I. JUDUL PERCOBAAN : IDENTIFIKASI MIKROBA

II. TUJUAN PERCOBAAN :

a. Membuat pewarnaan bakteri dan menerangkan reaksi kimia yang terlihat

serta perbedaan reaksi yang terjadi

b. Mengamati morfologi dan fisiologi mikroba

III. TINJAUAN PUSTAKA

3.1 Pengertian Mikroba

Mikrobiologi merupakan bagian dari ilmu biologi, tersusun oleh banyak disiplin

ilmu. Pembagian ini tergantung arah dan orientasinya, apakah terhadap taksonomi

(susunan dan pengelompokan mikroba), terhadap habitat (tempat hidup dan

perkembangan mikroba) atau terhadap problema-problema (permasalahan yang ada

atau yang ditimbulkan akibat mikroba).

Sebelum ditemukan jasad-jasad renik, semua benda hidup yang dikenal

dianggap sebagai tumbuhan atau hewan, belum terpikirkan adanya jenis-jenis

peralihan. Secara umum jasad renik berkembang dengan perubahan yang relatif

sedikit dari leluhur tumbuhan dan hewan.

Dunia mikroba terdiri dari berbagai kelompok jasad renik. Kebanyakan bersel

satu atau uniseluler. Ada yang mempunyai ciri-ciri sel tumbuhan dan ada juga yang

mempunyai ciri-ciri keduanya. Secara umum jasad renik juga disebut protista

(Waluyo, 2010).

3.2 Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram awalnya dikembangkan pada tahun 1884 oleh Christian Gram

yang merupakan prosedur paling penting dalam semua mikrobiologi. Pewarnaan

gram digunakan untuk mengetahui morfologi bakteri dan dapat membedakan antara

bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif. Jika dilihat di bawah mikroskop,

bakteri Gram positif akan berwarna ungu, karena dapat menahan ion kompleks

pewarna primer karbol gentian violetiodium sampai pada akhir prosedur pewarnaan.

Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena kehilangan kompleks warna

karbol gentian violetiodium dengan pembilasan alkohol, lalu terwarnai oleh pewarna

tandingan air fuksin.

Perbedaan reaksi kedua golongan bakteri tersebut terhadap pewarnaan Gram

disebabkan bakteri Gram positif memiliki dinding sel tebal yang akan menyusut pada

saat pembilasan alkohol, sehingga pori-porinya menutup dan mencegah keluarnya

kompleks pewarna primer pada saat pemucatan. Sedangkan dinding sel bakteri Gram

negatif mengandung banyak lipid yang larut dalam alkohol pada saat pembilasan.

Larutnya lipid memperbesar pori-pori dinding sel dan menyebabkan proses

pemucatan berlangsung cepat (Sulistiyaningsih, 2008).

Bakteri gram positif

Dengan pewarnaan gram, golongan bakteri ini memberikan warna ungu.

Golongan ini memiliki peptidoglikan setebal 20-80 nm dengan komposisi

terbesar teichoic, asam teichuroni, dan berbagai macam polisakarida. Asam

teikhoat berfingsi sebagai antigen permukaan pada gram positif. Letaknya

berada antara lapisan membran sitoplasma dan lapisan peptidoglikan. Selain

itu, golongan ini memiliki 40 lembar peptidoglikan pada dinding selnya, yang

merupakan 50% dari seluruh komponen penyusun dinding sel.

Bakteri gram negatif

Golongan ini memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (5-10 nm) dengan

komposisi utama : lipoprotein, membran luar dan lipopolisakarida. Membran

luar pada gram negatrif juga memiliki sifat hidrofilik, namun komponen lipid

pada dinding selnya justru memberikan sifat hidrofobik. Selain itu terdapat

saluran khusus yang terbuat dari protein yang disebut porins yang berfungsi

sebagai tempat masuknya komponen hidrofilik seperti gula dan asam amino

yang penting untuk kebutuhan bakteri (Prasetyo, 2009).

3.3 Aplikasi Indentifikasi Mikroba " Isolasi, Seleksi Bahan Pembawa dan

Formulasi Inokulum Thiobacillus spp."

Karakterisasi isolat yang dilakukan meliputi pewarnaan gram. Pewarnaan ini

digunakan untuk menentukan sifat dinding sel bakteri dan bentuk sel bakteri.

Karakter lain yang dipelakari adalah pH tempat bakteri tersebut ditemukan,

kebutuhan akan mineral ferro dan nitrogen. Hasil identifikasi berupa bakteri

thiobacillus spp. Pengamatan dan percobaan dapat dilihat pada flowchart berikut

(Hazra, 2010).

Gambar 3.1 Flowchart Identifikasi Thiobacillus

(Hazra, 2010)

Mulai

Diambil sampel dari lokasi Pit Barat, yaitu batu bara dan air tambang

Diisolasi pada media selektif dengan perbedaan komposisi

Dilakukan sterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121 oC tekanan 1 atm selama 15 menit

Diambil sampel tanah sebanyak 10 gram dan sampel air 10 ml dan dimasukkan ke dalam 90 ml larutan 0,85%

NaCl dan dikocok selama 15 menit

Campuran didiamkan dan dipisahkan endapannya

Diambil 1 ml campuran dan dimasukkan ke dalam media

Diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu kamar

Dilakukan pewarnaan gram dan diidentifikasi

Selesai

IV. METODOLOGI PERCOBAAN

4.1 Bahan dan Fungsi

1. Kristal violet

Fungsi : Untuk memberi warna pada bakteri

2. Larutan iodin

Fungsi : Untuk semakin merekatkan zat warna pada bakteri

3. Safranin

Fungsi : Untuk memberi warna kontras pada mikroba

4. Aseton alkohol

Fungsi : Untuk melarutkan zat warna pada tubuh bakteri

5. Air Parit Fakultas Pertanian

Fungsi : Sebagai sampel yang akan diamati dan diwarnai mikrobanya

6. Air Parit Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Fungsi : Sebagai sampel yang akan diamati dan diwarnai mikrobanya

4.2 Peralatan dan Fungsi

1. Kawat inokulasi

Fungsi : Untuk mengambil mikroba dari media cair

2. Pipet tetes

Fungsi : Untuk mengambil bahan-bahan pewarna pada saat proses

pewarnaan

3. Kaca benda

Fungsi : Untuk tempat meletakkan mikroba bagi pengamatan di bawah

mikroskop

4. Mikroskop

Fungsi : Untuk mengamati morfologi bakteri dengan pembesaran yang

sesuai

5. Lilin

Fungsi : Sebagai sumber api untuk melakukan fiksasi

6. Penjepit tabung

Fungsi : Untuk menjepit kaca benda pada proses pencucian dan

pemfiksasian

7. Tissue

Fungsi : Untuk mengeringkan kaca benda dari cairan yang tersisa

4.3 Prosedur Percobaan Pewarnaan Gram

1. Mikroba dalam air parit FMIPA dan FP USU dimasukkan dalam botol

yang berbeda.

2. Preparat diambil dengan menggunakan kawat inokulasi yang telah

disterilkan terlebih dahulu dengan lilin.

3. Bakteri diambil lalu digoreskan ke atas kaca objek lalu dibiarkan kering

di udara terbuka kemudian kaca objek difiksasi di atas bunsen.

4. Diamati di bawah mikroskop.

5. Digambar hasil yang didapat.

6. Preparat dibasahi dengan kristal violet dan dibiarkan selama 30-60

detik.

7. Preparat dimiringkan untuk membuang cairan yang berlebih dan dicuci

dengan air.

8. Preparat dibasahi dengan iodin dan dibiarkan selama 30-60 detik.

9. Preparat dimiringkan untuk membuang cairan yang berlebih.

10. Lalu dicuci dengan air dilanjutkan dengan alkohol – aseton dan

dibiarkan selama 30-60 detik.

11. Kemudian preparat dicuci dengan air dilanjutkan dengan pewarna

lengkap safranin dan dibiarkan selama 30-60 detik.

12. Preparat dimiringkan untuk membuang larutan yang sisa dan dicuci

dengan air.

13. Preparat dikeringkan dengan tissu lalu diamati dengan mikroskop dan

hasilnya digambarkan.

4.4 Flowchart Percobaan Pewarnaan Gram

Mikroba dalam air parit dimasukkan dalam botol

Preparat diambil dengan menggunakan kawat inokulasi yang

telah disterilkan terlebih dahulu dengan bunsen

Bakteri diambil lalu digoreskan ke atas kaca objek lalu dibiarkan kering di

udara terbuka kemudian kaca objek difiksasi di atas lilin

Diamati di bawah mikroskop dan digambar hasilnya

Preparat dibasahi dengan kristal violet dan

dibiarkan selama 30-60 detik

Mulai

Preparat dimiringkan lalu dicuci dengan air

Preparat dibasahi dengan iodin dan

dibiarkan selama 30-60 detik

Preparat dimiringkan lalu dicuci dengan air

Preparat dibasahi dengan alkohol-aseton

dan dibiarkan selama 30-60 detik

Preparat dimiringkan lalu dicuci dengan air

A

Gambar 4.1 Flowchart Percobaan Pewarnaan Gram

TidakYa

Preparat dikeringkan

Preparat diamati dengan mikroskop

Apakah preparat berwarna

ungu ?Gram positif Gram negatif

Selesai

Preparat dibasahi dengan pewarna lengkap

safranin dan dibiarkan selama 30-60 detik

Preparat dimiringkan lalu dicuci dengan air

A

V. HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Hasil Percobaan

Tabel Hasil Percobaan Pewarnaan Gram

Sampel

MediaMorfologi

BakteriKeteranganSebelum

Pewarnaan

Sesudah

Pewarnaan

Air Parit

Fakultas MIPA

USU

Spirillia

Bakteri

Gram

Negatif

Air Parit

Fakultas

Pertanian

USU

SpirilliaBakteri

Gram Positif

5.2 Pembahasan

Jika dilihat di bawah mikroskop, bakteri Gram positif akan berwarna ungu,

karena dapat menahan kompleks pewarna primer karbol gentian violetiodium

sampai akhir prosedur pewarnaan. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah,

karena kehilangan kompleks warna karbol gentian violetiodium dengan

pembilasan alkohol, lalu terwarnai oleh pewarna tandingan air fuksin (Prasetyo,

2009).

Dari hasil pengamatan terhadap hasil percobaan proses pewarnaan gram,

terlihat koloni mikroba berbentuk Spirillia dengan warna merah dan warna ungu.

Pada sampel air parit Fakultas MIPA dan Fakultas Pertanian diperoleh bakteri

Spirillium.

5.2.1 Air Parit Fakultas MIPA USU

Pada air parit Fakultas MIPA USU diperoleh bakteri Spirillium.

Spirillium merupakan bakteri fungi gram positif yang terlihat seperti bintik-

bintik transparan dan akan berwarna bila ditetesi dengan metylen biru.

merupakan organisme eukariotik Spirillium (Monruw, 2011).

Gambar 5.1 Spirillium

(Monruw, 2011)

Teori menjelaskan bahwa setelah melakukan tahapan-tahapan proses

pewarnaan gram, kita akan mendapatkan warna yang khas, warna ungu

kebiruan untuk bakteri gram positif yang menyerap pewarna kristal violet

dan warna kemerahan untuk bakteri gram negatif yang menyerap larutan

safranin. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah

mikroskop. Sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau

merah muda karena tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada

metode pewarnaan gram (Lasantha, 2010) .

Dari hasil pengamatan diperoleh bahwa bakteri Spirillium pada air

parit Fakultas MIPA USU berwarna merah. Hal ini disebabkan karena

bakteri tersebut tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode

pewarnaan gram.

5.2. 2 Air Parit Fakultas Pertanian USU

Pada air parit Fakultas Pertanian USU diperoleh bakteri Spirillium.

Spirillium merupakan bakteri fungi gram positif yang terlihat seperti bintik-

bintik transparan dan akan berwarna bila ditetesi dengan metylen biru.

merupakan organisme eukariotik Spirillium (Monruw, 2011).

Gambar 5.3

Gambar 5.1 Spirillium

(Monruw, 2011).

Teori menjelaskan bahwa setelah melakukan tahapan-tahapan proses

pewarnaan gram, kita akan mendapatkan warna yang khas, warna ungu

kebiruan untuk bakteri gram positif yang menyerap pewarna kristal violet

dan warna kemerahan untuk bakteri gram negatif yang menyerap larutan

safranin. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah

mikroskop. Sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau

merah muda karena tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada

metode pewarnaan gram (Lasantha, 2010) .

Dari hasil pengamatan diperoleh bahwa bakteri Spirillium pada air parit

Fakultas Pertanian USU berwarna ungu. Hal ini disebabkan karena bakteri

tersebut mampu mempertahankan zat warna metil ungu pada metode

pewarnaan gram.

VI. KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

Adapun yang dapat disimpulkan dari percobaan ini adalah:

1. Dari hasil pengamatan proses pewarnaan gram, mikroba pada air parit

FMIPA bewarna merah dan berbentuk spiral.

2. Dari hasil pengamatan proses pewarnaan gram, mikroba pada air parit

Fakultas Pertanian bewarna ungu dan berbentuk spiral.

3. Bakteri yang terdapat pada air parit FMIPA USU adalah bakteri Gram

negatif dan air parit Fakultas Pertanian USU adalah bakteri Gram positif.

4. Bakteri yang terdapat pada air parit Fakultas Pertanian USU adalah

bakteri Gram positif.

6.2 Saran

Adapun saran yang dapat diberikan adalah:

1. Proses fiksasi dilakukan secara cepat untuk menghindari denaturasi

bakteri.

2. Sampel yang akan digoreskan di atas kaca objek tidak terlalu tebal agar

bakteri yang akan diamati tidak tumpang-tindih sehingga dapat

mempersulit pada saat pengamatan.

3. Sebaiknya proses pewarnaan dilakukan dengan hati-hati dan kaca

objeknya tidak digosok agar bakteri tetap menempel pada kaca objek.

DAFTAR PUSTAKA

Hazra, Fahrizal. 2010. Isolasi, Seleksi Bahan Pembawa dan Formulasi Inokulum

Thiobacillus spp. Aplikasi Mikrobiologi. Tokyo University of Agriculture.

Japan.

Lasantha. 2010. Pewarnaan Bakteri. Biologi. Diakses tanggal 01 Maret 2015.

Monruw. 2011. Morfologi Khamir. Morfologi Khamir. Diakses pada tanggal 01

Maret 2015.

Prasetyo, Tommie. 2009. Pola Resistensi Bakteri dalam Darah terhadap

Kloramfenikol, Trimethoprim/Sulfametoksazol, dan Tetrasiklin di

Laboratorium Mikrobiologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia (LMK FKUI) Pada Tahun 2001-2006. Jurnal Kedokteran. Jurusan

Pendidikan Dokter Umum. Fakultas Kedokteran. Universitas Indonesia.

Sulistiyaningsih. 2008. Identifikasi Isolat Bakteri Penghasil Zat Antibakteri dari

Cairan Kantung Tanaman Kantong Semar (Nepenthes ampullaria, Jack).

Laporan Penelitian Mandiri. Fakultas Farmasi. Universitas Padjajaran.

Bandung.

Waluyo, Lud. 2010. Teknik dan Metode Dasar Mikrobiologi. Penerbit : Universitas

Muhammadiyah Malang.

LAMPIRAN A

FOTO SAMPEL

LA.1 Foto Pengambilan Sampel Air Parit Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam USU

kkkkk

Gambar A.1.1 Pengambilan Sampel Air Parit oleh Kelompok XXI

Gambar A.1.2 Pengambilan Sampel Air Parit oleh Patima Valentina

Haloho

LA.2 Foto Pengambilan Sampel Air Parit Fakultas Pertanian USU

Gambar A.2.1 Pengambilan Sampel Air Parit oleh Kelompok XXI

Gambar A.1.2 Pengambilan Sampel Air Parit oleh Hamda Eka

Agustini