precipitacion dialisis centrifugacion (1)

PRACTICAS EN BIOQUIMICA: PrecipitacinDilisisUltra-centrifugacin

PURIFICACION DE PROTEINAS

Por qu se necesita purificar a las protenas?Es un paso bsico para conocer su funcin:Secuencia de AARelaciones evolutivasFuncin bioqumicaEstudio de la estructura terciaria (formacin de cristales)Dicho bioqumico: No desperdicies pensamientos puros en protenas impuras

Purificacin de ProtenasObjetivo:Lograr aislar la protena de inters

Una protena de inters puede existir en muy pequea proporcin dentro de la muestra original

Purificacin de ProtenasEnsayo de actividadDebe ser una prueba especfica para la protena de intersA ms especfico el ensayo, mejor calidad de purificacin

Cmo reconocer a la protena que se busca?

Es importante tener un punto de referencia: cantidad total de protenas en la muestraMtodos para la determinacin de protenas

Actividad especfica = actividad de la protena de inters / cantidad total de protena

Purificacin de ProtenasExtraccin de las protenas de las clulas

Fraccionar las clulas en sus componentesDeterminar en dnde se encuentra en mayor cantidad la protena de intersCentrifugacin diferencial

Purificacin de ProtenasEstrategias de separacin:Por solubilidadPor tamaoPor cargaPor afinidad de unin

Generalmente la purificacin involucra varios de estas estrategias en secuencia

El objetivo es llegar a purificar varios miligramos de protena:Estructura tridimensionalMecanismo de accin

Mtodos de Separacin

Mtodos que separan la protena entre 2 fases:Generalmente (pero no siempre):Un slido (precipitado)Un lquido (sobrenadante)Mtodos que separan protenas a diferentes tasas de movimiento sobre algn material, como una columna de cromatografa o electroforesisMtodos que separan las protenas por filtracin:Las protenas pasan por orificios muy pequeosFiltrosColumnas

Mtodos de Separacin

Los mtodos de 2 fases separan las protenas con menor eficiencia que los mtodos de tasa de movimientoLa ventaja es que son ms fciles de aplicar en grandes cantidades de materialPor eso son utilizados en etapas iniciales de purificacin, antes de aplicar mtodos que son ms difciles de realizar con volmenes grandes de muestra

PRECIPITACION DE PROTEINAS

Interacciones Moleculares en la Precipitacin de Protenas

Durante la precipitacin ocurre que las protenas se pegan entre s

Fuerzas que intervienen en la estabilidad de una protena en solucin:Fuerzas electrostticasEfecto hidrofbicoInteracciones de Van der WaalsPuentes de hidrgeno

Precipitacin de Protenas

Interacciones hidrofbicas y fuerzas de Van der Waals:Principalmente impiden que las molculas se separenNo facilitan significativamente la precipitacinFuerzas electrostticas:Generalmente son repulsivas (molculas iguales tienen carga similar y se repelen)Slo si existe una distribucin de cargas muy marcada (positiva en algunas regiones y negativa en otras), podra haber atraccin electrosttica entre 2 protenas, pero no para la formacin de agregados a gran escalaLas protenas generalmente se agregan y precipitan en su punto isoelctrico (no tienen carga, y por lo tanto no se repelen entre s)Es posible precipitar protenas catinicas ej. Ribonucleoprotenas- con polianiones no proticos como el poliacrilato, o el sulfato de protamina


The main mode of general protein-protein interaction is hydrophobic. Nonpolar patches of the protein surface are shielded by water molecules arranged in an ordered structure; when two non-polar patches come together, the water molecules are expelled and go to a free, less ordered state, which increases their entropy. This increase in the entropy of water molecules, as the number of them solvating hydrophobic surfaces decreases, is the main driving force for protein association. This is all the more effective when the proteins are denatured. Protein precipitation by removal of the shell of hydrating water, as in (NH4)2SO4 or PEG precipitation, is generally reversible, but lyophilization or even solvent precipitation may be irreversible. We have generally assumed that the proteins are soluble in our extract. However, as mentioned last time, maximum protein solubility is at salt concentration similar to that of the cytoplasm: 0.15 to 0.25 M for eukaryotic cells, 0.3 to 0.6 M in bacteria. T7 RNA polymerase is far more soluble at 0.30 M KCl than at 0.25 or 0.35 M. Proteins which are insoluble at very low salt, requiring 0.2 to 0.3 M to be soluble, are said to be salted in. They may precipitate out on desalting by dialysis or gel filtration later in the procedure; they could thus gum up a gel filtration column. Dialysis is described in Rosenberg, pp. 121-3 We should further contrast negative and positive precipitation methods. A negative method is one which leaves the desired protein active in solution; a positive method precipitates it. Thus negative methods can include selective denaturation procedures which would never yield an active precipitate.

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En disolucin acuosa, los residuos hidrofbicos de las protenas se acumulan en el interior de la estructura, mientras que en la superficie aparecen diversos grupos con carga elctrica, en funcin del pH del medio. En torno a los grupos cargados, los dipolos del agua se orientan conforme a la carga elctrica de cada grupo, de tal manera que la protena presenta una capa de solvatacin formada por el agua de hidratacin, que es el agua retenida por las cargas elctricas de la superficie de las protenas. Los AA polares sin carga tambin se disponen en la superficie, donde interaccionan con el agua mediante puentes de hidrgeno.

Precipitacin de ProtenasCualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su estabilidad en disolucin y provocar la precipitacin. desaparicin total o parcial de la envoltura acuosaneutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivoruptura de los puentes de hidrgeno

Esto ocurre porque se facilita la agregacin intermolecular


La precipitacin suele ser consecuencia del fenmeno llamado desnaturalizacin.

Precipitacin de ProtenasSe llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija.Estado nativo Estado desnaturalizado


Cuando la protena no ha sufrido ningn cambio en su interaccin con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Cualquier alteracin de la estructura nativa que modifique su interaccin con el disolvente y que provoque su precipitacin dar lugar a una estructura desnaturalizada. En una protena cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan slo tienen en comn la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la componen. Los dems niveles de organizacin estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada.


La desnaturalizacin provoca diversos efectos en la protena: cambios en las propiedades hidrodinmicas de la protena: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusin disminucin de su solubilidad, ya que los residuos hidrofbicos del interior aparecen en la superficie prdida de las propiedades biolgicas


Una protena desnaturalizada cuenta nicamente con su estructura primaria. Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalizacin es reversible. El proceso mediante el cual la protena desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalizacin. Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificacin de protenas, ya que no todas la protenas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta.En algunos casos, la desnaturalizacin conduce a la prdida total de la solubilidad, con lo que la protena precipita. La formacin de agregados fuertemente hidrofbicos impide su renaturalizacin, y hacen que el proceso sea irreversible.


Los agentes que provocan la desnaturalizacin de una protena se llaman agentes desnaturalizantesagentes fsicos: temperaturaagentes qumicos: detergentes, disolventes orgnicos, pH, fuerza inica Como en algunos casos el fenmeno de la desnaturalizacin es reversible, es posible precipitar protenas de manera selectiva mediante cambios en:la polaridad del disolventela fuerza inica el pHla temperatura

Efecto de la Polaridad del Solvente

La polaridad del disolvente disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetonaCon ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacinLos disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrofbico de las protenas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin. La accin de los detergentes es similar a la de los disolventes orgnicos.

Efecto de la Fuerza InicaUn aumento de la fuerza inica del medio (por adicin de sulfato de amonio, urea o hidrocloruro de guanidinio, por ejemplo) tambin provoca una disminucin en el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la protena, ya que estos solutos (1) compiten por el agua y (2) rompen los puentes de hidrgeno o las interacciones electrostticas, de forma que las molculas proteicas se agregan y precipitan. En muchos casos, la precipitacin provocada por el aumento de la fuerza inica es reversibleMediante una simple dilisis se puede eliminar el exceso de soluto y recuperar tanto la estructura como la funcin original. A veces es una disminucin en la fuerza inica la que provoca la precipitacin. As, las protenas que se disuelven en medios salinos pueden desnaturalizarse al dializarlas frente a agua destilada, y se renaturalizan cuando se restaura la fuerza inica original.

Efecto del pHLos iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos a la fuerza inicaAdems de afectar a la envoltura acuosa de las protenas tambin afectan a la carga elctrica de los grupos cidos y bsicos de las cadenas laterales de los aminocidosEsta alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones electrostticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitacinLa solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsin electrosttica que pudiera dificultar la formacin de agregados.

Efecto de la TemperaturaCuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, y se desnaturalizanUn aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrofbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada

DIALISIS

Filtracin MolecularFiltracin convencional:separa partculas suspendidas en fluidoslas suspensiones pasan a travs de un material poroso, en el cual las partculas quedan retenidas y pueden ser separadas del fluidoFiltracin molecular:Uso de membranas semipermeablesPermite separar molculas disueltas en funcin de su tamao

Dilisis

La dilisis es uno de los mtodos de filtracin molecular ms utilizadosSe coloca una solucin acuosa que contiene molculas de distintos tamaos dentro de una bolsa de dilisis que se encuentra a su vez sumergida en un gran volumen de un buffer determinadoLas molculas pequeas del soluto (excepto aquellas que se encuentran fuertemente cargadas) pasan libremente a travs de la membrana, hasta alcanzar el equilibrio. Reemplazando la solucin externa repetidas veces, puede lograrse reducir la concentracin de las molculas pequeas a valores prcticamente despreciables.El agua pasa tambin libremente a travs de la bolsa, ocasionando as concentracin o dilucin, dependiendo de si la solucin interna se encuentra ms o menos concentrada que la externa (efecto osmtico).

DilisisDilisis inversa:concentracin de material dentro de la membrana de dilisisla membrana de dilisis llena es enterrada en un polmero seco y soluble en agua que no pueda penetrar en la membrana, por ejemplo, polietilenglicol o carboximetilcelulosael agua abandona la bolsa para equilibrarse con la fase externatambin puede utilizarse sacarosa, pero debido a que sta es una sustancia dializable, puede entrar en la bolsa de dilisis cuando el agua es eliminada

Protocolos de dilisis para disminuir la concentracin de sales de 1 M a menos de 1 mM

Muestra inicial: 50 ml de una solucin de protena en buffer que contiene sulfato de amonio 1 M

PROCEDIMIENTO 1Dilisis contra 1 L de aguaSe llega a equilibrio la bolsa se hincha hasta 100 ml en 3 y 5 h.[sulfato de amonio] en el equilibrio = 95 mMReemplazar el dializado por agua purala bolsa se hincha hasta 110 ml[sulfato de amonio] en el equilibrio = 9.3 mMReemplazar el dializado por agua purano hay hinchamiento de la bolsa[sulfato de amonio] en el equilibrio = 0.9 mM

PROCEDIMIENTO 2 Dializar contra 5 litros de agua la bolsa se hincha hasta 110 ml[sulfato de amonio] = 20 mM Dializar contra 5 litros de aguano hay hinchamiento de la bolsa [sulfato de amonio] en el equilibrio = 0.4 mM

UltrafiltracinUna modificacin importante de la membrana de dilisis es el Diaflo (Amicon). Esta membrana est formada por un polmero muy fino con un tamao de poro que vara entre 0.2 y 10 nm, montado sobre una capa de soporte gruesa (.05-.25 mm de espesor), con poros muy grandes. Estas membranas pueden utilizarse para procesos de concentracin (empleando una membrana a travs de la cual slo pase agua), y de eliminacin de sales en preparaciones para cromatografa, y fraccionamiento por tamao molecular. La velocidad de flujo a travs de estas membranas es tan baja que debe aplicarse presin (aire comprimido o nitrgeno, hasta a 5 atmsferas). Por lo general, para utilizar estas membranas se necesitan soportes especiales. Con este mtodo se pueden concentrar volmenes de 50 ml a 5 ml o de 200 ml a 10 ml en una hora o menos, especialmente si la concentracin final es an relativamente baja (la velocidad de filtracin cae rpidamente a medida que la concentracin de la sustancia que se quiere concentrar crece).

UltrafiltracinOtra forma de ultrafiltracin consiste en aplicar vaco o fuerza centrfuga al recipiente en que se encuentra la membrana semipermeable cargada con la muestra.

Datos para Trabajar con Membranas de DilisisLas membranas vienen tratadas con glicerol y un agente plastificante, para evitar el desecamiento y mantenerlas flexibles. Para mantener las membranas en buen estado, es conveniente almacenarlas en refrigeracin.Lavar la membrana de dilisis (hervir en una solucin de EDTA-NaHCO3) antes de poner la muestra para evitar contaminacin. Existe mayor probabilidad de contaminacin cuando la muestra es muy diluida, porque la relacin [superficie de membrana de dilisis]/[molcula de inters] es elevada. Las soluciones con 10 mg/ml de muestra o ms son difcilmente contaminadas, por lo que en estos casos se suele utilizar la membrana de dilisis sin lavar.Llenar la bolsa de dilisis dejando espacio para un posible incremento de volumen si es que la muestra es muy concentrada. De otra forma, la bolsa se hinchara produciendo presin, pudiendo reventarse.Las membranas de dilisis se clasifican por su tamao de paso mximo (molecular weight cutoff, MWCO). Los valores que vienen especificados de fbrica son nominales; dependen de las sustancias usadas para la caracterizacin, entre otros factores. Por ello es recomendable que las membranas sean caracterizadas para los requerimientos especficos de cada investigacin.Es posible usar una autoclave para esterilizar las membranas de dilisis, siempre y cuando se mantengan hmedas durante el proceso. Sin embargo, el someter las membranas a elevadas temperaturas puede alterar su tamao de paso mximo o su permeabilidad al solvente; por ello, es recomendable no hervir ni usar la autoclave cuando esta caracterstica es crtica para el proceso, o en todo caso, se sugiere "recaracterizar" la membrana para el sistema de inters.

Caracterizacin de las Membranas de Dilisis

Con una concentracin de soluto conocida, temperatura y composicin de buffer constantes, es posible medir la dilisis en funcin del tiempo.

Medicin de la tasa de dilisis y el tiempo de escape medioSe pone la solucin con concentracin de soluto conocida dentro de la membrana de dilisis y el solvente puro afuera. Se mantiene agitando con una pastilla magntica, y el solvente externo es cambiado con la frecuencia suficiente como para que la difusin a travs de la membrana ocurra contra una concentracin muy cercana a cero.En este sistema, a una temperatura dada y para un soluto idealmente puro, la tasa de difusin seguir una cintica de primer orden. Una grfica del logaritmo de la concentracin de soluto dentro de la membrana vs. tiempo dar una lnea recta.Las porosidades relativas pueden extrapolarse de las diferencias en las pendientes (tasa de dilisis) de las rectas obtenidas para solutos de tamaos distintos o, de manera ms sencilla, comparando los tiempos a los cuales la concentracin del soluto dentro de la bolsa de dilisis se ha reducido a la mitad, es decir, el tiempo de escape medio.

CENTRIFUGACION

CentrifugacinLa centrifugacin es un mtodo que permite separar las partculas presentes en un medio lquido o semilquido, utilizando una fuerza de aceleracin, que imprime a las partculas una velocidad y un movimiento diseccionado, aprovechando de su densidad caracterstica

Cada partcula, cuerpo o molcula tiene un tamao (volumen), y tiene una masa; ambas confieren a dicha sustancia una densidad.

(Densidad) = Masa/Volumen

Centrifugacin

Se basa en hacer girar un tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulacin en el fondo del mismo de las partculas que tienden a hundirse por tener una densidad menor que la del medio en que se encuentran.

As, despus de la centrifugacin la muestra, homognea, se habr separado en dos fracciones : sobrenadante, fraccin homognea que no ha sedimentado, y el sedimento (pellet) que ha quedado adherida al fondo del tubo.

La fuerza centrfuga es aplicada a cada partcula de la muestra la cual ser sedimentada en un ndice que es proporcional a la fuerza centrfuga aplicada.

CentrifugaLas centrfugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentacin en poco tiempo de las partculas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea

Cada partcula de la muestra la cual ser sedimentada en un ndice que es proporcional a la fuerza centrfuga aplicada

En general se diferencian en funcin de los mrgenes de aceleracin a que someten a las muestras en : centrfugas (de pocas g a aprox. 3000 g), super-centrfugas (o centrfugas de alta velocidad, rango de 2000 g a 20000 g) y ultracentrfugas (de 15000 g a 600000 g)

En las centrfugas se suele controlar la temperatura de la cmara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la friccin. En las ultracentrfugas, la velocidad extrema (ms de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vaco en la cmara de la centrfuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra.

RotoresEn una centrfuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos : Rotor basculante. Los tubos se colocan en un dispositivos (cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en disposicin perpendicular al eje de giro. As pues los tubos siempre giran situados perpendicularmente al eje de giro.

Rotor de ngulo fijo. Los tubos se insertan en orificios en el interior de rotores macizos. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se sita paralelo al eje de giro. Este tipo de rotores es tpico de ultracentrfugas y se emplea en separaciones de molculas en gradientes de densidad autogenerados (por ej. de cloruro de cesio).

Parmetros ImportantesLos parmetros a tener presentes en cualquier centrifugacin, que determinarn las condiciones son :

Volumen de solucin a centrifugar, que determinar el tipo de tubos y rotores a emplear.

Naturaleza qumica de la solucin, que determinar la naturaleza del tubo a emplear

Diferencial de densidad entre la partcula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra. En general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor tiempo y menor fuerza de aceleracin) sedimentar. Cuando el diferencial es muy pequeo se pueden aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.

Parmetros ImportantesTodo rotor tiene unas propiedades que determinan las condiciones en que se podr centrifugar la muestra.

Son especialmente importantes el ngulo de giro, el radio mnimo, medio y mximo, y la velocidad mxima de giro.

La relacin entre la velocidad de giro, medida en revoluciones por minuto (rpm) y la fuerza de aceleracin (fuerza centrfuga relativa, RCF : relative centrifuge force) a que se somete la muestra (g) se recoge en la expresin siguiente :

RCF = 1.118 * 10-5 * r * (rpm)2

Para conocer el valor en gravedades de las rpm, se aplica la frmula de fuerza de centrifugacin relativa:

Centrifugacin Diferencial

La centrifugacin diferencial se basa en la existencia de diferentes partculas en la suspensin que difieren en su densidad de la del medio.

Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleracin) sedimentarn las partculas mayores y/o ms densas.

Cuando el sobrenadante de la primera centrifugacin es centrifugado de nuevo en condiciones de mas tiempo y ms fuerza de aceleracin sedimentan de nuevo las partculas ms densas presentes y as sucesivamente.

Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugacin y obtener una coleccin de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partculas de diferente tamao y/o densidad.

Sedimentacin

La sedimentacin es el transporte de partculas en un campo de fuerza de centrifugacin. Permite determinar peso molecular, densidad y forma de macromolculas y organelas celulares.

Coeficiente de sedimentacin Los principios bsicos de la teora de sedimentacin, se originan de la ley de Stokes, la cual fue creada para medir la sedimentacin de una esfera en un campo gravitacional, para as mostrar que la velocidad de la esfera alcanza un valor constante y la fuerza neta en esta es igual a la fuerza de resistencia de este movimiento a travs del lquido. Coeficiente de sedimentacin 1 dr S = ----- X ------ W2 r dt W : velocidad del rotor Dr/dt : ndice de movimiento de dos partculas (cm/s)

Velocidad de SedimentacinAlternativamente es posible aprovechar esa diferencia en la velocidad necesaria para sedimentar las partculas para realizar una centrifugacin en un medio en el que exista un gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior. Despus de un tiempo las diferentes poblaciones de partculas se sitan en diferentes profundidades del tubo.Haciendo un pequeo orificio en el fondo del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que contengan a las distintas poblaciones separadas. Este es el fundamente de la ultracentrifugacin preparativa, que permite determinar la velocidad de sedimentacin de una partcula (medida en unidades Svedverg, S).

Los coeficientes de sedimentacin son usualmente expresados en Sveldbergs (S) o 10-13s. De esta manera, una partcula cuyo coeficiente de sedimentacin es medido en 10-12s.= 10x10-13s., es decir que tiene un valor de 10S. Una partcula en un campo gravitacional se comporta segn la LEY DE STOKES d2 ( hP - hL ) V = ____________ x g 18 n Donde: V = velocidad de sedimentacin d = dimetro de la partcula hP = densidad de la partcula hL = densidad del lquido n = viscosidad del medio g = fuerza gravitacional

Se cumple: - La velocidad de sedimentacin es proporcional al tamao de la partcula - La velocidad de sedimentacin es proporcional a la diferencia entre la densidad del medio circundante y la densidad de la partcula - La velocidad de sedimentacin es 0, cuando la densidad de la partcula e igual a la densidad del medio circundante - La velocidad de sedimentacin disminuye al aumentar la viscosidad del medio - La velocidad de sedimentacin aumenta al aumentar la fuerza del campo centrfugo El coeficiente de sedimentacin es una constante caractristica de cada organelo o macromolcula y sus unidades se dan en Svedvergs, tomando el nombre de su descubridor. El tiempo de centrifugacin hasta la clarificacin de una organela se define por: K T (horas) = --- SDonde: S= coeficiente de sedimentacin de la organela K= constante del rotor. ( depende del ngulo de inclinacin del tubo de centrifugacin con respecto al eje de rotacin)

Differential centrifugation separates a mixture of particles (macromolecules, cell organ-elles, and cells) that differ in mass or density. The most dense particles collect at the bottom of the tube as a pellet. The least dense particles remain in the liquid supernatant, which can be transferred to another tube. (Two common centrifugation techniques for separating particlesRate-zonal centrifugation separates particles or molecules that differ in mass but may be similar in shape and density (e.g., RNA molecules). Here two particles of different mass separate into two zones.

Figure 4.15. Zonal Centrifugation. The steps are as follows: (A) form a density gradient, (B) layer the sample on top of the gradient, (C) place the tube in a swinging-bucket rotor and centrifuge it, and (D) collect the samples. [After D. Freifelder, Physical Biochemistry, 2d ed. (W. H. Freeman and Company, 1982), p. 397.]

Repeated centrifugation at progressively higher speeds will fractionate homogenates of cells into their components. In general, the smaller the subcellular component, the greater is the centrifugal force required to sediment it.

Typical values for the various centrifugation steps referred to in the figure are: low speed1000 times gravity for 10 minutesmedium speed20,000 times gravity for 20 minuteshigh speed80,000 times gravity for 1 hourvery high speed150,000 times gravity for 3 hourCell fractionation by centrifugation

. Comparison of velocity sedimentation and equilibrium sedimentation.Velocity SedimentationEquilibrium SedimentationSubcellular components sediment at different speeds according to their size and shape when layered over a dilute solution containing sucrose.

To stabilize the sedimenting bands against convective mixing caused by small differences in temperature or solute concentration, the tube contains a continuous shallow gradient of sucrose that increases in concentration toward the bottom of the tube (typically from 5% to 20% sucrose).

Following centrifugation, the different components can be collected individually, most simply by puncturing the plastic centrifuge tube and collecting drops from the bottom, as illustrated hereSubcellular components move up or down when centrifuged in a gradient until they reach a position where their density matches their surroundings.

Although a sucrose gradient is shown here, denser gradients, which are especially useful for protein and nucleic acid separation, can be formed from cesium chloride.

Figure 9.4. Isolation of rough ER When cells are disrupted, the ER fragments into small vesicles called microsomes. The microsomes derived from the rough ER (rough microsomes) are lined with ribosomes on their outer surface. Because ribosomes contain large amounts of RNA, the rough microsomes are denser than smooth microsomes and can be isolated by equilibrium density-gradient centrifugation.

Figure 4.7. Satellite DNA Equilibrium centrifugation of Drosophila DNA in a CsCl gradient separates satellite DNAs (designated I IV) with buoyant densities (in g/cm3) of 1.672, 1.687, and 1.705 from the main band of genomic DNA (buoyant density 1.701).

Hematocrito

precipitacion dialisis centrifugacion (1)

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