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Predicción de características 1D

David de JuanDavid de [email protected]@cnio.es

C.N.I.O.C.N.I.O.Grupo de Biología Grupo de Biología

Computacional EstructuralComputacional Estructural

SumarioSumario

Definición de características 1D.Contexto: Estructura de Proteínas.

Niveles de EstructuraPredicción de Estructura.

Metodología: Construcción de un predictor.PreparaciónDesarrollo y Validación

Predicción de características 1DEstructura secundariaDesorden estructuralAccesibilidad al solventeProteínas transmembranaOtras características 1D

Definición de características 1D

● Denominamos características 1D de una secuencia a aquellas que pueden ser representadas por un único valor asociado a cada aminoácido (B. Rost).

● Estos valores suelen tomar la forma de etiquetas de estado, como por ejemplo en el caso de la estructura secundaria (H->hélice, E->lámina, T->giro)

● Algunas características 1D:

– Estructura secundaria– Accesibilidad al solvente– Modificaciones post-transcripcionales– Péptidos señal– Regiones desordenadas– etc.

● El estudio de estas propiedades permite caracterizar funcional y estructuralmente una proteína.

SumarioSumario





Aminoácidos esenciales (los ladrillos).

>Estructura PrimariaASKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTT GKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFF KDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNV YIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHY LSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK

Enlace peptídico (el cemento).

NH2CHR1

C

O

NH

CHC

O

NCH

R2

R3

HOOC

CterminusPeptide bondsNterminus

NH2CHR1

C

O

N+H

CHC

O

NCH

R2

R3

HOOC

Planaridad del enlacepeptídico

cis vs transProlina Resto

Resonancia de orbitales p

Enlace peptídico (el cemento).

GlyPro

Diagramas de Ramachandran

Estructura secundaria (los muros)

● Helices α

αα


● Cadenas β

αα

ββppββaa

Prolina es diferenteProlina es diferente

αα

ββppββaa

Otros

Pro

Gly

Gln

Pro


● Giros

Estructura 3D (la casa)

TIM barrel

Ubiquitin likeα/β sandwich

Thioredoxin likeImmunoglobulin likeβ trefoil

Cytokine like

Globin like

Jelly-roll

SumarioSumario





Información disponible

Uno de los principales retos de la Biología Molecular es predecir cuál es la función de una proteína dada y cómo desarrolla esta función (estructura).

Pero ¿de qué información disponemos para ello?




SwissProt




PDBPDB

SwissProt

Submitted on November 20, 2003Accepted on February 20, 2004

Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea

J. Craig Venter 1*, Karin Remington 1, John F. Heidelberg 2, Aaron L. Halpern 3, Doug Rusch 3, Jonathan A. Eisen 2, Dongying Wu 2, Ian Paulsen 2, Karen E. Nelson 2, William Nelson 2, Derrick E. Fouts 2, Samuel Levy 3, Anthony H. Knap 4, Michael W. Lomas 4, Ken Nealson 5, Owen White 2, Jeremy Peterson 2, Jeff Hoffman 1, Rachel Parsons 4, Holly Baden-Tillson 1, Cynthia Pfannkoch 1, Yu-Hui Rogers 6, Hamilton O. Smith 1

We have applied "whole genome shotgun sequencing" to microbial populations collected en mass on tangential flow and impact filters from sea water samples collected from the Sargasso Sea near Bermuda. A total of 1.045 billion basepairs of non-redundant sequence was generated, annotated and analyzed to elucidate the gene content, and diversity and relative abundance of the organisms within these environmental samples. These data are estimated to derive from at least 1800 genomic species based on sequence relatedness, including 148 novel bacterial phylotypes. We have identified over 1.2 million new genes represented in these samples, including more than 782 new rhodopsin-like photoreceptors. Variation in species present and stoichiometry suggests substantial oceanic microbial diversity.

Y va a más

¿Se puede obtener analíticamente la estructura?

Ha sido verificado para muchas proteínas, que la estructura 3D de una proteína (es decir su plegamiento) viene determinada esencialmente por la especificidad de la secuencia.

¿Se puede obtener analíticamente la estructura?

Ha sido verificado para muchas proteínas, que la estructura 3D de una proteína (es decir su plegamiento) viene determinada esencialmente por la especificidad de la secuencia.

Dificultad para obtener valores suficientemente precisos de parámetros físicos fundamentales para la resolución del problema.

El cálculo pormenorizado de la influencia sobre cada resíduo del resto de los aminoácidos de la secuencia, así como del solvente resulta computacionalmente intratable.

Aproximaciones alternativas

● +++Extrapolación de estructura/función por homología de secuencia (secuencia→secuencia).

● ++ Reconocimiento de plegamiento / Threading (secuencia→estructura conocida).

● + Predicción de estructura ab initio (secuencia nueva →→ estructura, pero sólo aprox.)

Aproximaciones alternativas

● +++Extrapolación de estructura/función por homología de secuencia (secuencia→secuencia).

● ++ Reconocimiento de plegamiento / Threading (secuencia→estructura conocida).

● + Predicción de estructura ab initio (secuencia nueva →→ estructura)

Todas estas técnicas requieren o se benefician de información proporcionada en forma de características 1D

SumarioSumario





Construcción de un predictorPreparación (i)

1.- Definición del problema (Estructura secundaria, Accesibilidad, ...)

2.- Extracción de un conjunto de entrenamiento que debe:

i) ser tan amplio como sea posible, ya que extrapolaremos a otros casos a partir de la información asociada a este grupo.

ii) ser tan fiable como sea posible (debemos minimizar la presencia de ruido debido a la presencia de errores de partida).

iii) estar limpio de redundancias (introducen sesgos en las predicciones).

iv) debe estar equilibrado entre los distintos estados a predecir, para evitar que algunos estados sean ignorados en el entrenamiento.

3.- Determinar de qué datos disponemos que puedan contener información sobre el problema a resolver.

4.- Decidir qué método vamos a usar para construir el predictor (Redes Neuronales, Algoritmos genéticos, HMMs, Sistemas basados en reglas, SVM, ...).

5.- Elegir una codificación de la información asociada al problema acorde a éste y compatible con el método elegido.

Construcción de un predictorPreparación (ii)

6.- Entrenar el sistema, es decir introducir la información sobre el problema, hasta que el método establezca una relación (normalmente compleja e imperfecta) entre ella y la solución del problema.

7.- Comprobar el éxito del predictor generado frente a un conjunto de validación independiente del de entrenamiento.

Construcción de un predictorDesarrollo y Validación

SumarioSumario





Estructura secundaria

1 ASKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTT TTGGGGSSEEEEEEEEEEEETTEEEEEEEEEEEETTTTEEEEEEEETT

51 GKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFF SS SS GGGGHHHHSSS GGG B GGGGGG HHHHTTTT EEEEEEEEE

101 KDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNV TTS EEEEEEEEEEETTEEEEEEEEEEE TTSTTTTT B S EEE

151 YIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHY EEEEEGGGTEEEEEEEEEEEETTS EEEEEEEEEEEESSSS SEE

201 LSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIT HGMDELYK EEEEEEEE TT SSEEEEEEEEEEES

● La estructura secundaria es usada por muchos métodos de predicción de estructura.

● Además se suele usar a posterioi para decidir qué modelo es el más plausible y refinarlo, comparando la estructura secundaria del modelo (DSSP) con la predicha.

●

T=hydrogen bond turn, H=helix, G=310 helix,I=phi helix, B=residue in isolated beta bridge, E=strand, and S=bend

Kabsch and Sander (1983) Biopolymers 22, 2577-2637

Primera generación de métodos

Métodos estadísticos basados simplemente en la tendencia de cada aminoácido a formar cada uno de los elementos de estructura secundaria

● Chou y Fasman en 1974, propusieron el primero de estos métodos. Emplearon estadísticas extraídas de las 15 estructuras resueltas por cristalografía de rayos-X en aquella época. Estas probabilidades fueron calculadas para cada resíduo por separado. Más adelante este método mostró una exactitud del 57% sobre 62 proteínas.

● Garnier (1978). Estimó las probabilidades para interacciones de pares de resíduos significativas, obteniendo una mayor fiabilidad (~60%).

Chou-Fasman

Glu, Met y Ala : fuertes formadores de hélices.

Val, Ile y Tyr: fuertes formadores de láminas.

Pro: fuerte tendencia a no formar hélices ni láminas

Name P(a) P(b) P(turn) f(i) f(i+1) f(i+2) f(i+3)Alanine 142 83 66 0.06 0.076 0.035 0.058Arginine 98 93 95 0.070 0.106 0.099 0.085Aspartic Acid 101 54 146 0.147 0.110 0.179 0.081Asparagine 67 89 156 0.161 0.083 0.191 0.091Cysteine 70 119 119 0.149 0.050 0.117 0.128Glutamic Acid 151 037 74 0.056 0.060 0.077 0.064Glutamine 111 110 98 0.074 0.098 0.037 0.098Glycine 57 75 156 0.102 0.085 0.190 0.152Histidine 100 87 95 0.140 0.047 0.093 0.054Isoleucine 108 160 47 0.043 0.034 0.013 0.056Leucine 121 130 59 0.061 0.025 0.036 0.070Lysine 114 74 101 0.055 0.115 0.072 0.095Methionine 145 105 60 0.068 0.082 0.014 0.055Phenylalanine 113 138 60 0.059 0.041 0.065 0.065Proline 57 55 152 0.102 0.301 0.034 0.068Serine 77 75 143 0.120 0.139 0.125 0.106Threonine 83 119 96 0.086 0.108 0.065 0.079Tryptophan 108 137 96 0.077 0.013 0.064 0.167Tyrosine 69 147 114 0.082 0.065 0.114 0.125Valine 106 170 50 0.062 0.048 0.028 0.053

Primera generación de métodos

● La principal característica de estos métodos es la utilización de ventanas de resíduos adyacentes en secuencia, incluyendo así información de contexto a la predicción.

● Un gran número de algoritmos de predicción se usaron en esta generación de métodos:

● Redes Neuronales Artificiales

● Teoría de Grafos

● Métodos basados en reglas

● Estadística multivariable

● ...

● Esta innovación acercó la predicción de estructura secundaria a la barrera del 70% de fiabilidad.

Segunda generación de métodos

● Limitaciones

– Fiabilidad (prediccciones 3-estados < 70%)– Se obtienen bajas fiabilidades para cadenas-β– La hélices y láminas predichas tienden a ser demasiado cortas.

● Debido a:

– El número de estructuras disponibles sigue siendo demasiado pequeño para extrapolar al espacio de secuencias. Difiriendo a veces entre distintos cristales para la misma secuencia.

– NO se tienen en cuenta los efectos provocados por resíduos situados a grandes distancias en secuencia (pero no en el espacio)

Segunda generación de métodos

Iniciada por Levin en 1993 (~69%) y Rost y Sander en 1994 (PHD 72%)

– La principal innovación de esta tercera generación es la inclusión de información evolutiva adicional en forma de alineamientos múltiples (Levin, 1993).

– Además, se resuelve el sesgo en las predicciones de cadenas-β balanceando el conjunto de entrenamiento (dado que las estructuras contienen más hélices que láminas; Rost y Sander, 1994)

Tercera generación de métodos

Red neuronal PHD

Información de secuencia de la familia de la proteína

Perfil derivado del alineamiento múltiple para una ventana de resíduos adyacentes

Rost et al. (1997) J. Mol. Biol. 270: 471-480


Varios métodos han seguido estrategias similares a PHD, mejorando sus resultados a través del prefiltrado de los alineamientos de entrada y la extensión de los perfiles mediante PSIBLAST introducido por David Jones en PSIPRED (1999) con fiabilidades próximas al 77% o mediante HMMs usados por Kevin Karplus et al. en SAMT99sec(1999).

Otros métodos siguen una estrategia diferente, buscando el consenso de diferentes métodos, como es el caso de Jpred2 (Cuff y Barton, 2000).


Ejemplos de fiabilidad de predicción de estructura secundaria

Métodos de Primera generación: Chou & Fasman, Lim, GORI

Métodos de Segunda generación : Schneider, ALB, GORIII

Métodos de Tercera generación: LPAG, COMBINE, S83, NSSP, PHD

Sequence basedStatistics

GOR1/GOR3 (1978/1987)

DSC (1996)Nearest neighbour methods

PREDATOR (1996)NNSSP (1995)

Neural Networks MethodsPHD (1993)PsiPRED (1999)JNET (1999)

Structure basedHidden Markov Models

SAMT99/SAMT02 (1999/2002)

ChowFassman (1974)

Accuracy

57%63%/66%

70%

75% 72%

74%75.7%73%??

~76%

Ejemplos de fiabilidad de predicción de estructura secundaria

Fiabilidad de PHD usando un conjunto de proteínas de prueba

La fiabilidad depende de la proteína

Problemas no resueltos

● NO se tienen en cuenta los efectos provocados por resíduos situados a grandes distancias en secuencia (pero no en el espacio)

● Proteínas con características inusuales deben tratarse con cuidado

● Las predicciones siguen cosiderando sólo tres estados

● Malos alineamientos producen malas predicciones

SumarioSumario





Desorden estructural

Algunas regiones de las secuencias no pueden clasificarse en ninguno de los tipos de estructura secundaria

Estas regiones normalmente no son visibles en los cristales y están desordenadas.

Las regiones desordenadas son rizos, caracterizados normalmente por elevados niveles de aminoácidos polares junto con bajos de aromáticos o regiones de baja complejidad.

Algunas regiones desordenadas cortas, sin importancia funcional aparente, suelen hallarse en los extremos de las cadenas proteicas.

Más desorden

● Las regiones más largas suelen estar conservadas en posición a lo largo de familias de proteínas. Estas regiones se relacionan con conexión entre dominios, sitios proteolíticos, así como con reconocimiento y unión tanto a ligandos como a otras proteínas.● Suelen encontranse en ciertas enzimas, como en aquellas involucradas en el crecimiento y división celular o en fosforilación proteica.● Entre ellas estas proteínas se hallan factores y reguladores de transcripción y kinasas entre otras.

Ejemplo de proteína desordenadael factor de crecimiento nervioso β(PDB: 1bet), que sólo es estable como dímero

Una evaluación de los métodos(CASP 6)

193 ISTZORAN (Zoran Obradovic, Temple University) red neuronal.

096 CaspIta (Tosatto et al., Univ. of Padova) support vector machines

003 Jones UCL (David Jones, University College London) support vector machines (DISOPRED)

347 DRIP PRED (sevidor de Bob MacCallum, Stockholm) Kohonen self-organizing maps

472 Softberry. Combinación de red neuronal, función lineal discriminante y un procedimiento suavizado.

SumarioSumario





Utilidad de la accesibilidad al solvente

● Al igual que con las predicciones de estructura secundaria, se puede estudiar la plausibilidad de las estructuras predichas por un método dado mediante el uso de la información de accesibilidad al solvente (usando DSSP o NACCESS).

● Además esta infomación puede ser de utilidad en otros ámbitos, como la predicción de superficies de interacción entre proteínas o de sitios funcionales. Roßbach et al. BMC Structural Biology 2005 5:7

Definición operativa

La mayoría de los métodos reducen el problema a la predicción de dos estados oculto (accs. relativas. <16%) o expuesto (accs. relativas >= 16%).Ls

Información utilizada

Aunque la accesibilidad es una función de la hidrofobicidad, los métodos basados en perfiles de esta propiedad producen unas predicciones pobres.

La predicción de accesibilidad mejora por el uso de ventanas en secuencia.

Al igual que ocurre con la estructura secundaria, la accesibilidad al solvente es una propiedad sujeta a fuertes restricciones evolutivas, por lo que su predicción se beneficia del uso de alineamientos múltipes.

En la mayoría de los casos las metodologías usadas son pequeñas variaciones de las usadas en la predicción de estructura secundaria

Algunos métodos

● PHDacc y PROFacc (B. Rost) emplean redes neuronales e infomación de alineamientos múltiples. Son los únicos métodos que predicen valores reales para accesibilidades relativas (de una matriz con los valores 0, 1, 4, 9, 16, 25, 36, 49, 64, 81).

● JPred2 usa perfiles de PSIBLAST como entrada para sus redes neuronales y devuelve predicciones del tipo oculto/expuesto.

● Estos métodos tienen una porcentaje de acierto del 70-75%

SumarioSumario





Tipos de proteínas transmembrana

El problema

• La obtención de estructuras tridimensionales de proteínas transmembrana es un gran problema, ya que raramente producen cristales (hay 207 estructuras de 106 proteínas) y su estudio por NMR es muy complicado (sólo hay 4 estructuras).

• De hecho aún no es posible una predicción de estructuras transmembrana a nivel atómico

Hernanz-Falcon P, Rodriguez-Frade JM, Serrano A, Juan D, del Sol A, Soriano SF, Roncal F, Gomez L, Valencia A, Martinez-A C, Mellado M. Nat Immunol. 2004 Feb;5(2):216-23.

Predicción de hélices transmembranaDos reglas básicas

(1) Las hélices transmembrana tienden a tener una logitud de 20-30 resíduos con una hidrofobidad total alta.

(2) Las regiones de conexión entre hélices del interior del citoplasma tienen una carga positiva mayor que las del exterior

TRUCO: las hélices transmembrana no suelen incluir gaps (restricción de longitud mínima)

Algunos métodos de predicción de hélices transmembrana

MEMSAT - http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/Algoritmo de programación dinámica que hace predicciones basadas en tablas estadísticas compiladas de los datos de proteínas de membrana.TMAP - http://www.mbb.ki.se/tmap/index.htmlUsa estadíticas extraídas de perfiles de secuencia.TopPred2 - http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.htmlPromedia los valores de hidropatía con una ventana trapezoidalHMMTOP - http://www.enzim.hu/hmmtop/Se definen 5 estados estructurales y mediante HMMs para generar fragmentos de secuencia que maximizen la frecuencia de cada estado.PHDhtm - http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/Combina redes neuronales, alineamientos múltiples y programación dinámica (proporciona un índice de fiabilidad).DAS - http://www.enzim.hu/DAS/DAS.htmlUtiliza alineamientos múltiples de un conjunto no redundante de proteínas de membrana.TMHMM - http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/Métodos estadísticos y HMMs que ayudan a mejorar la localización y orientación de hélices trans-membrana.

Ejemplo de predicción de topología

Fiabilidad

• Los métodos actuales dicen identificar correctamente >90% de los segmentos trasmembrana y predecir correctamente la topología en >80% de los casos.

• Sin embargo, el pequeño tamaño de los conjuntos de entrenamiento (hay 83 estructuras conocidas) hacen estas estimaciones poco fiables (¿~70%?)

• Se sabe que todos los métodos tienden a predecir péptidos señal como helices transmembrana, así como a sobrepredecir en proteínas globulares.

También hay predictores de barriles beta

● Recientemente han aparecido algunos métodos orientados a la predicción de barriles beta (PRED-TMBB y PROF-TMB).

● La escasez de estructuras disponibles (sólo 27) hace que resulte muy difícil evaluar la calidad de dichos métodos (75-80%).

SumarioSumario





Algunos predictores de otras características 1D(Modificaciones Post-Transcripcionales, péptidos señal, etc).

ExPASy Proteomics tools http://www.expasy.ch/tools/

PSORT - prediction of signal proteins and localisation sites TargetP - prediction of subcellular localisationSignalP - prediction of signal peptides

ChloroP - prediction of chloroplast peptidesNetOGlyc - prediction of O-glycosilation sites in mammalian proteinsBig-PI - prediction of glycosil -phosphatidyl inositol modification sites DGPI - prediction of anchor and breakage sites for GPI

NetPhos - prediction of phosphorylation sites (Ser, Thr, Tyr) in eukaryotesNetPicoRNA - prediction of cleavage sites for proteases in the picornavirusNMT - prediction of N-miristoilation of N-terminalsSulfinator - predicts sulphattation sites in tyrosines

http://www.expasy.ch/tools/

Agradecimientos ...

Michael TressAmalia MuñozAna Rojas

predicción de características 1ddefinición de características 1d denominamos características 1d...

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