Prácticas TPP

Salvador Martínez de Bartolomésmartinez@proteored.orgBioinformatics support – ProteoRedProteomics Facility, National Center for Biotechnology, Madrid

Prácticas TPP

• TPP: http://localhost/tpp-bin/tpp_gui.pl• Usuario: tutorial, password: tutorial• Datos de entrada:

– Fichero Raw: 220708_EC_JK_iTRAQ_3ug.RAW de Thermo, LTQ Linear Ion Trap

– Localizado en: “C:\Inetpub\wwwroot\ISB\data\practica_Cordoba” directorio de trabajo

• Flujos de trabajo:– SEQUEST– MASCOT– Tandem

Flujos de trabajo del TPP con SEQUEST

RAW Thermo

mzXML

Sequest.params

SEQUEST .SRF

.Out

pepXMLPeptideProphet

interactpepXML

ProteinProphet

interactProtXML

Bioworks

Prácticas TPP

• SEQUEST (1)– La búsqueda ya se hizo con sequest en un

ordenador con licencia. Los resultados fueron guardados en el fichero: JK_itraq_3ug_dedtas.SRF.

– Convertir SRF en Outs:• Abrir Bioworks Browser. ToolsConvertTurbo Sequest

ResultsCreate DTA and OUT files• Turbo Sequest Results: C:\Inetpub\wwwroot\ISB\data\

practica_Cordoba\SEQUEST\Dtas_Outs• SRF file: C:\Inetpub\wwwroot\ISB\data\practica_Cordoba\

SEQUEST\SRFs\ JK_itraq_3ug_dedtas.SRF

Prácticas TPP

• SEQUEST (2)– Crear pepXML a partir de OUTs:

• En TPP, en el flujo de trabajo de SEQUEST, seleccionar pestaña pepXML

• 1. Directory with .out files to convert to pepXML: C:\Inetpub\wwwroot\ISB\data\practica_Cordoba\SEQUEST\Dtas_Outs

• 2. (Optional) Specify Sequest Parameters File: C:\Inetpub\wwwroot\ISB\data\parameters\busqDir.params

• 3. Options: nada• Click en “Convert to pepXML”• Se ha creado el fichero “Output_SEQUEST.pep.xml”• Abrir el visor de pepXML, pinchando en pepXML

Prácticas TPP

• SEQUEST (3)– Analizar los péptidos con peptideProphet

• En Analysis pipeline (SEQUEST), seleccionar Analyze Peptides

• Select File(s) to Analyze: Output_SEQUEST.pep.xml • Output File and Filter Options : cambiar el nombre a

sequest.interact.pep.xml• Peptide Prophet options y subsiguientes menús: nada• Click en “Run XInteract”• Se crea el fichero sequest.interact.pep.shtml.• Verlo con el visor de pepXMLs, clickando en “View”

Prácticas TPP

• SEQUEST (4)– Analizar las proteínas con proteinProphet

• En Analysis pipeline (SEQUEST), seleccionar Analyze Proteins

• Select File(s) to Analyze: sequest.interact.pep.xml• Output File and Filter Options : cambiar el nombre a

SEQUEST.interact.prot.xml• Peptide Prophet options y subsiguientes menús: nada• Click en “Run XInteract”• Se crean los ficheros SEQUEST.interact.prot.shtml y

sequest.interact.prot.xml• Verlo con el visor de protXMLs, clickando en “View”• Observar la tasa de error en Sensitivity/Error Info

Flujos de trabajo del TPP con MASCOT

RAW Thermo

mzXML MASCOT.dat

pepXMLPeptideProphet

interactpepXML

ProteinProphet

interactProtXML

mgf

Prácticas TPP• MASCOT (1)– La búsqueda ya se hizo con MASCOT. Los resultados fueron

exportados en formato pepXML en el fichero: Output_MASCOT.pep.xml

– Crear pepXML a partir de DAT:• En TPP, en el flujo de trabajo de MASCOT, seleccionar pestaña

pepXML• 1. Files to convert to pepXML:

c:/Inetpub/wwwroot/ISB/data/practica_Cordoba/MASCOT/Output_MASCOT.dat

• 2. Specify Database Used in MASCOT Search: c:/Inetpub/wwwroot/ISB/data/dbase/Uniprot_sprot_jul08_HUMAN/Bioinfo_Course_spHUMAN.fasta

• 3. Options: nada• Click en “Convert to pepXML”• Se ha creado el fichero “Output_MASCOT.pep.xml”• Abrir el visor de pepXML, pinchando en pepXML (quizás da

error)

Prácticas TPP

• MASCOT (2)– Analizar los péptidos con peptideProphet

• En Analysis pipeline (MASCOT), seleccionar Analyze Peptides

• Select File(s) to Analyze: Output_MASCOT.pep.xml • Output File and Filter Options : cambiar el nombre a

mascot.interact.pep.xml• Peptide Prophet options y subsiguientes menús: nada• Click en “Run XInteract”• Se crea el fichero mascot.interact.pep.shtml.• Verlo con el visor de pepXMLs, clickando en “View”

Prácticas TPP

• MASCOT (3)– Analizar las proteínas con proteinProphet

• En Analysis pipeline (MASCOT), seleccionar Analyze Proteins

• Select File(s) to Analyze: mascot.interact.pep.xml• Output File and Filter Options : cambiar el nombre a

mascot.interact.prot.xml• Peptide Prophet options y subsiguientes menús: nada• Click en “Run XInteract”• Se crean los ficheros mascot.interact.prot.shtml y

mascot.interact.prot.xml• Verlo con el visor de protXMLs, clickando en “View”• Observar la tasa de error en Sensitivity/Error Info

Flujos de trabajo del TPP con TANDEM

RAW Thermo

mzXML TANDEM.xml.tandem

pepXMLPeptideProphet

interactpepXML

ProteinProphet

interactProtXML

mgf

Prácticas TPP• TANDEM(1)

– Ahora vamos a hacer la búsqueda en TANDEM a través de GPM http://localhost/tandem/thegpm_tandem.html

– Buscar en TANDEM con GPM: http://localhost/tandem/thegpm_tandem.html

• Click en “advanced page”• 1. spectra: Seleccionar como entrada el fichero:

220708_EC_JK_iTRAQ_3ug.mgf en el directorio MASCOT• 2. taxon: Selecciona uniprot_sprot (human)• Add to gpmDB: no• Fragment error tol: 0.6 Da• Parent mass error: 1.2 Da• Refine model: no

Prácticas TPP• TANDEM(2)

• Missed cleavage sites allowed: 2• Click en “Find models”

– Exportar la búsqueda:• Con el botón derecho en XML: guardar enlace como…• Guardar el fichero en C:\Inetpub\wwwroot\ISB\data\

practica_Cordoba\XTANDEM\Output_TANDEM.tandem

Prácticas TPP• TANDEM(3)

– Crear pepXML a partir de tandem:• En TPP, en el flujo de trabajo de TANDEM, seleccionar

pestaña pepXML• 1. Files to convert to pepXML:

c:/Inetpub/wwwroot/ISB/data/practica_Cordoba/XTANDEM/Output_tandem.xml.tandem

• Click en “Convert to pepXML”• Se ha creado el fichero

“Output_tandem.xml.tandem.pep.xml”• Abrir el visor de pepXML, pinchando en pepXML

Prácticas TPP

• TANDEM (4)– Analizar los péptidos con peptideProphet

• En Analysis pipeline (TANDEM), seleccionar Analyze Peptides

• Select File(s) to Analyze: Output_TANDEM.xml.tandem.pep.xml

• Output File and Filter Options : cambiar el nombre a tandem.interact.pep.xml

• Peptide Prophet options y subsiguientes menús: nada• Click en “Run XInteract”• Se crea el fichero tandem.interact.pep.shtml.• Verlo con el visor de pepXMLs, clickando en “View”

Prácticas TPP

• TANDEM (5)– Analizar las proteínas con proteinProphet

• En Analysis pipeline (TANDEM), seleccionar Analyze Proteins

• Select File(s) to Analyze: tandem.interact.pep.xml• Output File and Filter Options : cambiar el nombre a

tandem.interact.prot.xml• Peptide Prophet options y subsiguientes menús: nada• Click en “Run XInteract”• Se crean los ficheros tandem.interact.prot.shtml y

tandem.interact.prot.xml• Verlo con el visor de protXMLs, clickando en “View”• Observar la tasa de error en Sensitivity/Error Info

Prácticas TPP• Comparación de resultados en Phenyx

– http://bioinfoinb.cnb.csic.es:8080/pwi– User: tutorial– Password: tutorial– Seleccionar los tres jobs– Action on selected: compare

PT M