praktikum pewarnaan gram

Download Praktikum Pewarnaan Gram

If you can't read please download the document

Upload: chairil238

Post on 17-Jan-2016

76 views

Category:

Documents


15 download

DESCRIPTION

1

TRANSCRIPT

PEWARNAAN GRAM

Modul Kulit dan Jaringan Penunjang 2010

SEKSI PENDIDIKAN 2009

Ade Ilyas Mukmin

Anggi Puspita Nalia Pohan

Dessy Framita

Dina elita

Karina Kalani Firdaus

Monika Besti Yolanda

Naela Himayati Afifah

Oktrian

Riska Wahyuningtyas

Rizka Ramadhani

Zahra Suhardi

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA 2010

1

Tentir Praktikum Pewarnaan Gram

Landasan Teori

Pewarnaan gram terdiri dari 4 komponen, yaitu:

Zat warna primer/primary stain (kristal karbol ungu, metil ungu, atau Gentian ungu)

Mordant (Grams Iodine, atau cairan lugol)

Decolorizer (etil alcohol 95%, aseton, atau campuran etanol dan aseton dengan perbandingan 1:1)

Zat warna kedua/counter stain (dilute carbol fuchsin, safranin, atau neutral red)

a. Prosedur:

Mikroba pada gelas alas ditutup/direndam dengan beberapa tetes zat warna primer. Gentian

ungu adalah campuran dari metal ungu dan kristal ungu. Zat warna primer mengubah

semua bakteri menjadi berwarna ungu. Setelah beberapa menit direndam dengan zat warna tersebut, sediaan dicuci dengan air.

Kemudian, sediaan tersebut ditetesi beberapa tetes Grams Iodine atau cairan lugol dan dibiarkan beberapa menit. Hal ini akan menyebabkan terjadinya pembentukan kompleks dye-iodine di dalam sitoplasma. Grams iodine berperan sebagai mordant (perekat zat warna). Sediaan kemudian dicuci lagi dengan air, lalu didekolorisasi di dalam etil alcohol atau aseton. Campuran antara aseton dan etil alcohol (1:1) juga dapat digunakan untuk dekolorisasi. Proses dekolorisasi cepat terjadi, sehingga tidak boleh lebih dari 30 detik.

Aseton adalah decolorizer yang sangat poten dan dapat digunakan hanya dalam waktu 2-3 detik. Campuran antara etanol dan aseton bekerja lebih lambat daripada aseton murni.

Dekolorisasi adalah bagian yang paling penting dalam pewarnaan gram dan kesalahan-kesalahan dapat terjadi pada proses ini. Dekolorisasi yang terlalu lama dapat menyebabkan sediaan tidak terlalu berwarna ungu, sehingga bakteri Gram positif yang seharusnya berwarna ungu pun dapat terlihat berwarna pink. Sementara itu, dekolorisasi yang terlalu cepat dapat menyebabkan sediaan terlalu berwarna ungu, sehingga bakteri Gram negatif yang seharusnya

2

berwarna merah/pink pun dapat terlihat seperti Gram positif (berwarna ungu). Setelah dekolorisasi, sediaan langsung dicuci di dalam air.

Terakhir, sediaan ditetesi beberapa tetes zat warna kedua (counter stain), seperti dilute carbol fuchsin, neutral red, atau safranin. Sediaan kemudian dicuci dengan air. Air yang berlebihan dapat dikeringkan menggunakan kertas saring, kemudian dibiarkan sampai benar-benar kering sebelum dilihat di bawah mikroskop.

Bakteri yang tetap mengikat kompleks dye-iodine primer dan tetap berwarna ungu disebut Gram positif, sedangkan bakteri yang terdekolorisasi dan mengikat zat warna kedua (pink/merah) disebut Gram negative.

Basic fuchsin (biasanya dalam bentuk larutan karbol fuchsin) dapat mewarnai bakteri Gram negative lebih intens daripada safranin, sehingga lebih mudah dilihat. Beberapa bakteri yang sulit diwarnai dengan safranin, seperti Haemophillus spp., Legionella spp, dan beberapa bakteri anaerob, dapat langsung diwarnai oleh basic fuchsin.

b. Mekanisme reaksi Gram:

Berbagai teori telah diajukan untuk menjelaskan mengapa beberapa bakteri dapat mempertahankan zat warna primer, dan beberapa lainnya tidak dapat. Teori seperti perbedaan dalam pH sitoplasma (2 pada bakteri Gram positif, dan 3 pada bakteri Gram negative), serta keberadaan Magnesium ribonukleat pada bakteri Gram positif belum dapat diterima secara luas. Ketebalan dinding sel Gram positif dan kandungan lemak yang lebih banyak pada dinding sel Gram negative merupakan alasan yang lebih dapat diterima untuk menjelaskan reaksi pewarnaan Gram.

Diyakini bahwa kristal ungu yang bermuatan positif masuk ke dalam sel melalui dinding sel dan membrane sel, dan terikat pada komponen-komponen yang bermuatan negative di dalam sel. Penambahan iodine yang bermuatan negative (di dalam mordant/lugol) akan mengikat zat warna bermuatan positif yang tadi, dan membentuk kompleks

3

dye-iodine di dalam sel. Kristal ungu (heksametil-para-rosanilin klorida) berinteraksi dengan larutan KI-I2 (lugol) melalui pertukaran anion untuk membentuk presipitat kimia. Anion klorida yang kecil pada kristal ungu akan digantikan oleh iodida yang lebih besar, sehingga kompleks yang terbentuk menjadi tidak larut dalam air.

Selama dekolorisasi, alcohol melarutkan lipid yang ada pada membrane luar bakteri gram negatif dan membawa serta kompleks dye-iodine ke luar sel. Lapisan tipis peptidoglikan tidak dapat mempertahankan kompleks dye-iodine tersebut. Kompleks dye-iodine tercuci dari sel Gram negative bersama dengan membrane luar. Oleh karena itu, sel Gram negative dapat langsung terdekolorisasi.

Sementara itu, sel Gram positif menjadi dehidrasi akibat pemberian alcohol, sehingga pori-porinya tertutup akibat dinding sel yang menyusut selama dehidrasi. Kompleks dye-iodine pun terjebak di dalam lapisan peptidoglikan yang tebal dan tidak dapat terdekolorisasi.

Tambahan

Walaupun pewarnaan Gram ditujukan untuk pewarnaan bakteri, beberapa fungi seperti Candida dan Cryptococcus juga dapat dideteksi dengan pewarnaan Gram, dan bersifat Gram positif (berwarna ungu).

Meskipun demikian, untuk mendeteksi fungi tersebut biasanya menggunakan KOH 10%.

Spora pada bakteri yang memilikinya (endospora) tampak berupa wilayah yang jernih, tidak terwarnai.

Alat dan Bahan Pewarnaan Gram

Alat:

Gelas alas

Sengkelit (alat untuk mengambil mikroba)

Kertas saring

Pensil gelas

Pensil warna

Rak untuk pewarnaan

Bunsen/lampu spiritus

4

Bahan:

Kristal karbol ungu/Gentian ungu

Cairan Lugol

Etil alcohol 95%

Safranin

NaCl 0,9%

Biakan bakteri

Cara Kerja

Buat dua buah lingkaran pada gelas alas menggunakan pensil gelas.

Kemudian letakkan gelas alas tersebut pada meja (tidak boleh di atas kertas, karena kertas berwarna putih, jadi cairannya tidak terlihat, sementara mejanya berwarna hitam, jadi sedikit lebih terlihat).

Gelas alas diletakkan terbalik (lingkaran yang tadi dibuat harus menghadap ke bawah, jadi tidak akan terkena biakan bakterinya).

Ambillah biakan bakteri, kemudian sebarkan pada salah satu lingkaran. Ambil biakan bakteri lainnya, kemudian sebarkan pada lingkaran lain.

Cara mengambil biakan:

Gunakan sengkelit dengan tangan kanan, kemudian bakar sampai berwarna merah.

Ambil tabung biakan dengan tangan kiri, kemudian kapas penutupnya digenggam dengan jari manis dan kelingking tangan kanan (ibu jari, telunjuk, dan jari tengah masih menggenggam sengkelit). Putar tabung biakan dengan tangan kiri sambil menariknya, sehingga kapas penutup akan terlepas.

Kapas penutup tabung harus terus digenggan, jangan letakkan di atas meja.

Setelah tabung biakan terbuka, bakar sebentar atau lewatkan ujung tabung pada api.

Masukkan sengkelit pada tabung untuk mengambil biakan.

o Jika biakannya dalam medium cair, maka sengkelit cukup dicelupkan, kemudian dioleskan pada lingkaran di gelas alas.

o Jika biakannya dalam medium agar, maka kita harus membuat suspensi (campuran bakteri dan larutan NaCl) terlebih dahulu.

5

Untuk membuat suspensi, ambillah tabung larutan NaCl dan oleskan larutan tersebut pada lingkaran di gelas alas dengan prosedur yang sama. Kemudian, ambillah tabung biakan (medium agar), dan dengan prosedur yang sama oleskan biakan pada lingkaran yang sudah basah oleh larutan NaCl.

Hati-hati ketika memasukkan sengkelit ke dalam tabung biakan. Sengkelit cukup dioleskan pada permukaan agar (jangan sampai ada agar yang

kebawa sengkelit).

Setelah bakteri dioleskan pada gelas alas, bakar ujung tabung biakan maupun tabung NaCl, kemudian tutup kembali dengan kapas yang tadi. Lalu simpan kembali tabung tersebut

Bakar juga sengkelit sampai berwarna merah, kemudian simpan sengkelit.

Keringkan bakteri di udara

Setelah kering, gunakan penjepit kayu untuk mengambil gelas alas, kemudian lewatkan gelas alas tersebut di atas api, 2-3 kali. Hal ini dilakukan untuk menempelkan bakteri pada gelas alas (untuk fiksasi).

Bagian yang ada bakterinya jangan terkena api secara langsung. Jadi yang dibakar itu bagian bawahnya.

Teteskan Gentian ungu pada sediaan sampai seluruhnya terendam, dan biarkan selama 1 menit.

Cuci dengan air yang mengalir. Airnya jangan terlalu besar, nanti bakterinya bisa kebawa air.

Teteskan cairan Lugol sampai seluruhnya terendam, biarkan selama 1 menit, kemudian cuci dengan air.

Masukkan sedian (celupkan) ke dalam gelas yang berisi alcohol. Sediaan dinaik-turunkan (dicelup-celupkan) berkali-kali sampai tidak ada zat warna ungu yang mengalir dari sediaan lagi.

(Di buku panduan praktikum sih kyk gitu, tp klo d sumber teori tidak boleh melebihi 30 detik. Alkohol kan utk ngilangin warna ungunya (dekolorisasi), jd klo kelamaan, yg gram positif warnanya jd kurang ungu. Trus klo kecepetan, yg gram negative jd agak-agak ungu. Jd katanya hrus tpat 30 detik. Klo msih ada ungu-ungunya, jangan dipaksa diilangin, soalnya mungkin itu bakterinya)

Cuci dengan air

Teteskan safranin sampai seluruhnya terendam, biarkan selama 45 detik, kemudian cuci dengan air

6

Keringkan dengan kertas saring (kertasnya cukup ditempelkan ke sediaan, jangan digosok-gosokkan ke sediaan). Kemudian tunggu beberapa saat sampai benar-benar kering.

Lihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100 dengan meneteskan minyak emersi. (Seperti biasa, lihatnya dari perbesaran 4x dulu, trus 10, 40, baru 100.

Dari pengalaman praktikum kemaren, ada beberapa mikroskop yg perbesaran 40 nya gak keliatan, gak tau knapa. Jd klo dpt mikroskop yg kyk gtu, klo udh keliatan yg perbesaran 10, langsung ke perbesaran 100 aja)

7

Hasil

Streptococcus sp.

8

Staphylococcus sp.

9

10

11

12

Candida albicans

Maaf ya kalo ada gambar yang tidak terlalu jelas, yang pasti itu emang di dapat dari miroskop saat praktikum. Jadi harap maklum aja ya..

By : Ade Ilyas Mukmin

13