preparacion de medios de cultivo y siembra de bacterias en medios de cultivo

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAOFACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA

Laboratorio de microbiología de los alimentos

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA DE BACTERIAS EN

MEDIOS DE CULTIVO

I. Objetivos

relacionar la composición de los diversos medios de cultivo con sus características y aplicaciones.

Familiarizarse con las técnicas empleadas en microbiología para el cultivo y la manipulación de microorganismo en condiciones de esterilidad

II. Marco teórico

2.1 MEDIOS DE CULTIVO

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos

es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el

laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es

el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han

preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial

debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y

presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.

Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento

necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares

en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de

muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que

se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de

medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se



solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre

el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que

bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de

enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los

hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para

incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación

de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa

se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos

resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por

ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas

bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH

básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya

que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).

2.2 Tipos básicos de medios de cultivo

Atendiendo a su estado físico:

Líquidos

Semisólidos

Sólidos

Atendiendo a su utilidad práctica:

Medios para aislamientos primarios:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad

de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos

con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u

otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar

Sangre, Schaeadler, etc.)



Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se

añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de

bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando la

sustancia añadida, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey,

Kanamicina-Vancomicina)

Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora

competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado

(Selenito, medio con Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas

especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de

bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).

2.3 Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve

afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,

son ajenos por completo al propio medio.

disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de

contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En

muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia inductoras del

crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para

ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que

tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones

de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación

de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida

de los factores nutritivos lábiles.



Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios

es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de

nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen

utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los

aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la

peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a

muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente

pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio,

magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,

generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como

indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de

ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo

productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en

estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que

muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas

inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad

de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y

comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está

ampliamente extendido en el laboratorio.

presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de

oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados



sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán

adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio,

los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas

parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los

anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de

las citadas condiciones.

condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en

los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las

estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que

mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que

se deseque el medio.

Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en

presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los

microorganismos fotosintéticos.

pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de

los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un

pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe

olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el

crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos

metabólicos normales.

Temperatura



Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15

y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilas a 80ºC o incluso a

temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos

humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC,

y los saprofitos tienen rangos más amplios.

Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la

aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el

crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos

medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave

(que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

2.4 Métodos de preparación de medios

Preparación de un medio solido en placa:

1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos

añadirlo a una concentración de 15g/l) y rehidratarlo agua destilado en una botella

2. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapón de rosca

3. Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapón e introducir la botella en

un baño a 40ºc al menos durante 30 minutos.

4. Distribuir el medio en las placas de petri que están estériles dentro de una

campana de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la

boca de la botella para evitar las contaminaciones.

5. Dejar que el medio solifique.



Preparación de medio solido en tubo (slant)

1. Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada en un

matraz

2. Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente. el medio

debe hervir hasta que se vuelve transparente.

3. Distribuir rápidamente el medio en los tubos antes de que comience a

solidificar para ello se empleara una pipeta y los tubos no se llenaran más de un

tercio de su volumen.

4. Autoclavar

5. Sacar de la autoclave e inclinar los tubos sobre la poyata para obtener

tubos con medio de slant.

Preparación de medio liquido en tubo (caldo)

1. Pesar y rehidratar el medio

2. Distribuirlo con una pipeta en los tubos (sin llenarlos más de 1/3 de su

volumen)

3. Autoclavar

4. Sacar del autoclave y dejar enfriar

5. Todos los medios se guardan en nevera a 4ºc

2.5 Realización de la siembra

a) Siembra en medio liquido

Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un

inoculo que se lleva al tubo estéril con medio liquido (agitándolo en el seno del

medio)

b) Siembra en placa

Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inoculo tomado de los

cultivos crecidos .se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se

toma una gota de inoculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el

asa suavemente por su superficie en zig-zag.



c) Siembra en agar inclinado

Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un

inoculo que se extiende sobre el agar inclinado deslizando el asa suavemente

por su superficie en zig-zag. En el caso del medio TSI, la siembra se deberá

realizar tanto en superficie (aerobiosis) como en la población del agar

(anaerobiosis).

II.6 Incubación

De los medios sembrados a 37ºc hasta que haya habido crecimiento bacteriano.



2.7 Investigación:

1. AGAR SALMONELLA SHIGELLAM

Usos:

El Agar Salmonella Shigella, también conocido como Agar SS, es utilizado para

el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras clínicas y

de alimentos.

Formulación por litro de agua purificada

Extracto de carne 5.0

Mezcla de peptonas 5.0

Lactosa 10.0

Mezcla de sales biliares 8.5

Verde brillante 0.33

Citrato de sodio 8.5

Tiosulfato de sodio 8.5

Citrato férrico 1.0

Rojo neutro 0.025

Agar bacteriológico 13.5

PH: 6.8-7.2



2. ORANGE SERUM AGAR

Usos

Medio utilizado para el cultivo y recuento de microorganismos acidúricos,

particularmente los asociados con el deterioro de jugos de fruta, especialmente de

cítricos. También es útil para el cultivo de hongos saprófitos y patógenos.

Fundamento

En el medio de cultivo, la tripteína y el extracto de levadura aportan los

nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. La glucosa es el

hidrato de carbono fermentable, y el suero de naranja le otorga un ambiente ácido,

favorable para el desarrollo de microorganismos tolerantes a las condiciones de

acidez.

formula

Agar 15g

Suero de naranja 200nl

Extracto de levadura 3.0g

Tripteina 10.0g

Glucosa 4.0g

Fosfato dipotasico 2.5g

Agua desmineralizada 800ml

PH : 5.3-5.7



3. AGAR TCBS

Usos

Medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio

parahemolyticus y otras especies de Vibrio a partir de heces, agua y alimentos

contaminados.

También es conocido como Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa, o como Agar

Selectivo para Vibrios.

Formulación(en gramos por litro)

Extracto de levadura 5.0

Suspender 89 g del

polvo en un litro de agua

destilada. Calentar hasta

ebullición y hervir de 1 a

2 minutos. NO

AUTOCLAVAR. Distribuir

en placas de Petri

estériles

Peptona de carne 5.0

Tripteína 5.0

Citrato de sodio 10.0

Tiosulfato de sodio 10.0

Bilis de buey 8.0

Sacarosa 20.0

Cloruro de sodio 10.0

Citrato férrico 1.0

Azul de bromotimol 0.04

Azul de timol 0.04

Agar 15.0

PH: 8.4-8.8



4. AGAR XLD

Usos

BD XLD Agar (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) (agar BD XLD [agar xilosa-

lisina-desoxicolato]) es un medio moderadamente selectivo y de diferenciación

para el aislamiento y la diferenciación de patógenos entéricos gram negativos

(Salmonella y Shigella) de muestras clínicas y no clínicas. Es adecuado en

especial para el aislamiento de la especie Shigella.

REACTIVOSFórmula por litro de agua purificadaxilosa 3.5gL-lisina 5.0lactosa 7.5sacarosa 7.5Cloruro sódico 5.0Extracto de levadura 3.0Rojo fenol 0.08Desoxicolato de sodio 2.5Tiosulfato sódico 6.8Citrato ferrico0 de amonio 0.8Agar 13.5

PH 7,4 ± 0,2



5. CALDO AZIDA GLUCOSA

UsosMedio utilizado para el enriquecimiento selectivo de enterococos en aguas, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

Fundamento El medio permite un enriquecimiento selectivo de Enterococcus spp.La tripteína, el extracto de carne y la glucosa constituyen la fuente nutritiva, mientras que la azida sódica es inhibidora de la flora Gram negativa. El cloruro de sodio se usa para mantener el equilibrio osmótico del medio

Fórmula (en gramos por litro)

tripteina 15.0Extracto de carne 4.8glucosa 7.5Cloruro de sodio 7.5Azida sódica 0.2

PH final: 7.2 ± 0.26. CALDO EC

USOMedio utilizado para el recuento de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli en agua, alimentos y otros materiales.

Fundamento

El contenido de lactosa en este medio, favorece el crecimiento de bacterias lactosa positivas, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de gran parte de la flora acompañante.

Fórmula (en gramos por litro) PH final: 6.9 ± 0.2

TRIPTEINA 20.0Lactosa 5.0Sales biliares Nº3 1.9Fosfato dipotasico 4.0Fosfato monopotasico 1.5Cloruro de sodio 5.0



7. LAURIL SULFATO CALDOUsoMedio recomendado por A.P.H.A. para detección y recuento de coliformes en aguas, aguas residuales y alimentos.

Fundamento Medio rico en nutrientes, que permite un rápido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la lactosa, aún de los fermentadores lentos.La triptosa es la fuente de nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmóticoEs un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora acompañante.Por la fermentación de la lactosa, se produce ácido y gas, éste último se evidencia al utilizar las campanas Durham.

Fórmula (en gramos por litro)

triptosa 20.0lactosa 5.0Cloruro de sodio 5.0Fosfato dipotasico 0.1Fosfato monopotasico 2.75lauril sulfato de sodio 2.75

PH final: 6.8 ± 0.2

8. CALDO PURPURA DE BROMOCRESOL UsoAdicionado de carbohidratos se emplea para pruebas de fermentación en la diferenciación bioquímica de microorganismos, especialmente del grupo entérico.

Formulación

Cloruro de sodio 5.0Extracto de carne 1.0Peptona especial 10.0Purpura de bromocresol 0.015

PH: 6.8-7.2



9. CALDO RAPPAPORTUsoEs utilizado para el enriquecimiento de los microorganismos pertenecientes del género salmonella, provenientes de diferentes tipos de muestras.

FormulaciónCloruro de magnesio hexahidratado 29.0Cloruro de sodio 8.0Fosfato monopotasico 0.4Peptona de caseína 4.0Peptona de soya verde de malaquita 1.0verde de malaquita 0.036

PH: 5-5.2

10.CALDO SELENITA CISTINA

UsoMedio selectivo de enriquecimiento para recuperación de microorganismos del género salmonella a partir de muestras fecales, alimentos farmacéuticos, agua, etc.

Formulación

Fosfato de potasio 10.0lactosa 4.0L-cistina 0.01Peptona especial 5.0Selenito de sodio acido 4.0

PH: 6.8-7.2



11. PARKER AGAR

UsoEs un medio moderadamente selectivo y de diferenciación para el aislamiento y recuento de staphylococcus aureus de alimentos, muestras ambientales y clínicas

Formula por litro de agua purificada

Bacto trytone 10gBacto beef extract 5.0Bacto yeast extract 1.0Cloruro de litio 5.0glicina 12Piruvato sódico 10Telúrito potásico 0.1agar 20Emulsión de yema de huevo 50.ml

PH: 6.5-7.1



12.AGAR TWEEN

UsoMedio recomendado para la detección y recuento de una amplia gama de microorganismos. La presencia de lecitina y tween permite neutralizar la actividad bacteriana, facilitando la investigación de los gérmenes en productos o superficies que contengan: aldehídos, derivados fenolicos o amonio cuaternario.

Formulario (por litro)Tween 80 5.0glecitina 0.7gPeptona de caseína 15.0gPeptona de soja 5.0gSodio cloruro 5.0gagar 20.5g

PH: 7.1-7.5

13.CALDO BRILA

Usos

Este medio está recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la técnica del número más probable.

Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas.

FORMULACION PH: 7-7.4

Bilis de buey deshidratada 20.0



lactosa 10.0

peptona 10.0

Verde brillante 0.0133

14.CALDO TIOGLICOLATO

USOSUtilizado en procedimientos cualitativos para la prueba de esterilidad y para el aislamiento y cultivo de aerobios como anaeróbicos y microaerofilos que no son exigentes en exceso. En microbiología clínica se puede utilizar como medio de enriquecimiento para muestras clínicas.

Formulación (g/L)

tripteina 17Peptona de soya 3Glucosa 6Cloruro de sodio 2.5agar 0.5L-cistina 0.7Sulfito de sodio 0.25

0.1

PH: 6.8-7.2



15.AGAR BPLS

UsoMedio de cultivo selectivo para el aislamiento de salmonella excepto S a partir de materiales patológicos. Heces, orina, alimentos, etc.

Formulación (g/L)

Peptona de carne 5Peptona de caseína 5Extracto de carne 5Cloruro sódico 3Hidrogenofosfato disodico 2lactosa 10sacarosa 10Rojo de fenol 0.08Verde brillante 0.0125agar 12

PH: 6.7-7.1



2.8 Conclusiones

Los medios de cultivo están conformados por nutrientes favorables

para la proliferación de microorganismos.

Tenemos que esterilizar los materiales a utilizar para el cultivo de

microorganismos para evitar la contaminación.

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