtração mediada por surfactantesExtração mediada por surfactantesCromatografia Cromatografia de de filtração emfiltração em gelgelCromatografia Cromatografia de de trocatroca--iônicaiônicaCromatografia Cromatografia de de afinidadeafinidadeHPLCHPLCEletroforeseEletroforese emem gel gel 1 D e 2 D1 D e 2 DEletroforese capilarEletroforese capilar
Marco A. Z. Arruda
Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínasproteínas
AmostraAmostra
Ruptura celularRuptura celular
SolubilizaçãoSolubilização
CentrifugaçãoCentrifugação
FracionamentoFracionamento
Análise/Análise/DetDet..Marco A. Z. Arruda
Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínasproteínas
AmostraAmostra
Ruptura celularRuptura celular
SolubilizaçãoSolubilização
CentrifugaçãoCentrifugação
FracionamentoFracionamento
Análise/Análise/DetDet..Marco A. Z. Arruda
RupturaRuptura CelularCelularA proteína têm de ser liberada da célula A proteína têm de ser liberada da célula
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
Evaluation of Protein Extraction Evaluation of Protein Extraction Procedures in Procedures in PhytotherapicPhytotherapic Medicines
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
MedicinesCristianaCristiana Schmidt de Magalhães, Lira Celeste Alves, Marco Aurélio Schmidt de Magalhães, Lira Celeste Alves, Marco Aurélio ZezziZezzi ArrudaArruda
PPóó ((ChinaChina))
CapsulasCapsulas, lot, lote #e #333962, 333962,
LabLab. . HerbariumHerbarium
Amostras:Amostras:
••Ginkgo Ginkgo bilobaebilobae
••Spirulina maximaSpirulina maxima
••Aesculus hippocastanumAesculus hippocastanum I.
Folhas de uma Folhas de uma áárvore (rvore (EFOAEFOA););
Extrato seco (Extrato seco (ChinaChina))
PPóó (Alemanha)(Alemanha)
inin natura natura (adquirida em (adquirida em mercado local Amercado local Alfenaslfenas)
I.
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda )
APLICAÇÕESAPLICAÇÕESEvaluation of Protein Extraction Evaluation of Protein Extraction
Procedures in Procedures in PhytotherapicPhytotherapic MedicinesMedicinesCristianaCristiana Schmidt de Magalhães, Lira Celeste Alves, Marco Aurélio Schmidt de Magalhães, Lira Celeste Alves, Marco Aurélio ZezziZezzi ArrudaArruda
agitação centrifugação 0oC
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
1
2
3
4
5
6
diálise centrifugação 0oCagitação
centrifugação 0oC
diálise centrifugação 0oC
centrifugação 0oCagitação
centrifugação 0oC
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
Determinação de proteínas totais (mg g-1): Bradford (n=3)
221.800 ±0.405132.280 ±0.36557.640 ±0.36591.940 ±0.36566.360 ±0.25073.920 ±0.488132.940 ±0.48854.780 ±0.23299.424 ±0.379Spirul.pó
159.800 ±0.405123.060 ±0.36568.020 ±0.36589.400 ±0.365144.360 ±0.12276.220 ±0.488157.600 ±0.488118.620 ±0.232116.340 ±0.379Spirul.caps.
2.736 ±0.0152.699 ±0.0262.595 ±0.0464.462 ±0.0617.899 ±0.0181.439 ±0.0123.643 ±0.0353.800 ±0.0174.282 ±0.027Ginkgo folhas
34.630 ±0.10126.875 ±0.09122.480 ±0.09121.400 ±0.09115.672 ±0.0313.639 ±0.01214.220 ±0.06110.704 ±0.02912.536 ±0.047Ginkgo ext. seco
22.760 ±0.10112.250 ±0.18315.068 ±0.06115.881 ±0.06113.682 ±0.0258.263 ±0.04114.782 ±0.0412.970 ±0.0199.343 ±0.031Aesc.pó
55.210 ±0.10135.890 ±0.18315.115 ±0.06133.790 ±0.09123.047 ±0.04217.412 ±0.08130.273 ±0.08112.221 ±0.03918.137±0.063Aesc.natura
6 tampão
3 tampão
1 tampão
6água
5 água
4 água
3 água
2água
1 água
Amost.
melhor resultadopior resultado
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínasproteínas
AmostraAmostra
Ruptura celularRuptura celular
SolubilizaçãoSolubilização
CentrifugaçãoCentrifugação
FracionamentoFracionamento
Análise/Análise/DetDet..Marco A. Z. Arruda
SolubilizaçãoSolubilização
Adição de tampãoAdição de tampão((surfactantessurfactantes, , caotrópicoscaotrópicos,,
redutores e inibidores)
ββ--MercaptoetanolMercaptoetanol ououDitiotreitol Ditiotreitol reduzir pontes reduzir pontes
dissulfdissulfíídricasdricas e separae separaçãçãoode cadeias polipeptde cadeias polipeptíídicas
redutores e inibidores)dicas
TemperaturaTemperatura
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
8500 g8500 g(13000 (13000 rpmrpm))
5 min
300 mg300 mg+ 300 + 300 µµL L tampão*tampão*
pH 6,8pH 6,8
Agitação porAgitação porefeito efeito vortexvortex
20 min20 min
100100ooCC10 min10 min
75 mg75 mg
75 mg75 mg
Calo deCalo deCitrusCitrus
0 0 ooCC
APLICAÇÕESAPLICAÇÕESVerbiVerbi, F. M. , F. M. etet alal., JBBM, aceito., JBBM, aceito
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
AplicaçãoAplicaçãono gelno gel
*tampão: 60 *tampão: 60 µµL SDS, 30 L SDS, 30 µµL glicerol, L glicerol, 15 15 µµL L ββ--mercaptoetanolmercaptoetanol, 8 , 8 µµL L bromofenolbromofenol, 38 , 38 µµL L tristris--HClHCl,,
150 150 µµL L áágua 5 mingua
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
ChanChan etet alal. . ProteomicsProteomics, 2(2002)1169, 2(2002)1169
•• Otimizaram as condiOtimizaram as condiçõções de preparo para es de preparo para Prorocentrum triestinum Prorocentrum triestinum (dinoflagelado) visando an(dinoflagelado) visando anáálise lise por eletroforese 2por eletroforese 2--D.D.
•• ParParââmetros avaliados: rompimento celular, extrametros avaliados: rompimento celular, extraçãção o independente e seqindependente e seqüüencial, soluencial, soluçõções es solubilizantessolubilizantes e e agentes redutores.agentes redutores.
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
Células de P. triestinumcom tampão TRIS
Homogeneização usando esferas de vidro Sonicação
Extração Seqüenciada
Precipitado
Tampão (uréia, tiouréia, CHAPS, TRIS e inibidor) (3)
SOBRENADANTES
Tampão ( uréia, CHAPS, TRIS e inibidor) (2)
Precipitado
Tampão TRIS (1)
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
Extrações Extrações independentesindependentes
Tampão (1)Tampão (1) PrecipPrecip. TCA/. TCA/AcetAcet..
CentrifugaçãoCentrifugação
SOBRENADANTESSOBRENADANTESPrecipitadoPrecipitado
SolubilizaçãoSolubilização(uréia e CHAPS)(uréia e CHAPS)
Tampão (2)Tampão (2) Tampão (3)Tampão (3)
SOBRENADANTESSOBRENADANTES
CentrifugaçãoCentrifugação
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArrudaAPLICAÇÕESAPLICAÇÕES
Células de Células de P. P. triestinumtriestinumcom tampão TRIScom tampão TRIS
PrecipitadoPrecipitado
AgAg. redutores DTT, TBP (. redutores DTT, TBP (tributilfosfinatributilfosfina) e ) e TCEP (TCEP (triscarboxietilfosfinatriscarboxietilfosfina) )
SOLUÇÕES SOLUBILIZANTESSOLUÇÕES SOLUBILIZANTES
a) 9,5 mol/L de uréiaa) 9,5 mol/L de uréiab) 8 mol/L de uréiab) 8 mol/L de uréiac) 5 mol/L de uréia + 2 mol/L de c) 5 mol/L de uréia + 2 mol/L de
tiouréiatiouréiad) 7 mol/L de uréia + 2 mol/L de d) 7 mol/L de uréia + 2 mol/L de
tiouréia tiouréia
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
•• RUPTURA CELULAR RUPTURA CELULAR –– sonicasonicaçãçãoo –– 10x mais eficiente 10x mais eficiente –– mais fmais fáácil de ser executadacil de ser executada
•• EXTRAEXTRAÇÃÇÃOO
–– SeqSeqüüenciada enciada -- 575 575 spotsspots..
–– Independente Independente -- 407 407 spots spots (TRIS)(TRIS)
•• SOLUSOLUÇÃÇÃO SOLUBILIZANTE O SOLUBILIZANTE –– 8 mol/L de ur8 mol/L de urééia;ia;tiourtiourééia ia -- apresentou apresentou spotsspots artificiais. artificiais.
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda•• AGENTE REDUTOR AGENTE REDUTOR -- TCEP TCEP
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
•• O procedimento otimizado foi usado em amostras O procedimento otimizado foi usado em amostras cultivadas em diferentes condicultivadas em diferentes condiçõções.es.
•• Foi possFoi possíível observar diferenvel observar diferençças na expressas na expressãão o protprotééica.ica.
COMENTCOMENTÁÁRIOSRIOS
•• Trabalho amplo Trabalho amplo –– avaliaram vavaliaram váários parrios parââmetros;metros;
•• Conseguiram estimar a eficiConseguiram estimar a eficiêência de cada ncia de cada procedimento.procedimento.
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínas
Marco A. Z. Arruda
AmostraAmostra
Ruptura celularRuptura celular
CentrifugaçãoCentrifugação
Análise/Análise/DetDet..
SolubilizaçãoSolubilização
proteínas
FracionamentoFracionamento
Marco A. Z. Arruda CentrifugaçãoCentrifugaçãoCoefCoef. de sedimentação. de sedimentação
s = m (1 s = m (1 -- υρυρ)/f)/f
massamassa coefcoef. de atrito. de atrito
força de flutuaçãoforça de flutuação(exercida pelo meio líquido)(exercida pelo meio líquido)
ProteínaProteínaInibidor pancreáticoInibidor pancreático
de tripsinade tripsinaCitocromo Citocromo CCMioglobinaMioglobina
Lactato desidrogenaseLactato desidrogenase
S (unidades S (unidades SvedbergSvedberg))11
1,831,831,971,977,54
PM (PM (kDakDa))6,5206,520
12,3112,3117,8017,80146,2se
dim
enta
ção
sedi
men
taçã
o
7,54 146,2
Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínasproteínas
AmostraAmostra
Ruptura celularRuptura celular
Marco A. Z. Arruda
CentrifugaçãoCentrifugação
FracionamentoFracionamento
Análise/Análise/DetDet..
SolubilizaçãoSolubilização
FracionamentoFracionamento
Marco A. Z. Arruda
ELETROFORESEELETROFORESE
•• Técnica de separação Técnica de separação –– custo reduzido;custo reduzido;
•• Suporte Suporte –– PAGE;PAGE;
•• AplicaAplica--se um campo elétrico;se um campo elétrico;
•• 11--D D –– IEF ou PM;IEF ou PM;
•• 22--D D –– IEF e PM.IEF e PM.
Preparo de AmostrasPreparo de Amostras
Presença de interferentes que afetam a migração:Presença de interferentes que afetam a migração:
-- elevadas concentrações salinas;elevadas concentrações salinas;
-- adição de DTT.adição de DTT.
Eletroforese 1Eletroforese 1--DD
Eletroforese Eletroforese –– SDSSDS--PAGEPAGEυυ = = EzEz/f/f
υυ = = velvel. de migração. de migraçãoE = E = intensintens. do campo. do campo
z = carga global da proteínaz = carga global da proteínaf = f = coefcoef. de atrito
SDSSDS--proteínas (cargas negativas)proteínas (cargas negativas)migramigraçãção no sentido o no sentido ananóódicodico
(parte baixa do gel)(parte baixa do gel)Poliacrilamida Poliacrilamida (?): a(?): açãção de peneiramentoo de peneiramento
separaseparaçãção conforme tamanhoo conforme tamanhoBoa sensibilidade: Boa sensibilidade: caca. 2 . 2 pmoles
. de atritopmoles
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
Eletroforese Eletroforese 22--DD
11aa dimensãodimensão
11aa dimensãodimensão::Separa de acordo com o ponto Separa de acordo com o ponto isoelétrico.isoelétrico.
22aa dimensãodimensão::Eletroforese Eletroforese -- SDSSDSSeparaSepara de acordo com o pesode acordo com o pesomolecular.
22aadi
men
são
dim
ensã
omolecular.
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
Eletroforese Eletroforese 22--D D possui resolução possui resolução para identificar milhares de para identificar milhares de spotsspotsde proteínas de proteínas
FracionamentoFracionamentoExtração mediada por surfactantes Extração mediada por surfactantes -- Ponto NuvemPonto Nuvem
As moléculas de surfactante possuem duas regiões distintas:uma delas apolar e outra polar ou iônica.
Cabeça Hidrofílica ⇒ parte damolécula de natureza POLAR ouiônica. (esta região apresenta solubilidade significativa em água)
neutro
iônico
catiônicos
aniônicos
anfóteros
Cauda Hidrofóbica ⇒ parte da molécula de natureza APOLAR (esta região não apresenta solubilidade em água) Marco A. Z. Arruda
FracionamentoFracionamentoExtração mediada por surfactantes Extração mediada por surfactantes -- Ponto NuvemPonto Nuvem
Estes agregados são denominados
micelas
A concentração onde inicia o processo de
formação das micelas é chamada de
concentração micelarcrítica, cmc (sendo uma propriedade
intrínseca de todos os surfactante)
Micelas:responsáveis
pela solubilização de
gorduras; interagem com
substâncias hidrofóbicas
Uma das características de
todos os surfactantes é a capacidade de
formar agregadosem solução aquosa
a partir de uma determinada
concentração
Marco A. Z. Arruda