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LA DIAGNOSI DI TUBERCOLOSI
D M Cirillo Is+tuto Scien+fico San Raffaele
WHOcc Milan Italy
Outline
• Problema+che legate alla diagnosi di TB in HIV • Diagnos+ca tradizionale: • POC • Raccomandazioni dell’OMS • Diagnos+ca molecolare e analisi delle resistenze
Problema<che legate alla diagnosi di TB in HIV
• Localizzazione • Paucibacillarità • Cri+cità del paziente • Progressione della malaIa
Rapid test Inexpensive
n Specificità per Mycobacterium spp: >95%
n Sensibilità: 25-65% (90 % infettivi) 1st AFB smear 80-82 %
2nd AFB smear 10-14 %
3rd AFB smear 5-8 %
Fluorescence Ziehl-Neelsen staining
n Does not allow species identification
n Not applicable to all samples
Microscopia
LED raccomandato rispetto a microscopia tradizionale e fluorescenza
Il paziente HIV posi+vo è +picamente paucibacillare, con TB non cavitaria, spesso extrapolmonare = microscopia nega<va
Il paziente HIV posi+vo è soggeOo a infezioni da micobaOeri non tubercolari che non rispondono alla terapia an+tubercolare= microscopia posi<va che puo’ essere misinterpretata come fallimento terapeu<co
Microscopia in HIV posi<vo
Alere Determine TB-‐LAM an<gene
LAM e Specificità: problemi non risol<
• Sensibilità della coltura liquida come “gold standard” • Uso di campioni respiratori, in par+colare escreato • Follow up in pazien+ con microbiologia nega+va • NTMs • Contaminazione e crossreaIvità degli an+corpi con NTMs
Vantaggi • Diagnosi certa di TB • Aumenta del 30-50% il
numero di casi confermati • Se liquida relativamente
rapida • Disponibilità del ceppo
per ATB e epidemiologia
LIMITI • costi legati alla procedura e
alla struttura di contenimento • Tempi di risposta legati alla
lentezza di crescita • Contaminazione
RITENUTA; FORSE ERRONEAMENTE IL GOLD STANDARD
Coltura
Vantaggi • Dati sulla sensibilità in
vitro • Permette di adottare un
regime terapeutico presonalizzato
• Permette di raccogliere dati dati di solveglianza che informano regimi empirici standardizzati
• Permette di monitorare lo sviluppo di resistenze
Limiti • Costi legati alla procedura
e alla struttura di contenimento
• Complessità di esecuzione • Tempi di risposta
incompatibili con un trattamento rapido
• Contaminazione • Attendibilità relativa e
legata alla complessità di esecuzione e alle caratteristiche delle singole molecole
An<biogramma
• “gold standard” diagnos+co • Tempi di posi+vizzazione lunghi lega+ alla carica baOerica
• ATB disponibile dopo seImane • TAT spesso incompa+bile con il management correOo del paziente cri+co
Coltura e ATB in HIV posi<vo
WHO Global plan (2006-‐2015):development and roll out of new technologies to be adopted in resources-‐limited seIngs
GenoType MTBDRplus • Reverse hybridiza+on, colorimetric reac+on • Results in 6-‐7 h • some flexibility (n probes/strip: 30-‐40) • Technical exper+se: some • Biosafety lev 2
Xpert MTB/RIF • Integrated/automated qPCR • Results in 2h • Closed system (limited number of probes: <10) • Technical exper+se: none
Test molecolari commerciali approva< dall’OMS per TB/MDR TB
Il WHO raccomanda test molecolari (Xpert/LPA) per la diagnosi di TB
Tubercolosi Extrapolmonare: Xpert TB/(Rif)
confidenziale
Drug Gene Gene product/ func<on
Isoniazid katG, inhA, ahpC, kasA
catalase peroxidase, enoyl acp reductase alkyl hydroperoxide reductase β-‐ketoacyl-‐ACP synthase
Rifampicin rpoB RNA polymerase β subunit
Pyrazinamide pncA pyrazinamidase
Ethambutol embA, embB, embC arabinosyl transferase
Streptomycin Kanamycin, AMK,CAP
Rrs, whiB7 rpsL, tlyA gidB, eis promoter
16S ribosomal RNA, promotor eis and tap ribosomal subunit 12, methyltransferase 16Smethyltransferase, acetyltransferase
Quinolones PAS Cycloserine Prothionamide
gyrA, gyrB thyA,dfrA,folC, nhoA.acc alr, ddlA, cycA inhA, eta
DNA gyrase Thymidylate synthase, folate reductase/ synthase, acetyltransferease D-‐ala ligase, racemase, transporter InhA, ac+vator monoxygenase
Mul+ple, interac+ng, heterodisperse muta+ons -‐ variable suscep+bility phenotypes
Determinan< gene<ci della resistenza
Xpert MTB/Rif per la diagnosi di Rif-‐Resistenza
Boehme CC et al 2011. Lancet 377(9776):1495-‐505 RIF-‐R detec<on Time to report to treatment center
Xpert MTB/RIF: 0-‐1 d LPA: 10-‐26 d* Culture DST: 30-‐124 d**
Xpert MTB/RIF: 0-‐1 d (Microscopy: 1-‐2 d) LPA: 27-‐53 d* Culture DST: 38-‐102 d** (culture: 42-‐62 d) Some results not reported/lost
* test on AFB-‐pos clinical specimen + test on clinical isolate for AFB-‐neg cases ** DST performed by MGIT + DST performed on LJ
TAT to Rif –R detec<on and repor<ng
WHO/HTM/TB/2011.2
VPP e VPN per la resistenza della Rif a diverse prevalenze di resistenza della Rif
Test commerciali per Fluoroquinoloni ed InieXabili
• I test LPA commerciali per la diagnosi della resistenza ai farmaci di seconda linea mostrano un alto valore di VPP e un basso valore di VPN causato dal numero limitato di mutazioni incluse nei test
• VPP e VPN potrebbero variare con il backgroud geno+pico dei ceppi e/o con la prevalenza di uno specifico geno+po nella popolazione target
• Alta prevalenza di cloni specifici recan+ mutazioni selezionate non comprese negli aOuali test diagnos+ci possono modificare i valori di VPP e VPN
MioOo et al. ERJ 2012
Sanità Pubblica – indagini in real +me di outbreak – epidemiologia molecolare
• Whole genome sequencing (WGS) e analisi delle resistenze 900+ mutazioni in ~50 geni associa+ a farmacoresistenza in Mycobacterium tuberculosis WGS + algoritmo interpretativo
Cole et al., Nature 393 (1998)
ImpaXo clinico della genomica
High confidence calls e.g. >85% INHR SNPs in katG or inhA
95% RifampicinR rpoB SNPs in RRDR – codons 507-‐533 quinolones gyrA SNPs in QRDR (D94G vs A90V)
Predic<ve calls e.g. KANR rrs A1401G & C517T plus eis promoter G-‐10A or C-‐14 CAPR rrs A1401G, C1402T, G1158T + possible eis C-‐12T AMK R rrs A1401G + eis promoter
Problemi: associazione con MIC e risposta al farmaco SNPs filogene+ci / polimorfismie/o sinonimi
Non tuXe le mutazioni sono uguali: High confidence calls/predic<ve calls
Table 1. List of M. tuberculosis isolates used in this study.
Malik S, Willby M, Sikes D, Tsodikov OV, et al. (2012) New Insights into Fluoroquinolone Resistance in Mycobacterium tuberculosis: Func+onal Gene+c Analysis of gyrA and gyrB Muta+ons. PLoS ONE 7(6): e39754. doi:10.1371/journal.pone.0039754 hOp://www.plosone.org/ar+cle/info:doi/10.1371/journal.pone.0039754
• gyrA: – 7582AG = D94G (mutazione high confidence) – >8ug/ml ciprofloxacin/ofloxacin/levofloxacin – >2ug/ml moxifloxacin
• Altre tre mutazioni non sinonime in gyrA che potrebbero alterare la funzione.
• Studio sorveglianza WHO:
o 97 campioni sequenzia+ o Concordanza MGIT-‐seq (84/97 campioni): 86,6% (46 R-‐mut, 38 S-‐
wt) o Discordanza MGIT-‐seq (13/97): 13,4% (13 R-‐wt)
FluoroquinoloneR -‐ Conclusioni
Alto numero di mutazioni in pncA disperse nell’intero gene Necessità di sviluppo di un test rapido
Marker di resistenza (80-‐85%) Poliformismi silen< (1-‐2%) Non associa< a resistenza (4-‐5%) Associazione da chiarire (4-‐5%) Falsi resisten< (2-‐3%)
• Studio sorveglianza WHO: o 874 campioni sequenzia+ o Concordanza MGIT-‐seq (60/62): 96,8% (22 R-‐mut, 38 S-‐wt) o Discordanza MGIT-‐seq (2/62): 3,2% (1 S-‐mut, 1 R-‐wt) Solo marker: prom -‐11,
cod 10-‐49-‐51-‐57-‐68-‐94
Pirazinamide
• E’ legata alla determinazione della presenza di MTB o sue componen+ nel campione, per questo mo+vo la sensibilità rimane suboImale nei campioni pauci bacillari
• Futuro approccio all’ATB: NGS permeOerà un’analisi completa delle mutazioni interpretabili sulla base di regole chiare e associabili ad un outcome clinico. La tecnologia permeOerà di sviluppare piaOaforme user-‐friendly aOe all’iden+ficazione degli SNPs rilevan+
• Biomarcatori •
Take home message: Diagnosi di microbiologica di TB
Riccardo Alagna Emanuele Borroni Andrea M. Cabibbe Lucinda Furci Paola Mantegani Paolo MioXo Enrico Tortoli Elisa Tagliani Ilaria Valente
Grazie per l’attenzione