potensi antibakteri ekstrak etanol teh hijau … filei potensi antibakteri ekstrak etanol teh hijau...

i

POTENSI ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU TERHADAP

Streptococcus mutans PENYEBAB KARIES GIGI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Adelia Indah Pratiwi

NIM: 088114119

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

POTENSI ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU TERHADAP

Streptococcus mutans PENYEBAB KARIES GIGI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Adelia Indah Pratiwi

NIM: 088114119

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2012


iii


iv


v

HALAMAN PERSEMBAHAN

Kuatkan dan teguhkanlah hatimu. Janganlah kecut dan tawar hati, sebab Tuhan, Allahmu, menyertai engkau, ke mana pun engkau pergi. (Yosua 1:9)

Mintalah, maka akan diberikan kepadamu; carilah, maka kamu akan mendapat; ketoklah, maka pintu akan dibukakan bagimu. Karena setiap orang yang meminta, menerima dan setiap orang yang mencari, mendapat dan setiap orang yang mengetok, baginya pintu dibukakan. (Matius 7:7-8)

Jika engkau makan atau jika engkau minum, atau jika engkau melakukan sesuatu yang lain, lakukanlah semuanya itu untuk kemuliaan Allah. (1 kor 10:31)

Karya ini kupersembahkan untuk:

Tuhan Yesus Kristus yang Maha Pengasih yang selalu menyertai dan membimbingku,

Mama, papa, ooh Adit dan Samuel tercinta,

Senpaiku tercinta, Dr. Christina Siwi Handayani yang selalu mendukungku,

Teman‐teman Kenshi Sanata Dharma

Teman baikku, Yanuar Prasetya,

Almamaterku


vi


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

berkat, rahmat, tuntunan serta penyertaan dan kasih karunia yang telah

diberikanNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan

skripsi yang berjudul “Potensi Antibakteri Infusa Teh Hijau terhadap

Streptococcus mutans Penyebab Karies Gigi” dengan baik sebagai salah satu

syarat untuk memperoleh gelar Kesarjanaan Strata Satu (S1) Sarjana Farmasi

(S.Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Penulis menyadari bahwa keberhasilan penulisan skripsi ini tidak terlepas

dari bantuan serta dukungan dari berbagai pihak secara langsung maupun tidak

langsung baik berupa moral, materiil maupun spiritual. Oleh sebab itu, penulis

menghaturkan banyak terima kasih kepada:

1. Bapak Ipang Djunarko, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma.

2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si selaku Dosen Pembimbing dan Penguji yang

memberikan saran dan kritik serta dukungan kepada penulis dalam proses

menyempurnakan naskah skripsi.

3. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. selaku Dosen Penguji yang bersedia

meluangkan waktu untuk menguji dan memberikan kritik dan saran kepada

penulis.


viii

4. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. selaku Dosen Penguji yang bersedia

meluangkan waktu untuk menguji dan memberikan kritik dan saran kepada

penulis.

5. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S.Si. yang telah bersedia meluangkan waktu

untuk berdiskusi, memberi semangat serta masukan kepada penulis.

6. Teman-teman kelompok penelitian, Yanuar Prasetya, Maria Siska Triyuniar

Kusumastuti, dan Irene Aninditya Putri Ahtha atas segala kerjasama dan

dukungan semangat yang telah diberikan selama penelitian ini.

7. Kenshi-kenshi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan dukungan

semangat dan kerjasama dalam mengurus UKM Kempo Sanata Dharma

selama penulisan skripsi ini.

8. Teman-teman kos Amakusaku tercinta: ci Theresia Aryani, Triana Oktavia,

Margaretha Ratih Vitaningrum, Berta Trifina, Herta Rinda, Tiatira Metri,

Margaretha Christina Halim, kak Retha, kak Yemima Haryono atas segala

kebersamaan, canda tawa, semangat dan kerjasama yang telah diberikan

kepada penulis selama ini.

9. Teman-teman KKN ku tercinta: Fabiana Adi Kusumaningrum, Albertus

Harimurti, Bennydiktus, Ermenilda Sehrina, Cecilia Novianti Salsinanha,

Apriyani Susanti dan Paulina Ratnaningrum terimakasih untuk canda tawa

dan kebersamaan kita selama ini.

10. Teman-teman kelas FKK B 2008, terima kasih atas 2 tahun kebersamaannya

dan pengalaman yang tidak akan pernah terlupakan selama menjalani kuliah

dan praktikum serta dorongan semangat dan doa yang telah diberikan kepada


ix

penulis selama penyusunan skripsi ini hingga dapat terselesaikan dengan

baik.

Penulis menyadari bahwa tidak ada yang sempurna dalam kehidupan ini.

Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran agar skripsi ini

dapat menjadi lebih baik. Semoga Tuhan selalu memberkati semua pihak yang

telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

Penulis


x


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................ ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................... iii

HALAMAN PENGESAHAN .................................................. iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................... v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ..................... vi

PRAKATA ............................................................................... vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................... x

DAFTAR ISI ............................................................................ xi

DAFTAR TABEL .................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................ xvi

INTISARI ................................................................................. xviii

ABSTRACT ............................................................................. xix

BAB I PENGANTAR ............................................................... 1

A. Latar Belakang .............................................................. 1

1. Permasalahan ................................................... 4

2. Keaslian karya .................................................. 4

3. Manfaat penelitian ............................................ 4

B. Tujuan Penelitian .......................................................... 5

1. Tujuan umum .................................................... 5

2. Tujuan khusus ................................................... 5

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ...................................... 6

A. Teh Hijau ...................................................................... 6


xii

1. Keterangan botani ............................................. 6

2. Deskripsi teh hijau ............................................ 7

3. Kandungan kimia teh hijau ............................... 7

4. Kegunaan teh hijau ............................................ 8

B. Flavonoid ...................................................................... 9

C. Karies dan Plak Gigi ..................................................... 13

D. Maserasi ........................................................................ 17

E. Streptococcus mutans ................................................... 18

F. Pengujian Potensi Antibakteri ...................................... 21

1. Uji difusi ........................................................... 21

2. Uji dilusi ............................................................ 22

G. Landasan Teori ............................................................. 24

H. Hipotesis ....................................................................... 25

BAB III. METODE PENELITIAN .......................................... 26

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................... 26

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ............... 26

1. Variabel penelitian ............................................ 26

2. Definisi operasional .......................................... 27

C. Bahan ............................................................................ 28

D. Alat ............................................................................... 29

E. Tata Cara Penelitian ...................................................... 29

1. Identifikasi teh hijau .......................................... 29

2. Pembuatan serbuk teh hijau .............................. 30

3. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau ................... 30


xiii

4. Verifikasi kualitatif-kuantitatif kandungan senyawa epigallocatechin gallate (EGCG) dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Densitometri ......................................................

30

5. Uji kemurnian dan identifikasi bakteri uji ........ 31

6. Uji potensi antibakteri ekstrak etanol teh hijau terhadap S.mutans dengan metode difusi paper disc ....................................................................

33

7. Uji penentuan nilai KHM dan KBM ekstrak etanol teh hijau terhadap S.mutans dengan metode dilusi cair ..............................................

36

F. Tata Cara Analisis Hasil ............................................... 37

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................. 39

A. Identifikasi Daun Teh Hijau ......................................... 39

B. Pembuatan Serbuk Teh Hijau ...................................... 39

C. Pembuatan Ekstrak Etanol Teh Hijau ........................... 40

D. Verifikasi Kualitatif-Kuantitatif Kandungan Senyawa Epigallocatechin Gallate (EGCG) dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Densitometri .....

41

E. Uji Kemurnian dan Identifikasi Bakteri Uji .................. 42

F. Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Teh Hijau terhadap S.mutans dengan Metode Difusi Paper Disc..

46

1. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak etanol teh hijau .............................................................

46

2. Pembuatan media Nutrient Agar ....................... 47

3. Pembuatan media Nutrient Broth ...................... 48

4. Pembuatan suspensi bakteri uji ......................... 49

5. Uji potensi ekstrak etanol teh hijau terhadap S.mutans secara difusi paper disc .....................

49


xiv

G. Uji Penentuan Nilai KHM dan KBM Ekstrak Etanol Teh Hijau terhadap S.mutans dengan Metode Dilusi Cair ................................................................................

54

1. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak etanol ... 55

2. Uji penentuan nilai KHM-KBM ekstrak etanol teh hijau terhadap S.mutans dengan metode dilusi cair ...........................................................

56

3. Penegasan hasil untuk penentuan nilai KHM dan KBM ...........................................................

56

4. Uji penegasan hasil dengan metode streak plate ...................................................................

58

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .................................. 60

A. Kesimpulan …............................................................... 60

B. Saran …......................................................................... 60

DAFTAR PUSTAKA ............................................................... 61

LAMPIRAN ............................................................................. 64

BIOGRAFI PENULIS .............................................................. 85


xv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Pengenceran ekstrak etanol teh hijau ......................... 34

Tabel II. Pengenceran standar EGCG ...................................... 42

Tabel III. Kadar epigallocatechine gallate ................................. 42

Tabel IV. Pengenceran ekstrak etanol teh hijau ......................... 47

Tabel V. Hasil uji potensi antibakteri ekstrak etanol teh hijau

dengan berbagai konsentrasi EGCG dibandingkan

dengan kontrol ...........................................................

52

Tabel VI. Hasil pengukuran OD dengan spektrofotometer

Visible pada λmax 600 nm ...........................................

58


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan identifikasi teh hijau ............................... 64

Lampiran 2. Certificate of Analysis Ekstrak Etanol Teh Hijau .............. 65

Lampiran 3. Proses Ekstraksi Ekstrak Etanol Teh Hijau ....................... 66

Lampiran 4. Data Hasil Ekstraksi Ekstrak Etanol Teh Hijau ................. 67

Lampiran 5. Penentuan Senyawa Identitas Ekstrak Etanol Teh Hijau

Secara Kualitatif dan Kuantitatif .......................................

68

Lampiran 6. Profil Kromatogram Ekstrak Etanol Teh Hijau ................. 69

Lampiran 7. Hasil uji kemurnian dan pembuatan stok kultur murni

bakteri uji S. mutans ..........................................................

70

Lampiran 8. Dokumentasi Uji Kemurnian dan Identifikasi S. mutans .. 71

Lampiran 9. Dokumentasi Uji Potensi Ekstrak Etanol Teh Hijau ......... 74

Lampiran 10. Hasil Uji Kruskal-Wallis Diameter Zona Hambat yang

Dihasilkan pada Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol

Teh Hijau dengan Berbagai Variasi Konsentrasi EGCG

terhadap S. mutans dengan Difusi Paper Disc ..................

80

Lampiran 11. Data Uji Post Hoc (Mann-Whitney) yang Dihasilkan pada

Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Teh Hijau dengan

Berbagai Variasi Konsentrasi EGCG terhadap S. mutans

81


xvii

dengan Difusi Paper Disc ..................................................

Lampiran 12. Dokumentasi Hasil Uji Penegasan ..................................... 83


xviii

INTISARI

Teh hijau dibuat dari daun teh (Theae Folium) yang belum difermentasi dan telah diketahui memiliki daya antibakteri karena adanya kandungan senyawa flavonoid yaitu katekin, terutama epigalokatekin-3-galat (EGCG). Karies merupakan penyakit gigi berlubang akibat akumulasi asam laktat dari hasil fermentasi karbohidrat bakteri mulut khususnya Streptococcus mutans. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi antibakteri berbagai variasi konsentrasi ekstrak etanol teh hijau terhadap pertumbuhan bakteri S.mutans dan menentukan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM) ekstrak etanol teh hijau terhadap S.mutans. Penelitian ini menggunakan teh hijau dari perkebunan teh Rumpun Sari Medini Boja Jawa Tengah karena perkebunan Medini memiliki ketinggian yang optimal untuk menanam teh. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni untuk mengetahui potensi antibakteri ekstrak etanol teh hijau pada konsentrasi: 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2,5; 5; 7,5; dan 10 mg/mL terhadap bakteri S. mutans berdasarkan diameter zona hambat menggunakan metode difusi paper disk, yang kemudian dianalisis secara statistik Kruskal-Wallis. Penentuan nilai Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM) dilakukan dengan metode dilusi cair berdasarkan Optical Density (OD) dengan mengukur absorbansi, dibandingkan kontrol negatif serta uji penegasan hasil dengan metode streak plate. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol teh hijau yang diambil dari Perkebunan Teh Rumpun Sari Medini Boja berpotensi sebagai antibakteri terhadap bakteri S.mutans dengan nilai KHM 2,0 mg/mL, sedangkan nilai KBM belum dapat ditentukan dalam penelitian ini.

Kata kunci: potensi antibakteri, ekstrak etanol teh hijau, Streptococcus mutans.


xix

ABSTRACT

Green tea was made from non fermentated tea leaves (Theae Folium) that was known have antibacterial potency because of flavonoid constituent, catechine, especially epigalocatechine-3-gallate (EGCG). Caries is a dental cavities disease that caused of lactic acid acumulation from carbohydrate fermentation of oral bacteria especially Streptococcus mutans. This research was aimed to determine the antibacterial potency of variation consentration of ethanol green tea extract and Minimum Inhibitory Concentration (MIC) also Minimum Bactericidal Concentration (MBC) against S.mutans. Research material used was green tea from Rumpun Sari Medini Boja Tea Plantation because of its optimal height for tea plantation.

This research was purely experimental research to determine the antibacterial potency of ethanol green tea extract at concentration 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2,5; 5; 7,5; and 10 mg/mL against S. mutans bacteria that showed from inhibition zone with paper disc difusion method, analyzed statistically by Kruskal-Wallis. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) was determined with liquid dilution method based on Optical Density (OD) with absorbance measurement, compared with negative control and confimed test by streak plate method.

The result showed that EGCG ethanol green tea extract from Rumpun Sari Medini Boja Tea Plantation potencial as antibacterial against S.mutans with MIC value 2,0 mg/mL and MBC can not be deternine in this research.

Key words: antibacterial potency, ethanol green tea extract, Streptococcus mutans.


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Penyakit gigi berlubang (karies) adalah salah satu penyakit dengan

prevalensi sebagian besar pada manusia (Islam, Khan, and Khan, 2007). Karies

gigi merupakan lubang-lubang kecil yang terbentuk karena adanya penumpukan

asam laktat pada email gigi sehingga gigi mengalami penurunan kadar kalsium

dan pelunakan (Cappuccino and Sherman, 2008). Plak adalah biofilm

(sekelompok mikroorganisme yang menempel pada permukaan gigi) kompleks

yang terbentuk oleh >500 spesies bakteri berbeda yang normalnya terdapat dalam

commensal harmony dengan sel inang (Matsunaga, Nakahara, Minnatul, Noiri,

Ebisu, Kato, dkk., 2010). Fermentasi karbohidrat oleh bakteri oral asidogenik

(penghasil asam) adalah faktor utama dalam perkembangan karies gigi, terutama

genus streptococcus (S.mutans, S.anginosus, S.constellatus, S.gordonii,

S.intermedius, S.mitis, S.oralis, S.salivarus dan S.sanguis). Di antara bakteri-

bakteri tersebut, S.mutans merupakan bakteri penyebab utama terjadinya karies

(Islam, dkk., 2007). Hal ini dikarenakan S.mutans memiliki sifat asidofilik, yang

memungkinkan bakteri tersebut bertahan hidup bahkan tumbuh subur dalam

kondisi asam, dan menghasilkan asam laktat (Simon, 2007) dalam jumlah yang

lebih banyak dibandingkan spesies Streptococcus lainnya (Safitri, 2004). Selain

itu S.mutans juga memiliki kemampuan untuk memproduksi glukosyltransferase

(GTF) yang mensintesis polisakarida intraseluler (IPS) dan polisakarida


2

ekstraseluler (EPS). EPS merupakan glukan tidak larut air yang memediasi

perlekatan S.mutans dan spesies bakteri oral lainnya pada permukaan gigi,

sehingga terbentuk biofilm plak gigi (Xu, Zhou, and Wu, 2011).

Bakteri S.mutans bersifat gram positif, fakultatif anaerob, nonmotil, tidak

berspora yang mampu menghasilkan asam laktat, kebanyakan tinggal di mulut

dan jalur pernapasan atas. Dalam keadaan anaerob, bakteri ini memerlukan 5%

CO2 dan 95% nitrogen serta memerlukan amonia sebagai sumber nitrogen agar

dapat bertahan hidup dalam lapisan plak yang tebal (Holt, Krieg, Sneath, Staley

and Williams, 2000). Bakteri S.mutans akan menginisiasi perlekatan berbagai

macam oral microflora terhadap permukaan gigi. Selanjutnya terjadi sintesis

polisakarida ekstraseluler (EPS) oleh bakteri menghasilkan agregasi S.mutans

sehingga asam dilepaskan dan menyebabkan demineralisasi serta kavitasi

(pembentukan lubang halus) pada gigi (Islam, dkk., 2007).

Ada 3 jenis teh yang umum dikenal, yaitu green tea (teh hijau), teh

hitam, dan teh oolong. Green tea dibuat dari daun teh yang belum

difermentasikan dan mengandung antioksidan kuat dengan konsentrasi flavonoid

tertinggi (Agoes, 2010). Katekin merupakan flavonoid yang termasuk dalam kelas

flavanol (Hartoyo, 2003). Terdapat beberapa polifenol katekin dalam teh hijau,

yaitu epicatechin (EC), epicatechin-3-gallate (ECG), epigallocatechin (EGC),

epigallocatechin-3-gallate (EGCG), catechin, dan gallocatechin (GC). EGCG

adalah katekin yang jumlahnya paling banyak dalam teh hijau, sekitar 65% dari

total katekin. Secangkir teh hijau mengandung 100-200 mg EGCG. (Zaveri,

2006). Teh hijau banyak diteliti sebagai antibakteri karena kandungan katekin


3

dalam teh hijau dapat menghambat pertumbuhan bakteri kariogenik (penyebab

karies gigi) dengan cara menghambat pertumbuhan bakteri penyebab plak pada

permukaan gigi (Alschuler, 1998).

Hasil penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Pratikno (2003)

menyimpulkan bahwa teh hijau yang mengandung katekin dengan konsentrasi 1,5

mg/mL merupakan dosis larutan pakai yang memperlihatkan hasil yang efektif

sebagai bahan antibakteri yang dapat mengurangi terbentuknya karies gigi dengan

cara menghambat aktivitas enzim glukosiltransferase yang dihasilkan oleh

S.mutans dalam mensintesa sukrosa menjadi polisakarida ekstrasel (glukan).

Penelitian oleh Zaveri (2006) menunjukkan bahwa penghambatan bakteri oleh

berbagai macam katekin disebabkan adanya interaksi spesifik antara gugus fenol

dari katekin dengan peptidoglikan bakteri.

Daun teh hijau yang digunakan berasal dari Perkebunan Teh Medini

Boja, Kabupaten Kendal karena memiliki ketinggian yang optimal untuk ditanami

tanaman teh (1500 meter di atas permukaan laut). Diharapkan dengan

menggunakan sumber daun teh hijau yang berkualitas diharapkan dapat menjadi

jaminan kualitas hasil penelitian. Semakin tinggi letak suatu tempat memiliki suhu

yang semakin rendah dan menghasilkan kandungan senyawa dalam teh yang lebih

baik dari sisi kualitas dan kuantitas dibandingkan teh yang ditanam di dataran

rendah maupun sedang (Suseno, 1977).

Data uji potensi antibakteri berupa diameter zona hambat ekstrak etanol

hasil maserasi daun teh hijau terhadap S.mutans yang dianalisis secara statistik.

Data hasil dari penelitian ini selanjutnya dapat digunakan sebagai acuan untuk


4

pengembangan sediaan farmasetik yang dapat digunakan dengan mudah oleh

masyarakat sehingga diharapkan prevalensi karies gigi di Indonesia dapat

diturunkan.

1. Permasalahan

a. Adakah perbedaan bermakna potensi antibakteri dari berbagai variasi

konsentrasi ekstrak etanol teh hijau terhadap bakteri penyebab karies gigi

S. mutans?

b. Berapakah Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum

(KBM) dari ekstrak etanol teh hijau?

2. Keaslian penelitian

Menurut Hardjawinata dan Oewen (cit., Pratikno, 2003), katekin sebagai

senyawa polifenol yang diperoleh dari teh hijau mempunyai daya antibakteri

dengan konsentrasi hambat minimalnya 0,5 mg/mL. Dari hasil penelitian Pratikno

(2003) disimpulkan bahwa senyawa katekin dalam teh hijau memiliki daya

antibakteri mengurangi terbentuknya plak penyebab karies gigi dengan cara

menghambat enzim glukosiltransferase yang dihasilkan S. mutans dengan

konsentrasi 1,5 mg/mL.

Penelitian ini menggunakan teh hijau dari Perkebunan Medini, Boja-

Ambarawa serta proses ekstraksi maserasi katekin, khususnya EGCG, dengan

larutan penyari etanol.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis: Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

mengenai perbedaan potensi antibakteri dari berbagai variasi konsentrasi ekstrak


5

etanol teh hijau terhadap pertumbuhan bakteri S. mutans, serta memberikan

informasi tentang konsentrasi yang paling efektif dari ekstrak etanol dalam

menghambat S. mutans.

b. Manfaat praktis: Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

mengenai manfaat teh hijau dalam mencegah karies gigi dan sebagai informasi

dalam pengembangan sediaan farmasetik untuk karies atau penemuan obat baru.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Memberikan informasi pada masyarakat luas mengenai potensi

antibakteri ekstrak etanol teh hijau terhadap S.mutans dan sebagai acuan

dalam pengembangan ke dalam bentuk sediaan farmasetik.

2. Tujuan khusus

a. Mengetahui perbedaan potensi antibakteri berbagai variasi

konsentrasi ekstrak etanol teh hijau terhadap pertumbuhan bakteri

S. mutans.

b. Menentukan Kadar Hambat Minimum dan Kadar Bunuh

Minimum ekstrak etanol teh hijau terhadap bakteri penyebab

karies gigi S. mutans.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Teh Hijau

1. Keterangan botani

Tanaman teh (Camellia sinensis L.) adalah spesies tanaman yang daun

dan pucuknya digunakan untuk membuat teh. Tumbuhan ini termasuk ke dalam

famili Theaceae. Teh putih, teh hijau, oolong, dan teh hitam semuanya didapatkan

dari spesies ini, tetapi diproses secara berbeda untuk memperoleh tingkat oksidasi

yang berbeda (Agoes, 2010).

Nama lain untuk tumbuhan teh ini adalah Thea bohea, Thea sinensis, dan

Thea viridis (Agoes, 2010). Nama daerah untuk teh adalah Enteh (Sunda), Pu erh

cha (China), Theler (Perancis), Teestrauch (Jerman), Te (Itali), Cha da India

(Portugis) dan Tea (Inggris) (Arisandi dan Andriani, 2006).

Ada tiga jenis teh yang umum dikenal, yaitu green tea atau teh hijau, teh

hitam, dan teh oolong. Green tea dibuat dari daun teh yang belum difermentasikan

dan mengandung antioksidan kuat dengan konsentrasi tertinggi yang dinamakan

polifenol. Oolong tea dibuat dari daun yang sebagian difermentasikan, sedangkan

black tea dibuat dari daun yang difermentasikan penuh (Agoes, 2010). Pada teh

hijau, daun teh segar diuapi dan dikeringkan untuk menginaktivasi enzim

polifenol oksidase, proses ini dapat menjaga polifenol tetap pada bentuk

monomernya. Teh hitam diproduksi dengan memperpanjang proses fermentasi

daun teh sehingga menghasilkan komponen yang polimer, thearubigins dan


7

theaflavins. Teh oolong adalah produk semi-fermentasi dan mengandung

campuran polifenol monomer dan theaflavin dengan bobot molekul lebih tinggi.

Ketiga jenis teh tersebut mengandung kafeina dalam jumlah yang signifikan (3-

6%) yang jumlahnya tidak dipengaruhi oleh perbedaan metode dalam proses

pembuatan teh (Zaveri, 2006).

2. Deskripsi teh hijau

Teh hijau adalah daun teh yang diolah tanpa mengalami proses

fermentasi, tidak mengalami oksidasi enzimatik untuk menjaga senyawa aktif

yang terkandung di dalamnya, sehingga diharapkan bahwa kandungan senyawa

aktif terutama katekin yang terkandung lebih banyak dibanding teh jenis lain,

tidak banyak terbuang oleh karena proses fermentasi yang dapat mengurangi

potensi teh hijau tersebut (Hartoyo, 2003).

3. Kandungan kimia teh hijau

Kandungan kimia teh hijau sangat kompleks dan belum semua diketahui.

Komponen yang paling banyak dalam teh hijau adalah polifenol, khususnya

flavonoid seperti katekin, katekin galat, dan proantosianidin. Daun segar teh hijau

mengandung kafeina (sekitar 3,5% dari total berat daun kering, atau sekitar 50

mg/cangkir), teobromina (0,15-0,2%), teofilina (0,02-0,04%) dan metilksantina,

lignin (6,5%), asam organik (1,5%), klorofil (0,5%) dan asam amino bebas (1-

5,5%) (Taylor, Hamilton-Miller, Stapleton, 2005).

Polifenol dalam teh hijau digolongkan sebagai catechins. Ada enam

senyawa catechin, yaitu catechin, gallocatechin (GC), epigallocatechin (EGC),

epicatechin gallate (ECG), dan epigallocatechin gallate (EGCG). EGCG adalah


8

senyawa paling aktif. Senyawa lain yang ditemukan dalam teh hijau adalah

alkaloid yang terdiri atas kafeina, teobromina, dan teofilina yang bersifat

stimulan. Efek penenang diberikan oleh alkaloid lain, yaitu L-theanine (Agoes,

2010).

Senyawa uji yang digunakan adalah epigallocatechin gallate (EGCG)

yang merupakan senyawa polifenol paling aktif dan dengan kuantitas paling

banyak, yaitu 65% dari total katekin dalam teh hijau (Zaveri, 2006).

4. Kegunaan teh hijau

Teh hijau dan katekin yang terkandung di dalamnya telah diketahui

memiliki daya antioksidan yang dapat digunakan untuk mengobati berbagai

penyakit yang berhubungan dengan Reactive Oxygen Species (ROS), seperti

kanker, penyakit jantung dan penyakit neurodegeneratif. Beberapa penelitian

epidemiologi menunjukkan bahwa teh hijau dapat memicu perlindungan untuk

melawan kanker pada kulit, payudara, prostat, dan paru. Sebagai pencegahan

tambahan terhadap kanker, teh hijau dan EGCG bersifat anti-angiogenik

(mencegah pertumbuhan pembuluh darah tumor) dan anti-mutagenik. Teh hijau

juga bersifat hipokolesterolemik dan mencegah berkembangnya plak pada

aterosklerosis. Bagi penyakit neurodegeneratif dan penyakit patologis yang

berhubungan dengan usia, teh hijau menunjukkan perlindungan yang signifikan

terhadap penyakit Parkinson, Alzheimer dan kerusakan iskemik. Teh hijau juga

diketahui memiliki efek antidiabetes pada hewan uji yang mengalami resistensi

insulin dan meningkatkan pengeluaran energi. Keuntungan lainnya dari teh hijau


9

adalah aktivitas antibakteri, anti-HIV dan antiinflamasi yang dimilikinya (Zaveri,

2006).

B. Flavonoid

Polifenol adalah metabolit tanaman dengan ciri khas adanya gugus fenol

(misalnya cincin aromatis dengan gugus hidroksil) yang merupakan derivat dari

L-fenilalanin. Kelas polifenol yang paling penting adalah asam fenolat yang

termasuk dalam struktur polimerik, seperti tannin yang dapat terhidrolisa, lignan,

stilbenes dan flavonoid. Senyawa yang termasuk flavonoid adalah flavonol

(misalnya quercetin dan kaempferol, flavonoid yang banyak terdapat dalam

makanan), flavon, isoflavon, flavanone, antosianidin (pigmen yang

bertanggungjawab dalam warna buah), flavanol (katekin-monomer dan

proantosianidin-polimer) (Petti dan Scully, 2009).

Zat bioaktif yang terdapat dalam teh hijau, utamanya merupakan

flavonoid. Flavonoid dapat digolongkan menjadi enam kelas, yaitu flavon,

flavanon, isoflavon, flavonol, flavanol, dan antosianin. Flavonoid yang ditemukan

dalam teh hijau adalah flavanol dan flavonol. Katekin merupakan flavonoid yang

termasuk dalam kelas flavanol (Hartoyo, 2003). Katekin bersifat asam lemah

(pKa1 = 7,72 dan pKa2 = 10,22), sukar larut dalam air dan sangat tidak stabil di

udara terbuka. Bersifat mudah teroksidasi pada pH mendekati netral (pH 6,9) dan

lebih stabil pada pH lebih rendah (pH 2,8 dan 4,9). Katekin juga mudah terurai

oleh cahaya dengan laju reaksi lebih besar pada pH rendah (pH 3,45)

dibandingkan pH 4,9 (Lucida, Bakhtiar, Putri, 2007). Banyaknya gugus hidroksil


10

yang ada dalam katekin, terutama gugus hidroksi pada cincin B, menjadi faktor

utama yang menyebabkan ketidakstabilan katekin terhadap oksidasi oleh oksigen,

pH, cahaya dan antioksidan lain. Katekin teh stabil pada suhu kamar dan

terdegradasi sebesar 20% ketika dipanaskan pada suhu 98 °C selama 20 menit.

Saat dipanaskan dalam autoklaf pada suhu 120 °C terjadi epimerisasi dari (-)

EGCG menjadi (-) GCG dan degradasi sebesar 24% (Susanti, 2011).

Terdapat beberapa katekin dalam teh hijau, yaitu epicatechin (EC),

epicatechin-3-gallate (ECG), epigallocatechin (EGC), epigallocatechin-3-gallate

(EGCG), catechin, dan gallocatechin (GC). EGCG adalah katekin yang

jumlahnya paling banyak dalam teh hijau, sekitar 65% dari total katekin.

Secangkir teh hijau mengandung 100-200 mg EGCG (Zaveri, 2006). Teh hijau

memiliki kandungan katekin yang dapat menghambat efek pertumbuhan bakteri

kariogenik (menyebabkan karies) dengan cara menghambat pertumbuhan bakteri

penyebab plak pada permukaan gigi (Alschuler, 1998), dengan beberapa

mekanisme, yaitu dengan menghambat proliferasi agen-agen infeksi streptococcus

(bakteri penyebab karies gigi), mengganggu proses perlekatan bakteri pada

enamel gigi (Tahir and Moeen, 2011), menghambat metabolisme, pertumbuhan,

proses produksi asam dari bakteri, dan menghambat aktivitas enzim glucosyl

transferase (GTF) dan enzim amilase (Xu, dkk., 2011).


11

Gambar 1.Struktur berbagai polifenol katekin dalam teh hijau

(Zaveri, 2006)

Hasil penelitian yang dilakukan oleh Shimamura, Zhao, and Hu (2007),

menunjukkan bahwa peptidoglikan yang ditambahkan dalam media tumbuh

S.aureus yang diberi EGCG dapat menghambat aktivitas bakterisidal dari EGCG

terhadap S.aureus, sedangkan lipopolisakarida (LPS) dan dekstran tidak.

Peptidoglikan adalah kompleks cross-linked polisakarida dan peptida. EGCG

dapat berikatan langsung dengan peptidoglikan dan menginduksi presipitasi

peptidoglikan. Oleh karena itu, kerusakan dinding sel yang diinduksi oleh EGCG

dan terganggunya biosintesis dinding sel oleh EGCG melalui perikatan dengan

peptidoglikan merupakan alasan utama lebih rentannya bakteri gram positif

terhadap EGCG. Dibandingkan dengan gram negatif, dinding sel gram positif

memiliki satu lapis peptidoglikan yang tebal, sedangkan bakteri gram negatif

memiliki banyak lapisan peptidoglikan yang tipis. Meskipun bakteri gram negatif

memiliki beberapa lapis peptidoglikan, bakteri tersebut dilapisi oleh membran

terluar yang tersusun oleh LPS. Membran terluar merupakan barier permeabel

yang sangat penting dan berfungsi sebagai perlindungan terhadap berbagai


12

material antibakteri. Oleh karena itu, fungsi fisiologis dari membran terluar dan

rendahnya afinitas antara EGCG dan LPS membatasi perikatan EGCG terhadap

peptidoglikan, sehingga mengurangi kerentanan bakteri gram negatif terhadap

EGCG.

Katekin memiliki struktur karbon C6-C3-C6 dan terdapat dua cincin

aromatis, A dan B. Jumlah gugus hidroksil pada cincin B dan ada tidaknya gugus

galloyl menyebabkan perbedaan struktur. Telah dilaporkan bahwa katekin dengan

struktur pyrogallol pada cincin B, seperti EGC dan EGCG, serta katekin dengan

gugus galloyl, seperti ECG dan EGCG memiliki aktivitas antioksidan lebih kuat

dari pada yang lainnya (katekin (C) dan EC). Efek penghambatan pembentukkan

biofilm (sekelompok mikroorganisme yang menempel pada permukaan gigi) oleh

gugus galloyl membutuhkan ke tiga gugus hidroksil yang menjadi penyusunnya.

Tidak ada aktivitas bakterisidal yang ditunjukkan ketika hanya gugus galloyl saja,

namun pada senyawa katekin dengan gugus galloyl (misalnya CG, ECG, GCG

dan EGCG) terjadi penghambatan pembentukkan biofilm yang efektif. Hal ini

menunjukkan bahwa penambahan gugus galloyl pada senyawa katekin akan

mendesak efek penghambatan bakteri bersinergis dengan mekanisme

penghambatan bakteri lainnya, seperti aktivitas bakterisidal (Matsunaga, dkk.,

2010). Selain itu, ion hidroksil secara kimia menyebabkan perubahan komponen

organik dan transport nutrisi sehingga menimbulkan efek toksik terhadap sel

bakteri (Sumono dan Wulan, 2009).

Aktivitas bakterisidal katekin diperkirakan karena adanya produksi

hidrogen peroksida yang dihasilkan melalui pembentukkan Reactive Oxidative


13

Species (ROS) (Matsunaga, dkk., 2010). Hidrogen peroksida dibentuk di larutan

aqueous melalui disosiasi (pembebasan) proton dari gugus hidroksil. Elektron

bebas dalam cincin fenol mengurangi molekul oksigen, membentuk O22-,

sementara proton bebas akan berikatan dengan O22-, membentuk hidrogen

peroksida (Petti, Scully, 2009). Hidrogen peroksida dapat menekan transkripsi gen

yang menghasilkan polisakarida, sehingga menghambat pembentukkan biofilm

dan akhirnya terjadi kekacauan pada membran sel (Matsunaga, dkk., 2010). Pada

S.mutans, polisakarida yang ada berupa glukan tak larut air (glycocalyx) yang

berfungsi membantu perlekatan bakteri pada permukaan gigi (Simon, 2007).

Katekin, khususnya EGCG, mampu menghambat aktivitas enzim

glycosyl transferase (GTF) sehingga pembentukkan dan integritas dari oral

biofilm terganggu. EGCG dan katekin lainnya dari teh hijau juga telah dilaporkan

dapat menekan aktivitas kelenjar air ludah dan aktivitas enzim amilase yang

mengarah pada inefisiensi dari metabolisme karbohidrat. EGCG juga dapat

menghambat produksi asam dengan menghambat jalur glikolisis bakteri dan

penekanan phosphotransferase system (PTS) oleh enolase, suatu sistem untuk

memasukan gula ke dalam sel ketika kondisi kehabisan gula (Xu, dkk.,2011).

C. Karies dan Plak Gigi

Karies gigi adalah proses kerusakan yang dimulai dari enamel hingga ke

dentin. Karies gigi merupakan penyakit yang berhubungan dengan banyak faktor

yang saling mempengaruhi. Ada tiga faktor utama, yaitu gigi dan saliva,

mikroorganisme, dan substrat, serta waktu sebagai faktor tambahan. Bila keempat


14

faktor tersebut saling berinteraksi maka terjadi karies (Irhamsyah, 2003).

Terbentuknya karies gigi tidak lepas dari plak gigi yang merupakan biofilm

kompleks yang terbentuk oleh >500 spesies bakteri berbeda yang normalnya

terdapat dalam commensal harmony dengan sel inang (Matsunaga, dkk., 2010).

Terdapat tiga tahap pembentukkan plak gigi; pertama molekul saliva diadsorbsi ke

dalam enamel bersamaan dengan pembersihan gigi oleh saliva. Kemudian enamel

diselubungi oleh campuran kompleks komponen yang terdiri dari glikoprotein,

protein kaya prolin yang bersifat asam, mucins, debris sel bakteri, exoproduct, dan

asam sialin. Tahap ke dua adalah interaksi spesifik sel bakteri dengan permukaan

gigi yang akhirnya membentuk biofilm. Formasi biofilm awalnya dibentuk oleh

koloni Streptococcus sanguis dan Actinomyces viscous, dipengaruhi oleh banyak

parameter lingkungan, seperti osmolaritas, sumber karbon dan pH. Pada tahap ke

tiga, spesies bakteri lain seperti S.mutans menempel pada koloni Streptococcus

sanguis dan Actinomyces viscous dengan interaksi sel-sel. Pertumbuhan bakteri

berikutnya pada permukaan gigi akan mengarah pada pembentukan biofilm pada

gigi, yang juga dikenal sebagai plak gigi. Bakteri S.mutans dan Streptococcus

sobrinus memiliki peran utama dalam etiologi karies gigi, karena ke duanya dapat

melekat pada enamel salivary pellicle dan bakteri plak lainnya. Bakteri S.mutans

dan Laktobasilus merupakan penghasil asam kuat yang kemudian dapat

menyebabkan lingkungan menjadi asam, menimbulkan resiko terjadinya lubang

halus pada gigi (cavity). Biasanya, keberadaan S.mutans pada cavity gigi akan

diikuti dengan terbentuknya karies setelah 6-24 bulan (Forssten, Bjorklund,

Ouwehand, 2010).


15

Bakteri yang berperan penting dalam pembentukkan plak adalah bakteri

yang mampu memfermentasi polisakarida (karbohidrat) ekstraseluler (EPS), yaitu

bakteri dari genus Streptococcus, Staphylococcus dan Lactobacillus. Bakteri

tersebut memfermentasi karbohidrat dan menghasilkan asam organik sehingga

mengubah pH rongga mulut menjadi asam. Struktur email gigi akan terlarut pada

pH < 5,41 dan terjadi karies gigi (Indrawati, 2009). Bakteri S. mutans melakukan

perlekatan dengan permukaan email gigi dengan menggunakan glycocalyx.

Glycocalyx merupakan suatu kumpulan besar serabut dari polisakarida atau

cabang dari molekul gula yang mengelilingi suatu sel individu atau koloni sel.

Perlekatan polisakarida pada gigi akan menimbulkan plak gigi, yaitu bentuk

akumulasi dari kumpulan bermacam-macam bakteri dalam suatu matriks dextran;

kemungkinan sebanyak 500 sel tebalnya. Terbentuknya asam laktat oleh

streptococci terjadi melalui jalur fermentasi homolaktik karena produk akhir yang

terbentuk hanya asam laktat. Adanya dua molekul ADP dan dua molekul fosfat,

molekul glukosa dapat difermentasikan menjadi dua molekul asam laktat dan dua

molekul ATP. Asam laktat ini lama kelamaan akan mengikis email gigi yang

kemudian akan membentuk karies (lubang) (Atlas, 1997).

Pencegahan akumulasi plak untuk mencegah karies gigi dilakukan

dengan memperhatikan jenis makanan yang dikonsumsi dan membersihkan gigi

secara teratur dengan pasta gigi atau obat kumur yang mengandung antibakteri.

Pasta gigi yang beredar di pasaran umumnya mengandung fluor yang bersifat

antibakteri. Penggunaan pasta gigi dengan konsentrasi fluor tinggi dapat

menimbulkan efek samping berupa fluorosis email dan belum efektif membunuh


16

bakteri karena lebih bersifat menghambat, selain itu bahan kimia ini relatif mahal.

Penggunaan antibiotika dalam pemberantasan plak seperti penisilin, vankomisin

dan klorheksidin secara rutin dapat menyebabkan resistensi dan efek samping

seperti diskolorisasi gigi (Indrawati, 2009). Pencegahan karies lainnya adalah

dengan menggunakan obat kumur antiseptik misalnya klorheksidin. Klorheksidin

merupakan derivat dari bis-guanid bis – fenol yang bersifat bakterisidal baik

terhadap bakteri Gram negatif maupun positif. Klorheksidin mampu mengubah

struktur permukaan sel, sehingga menyebabkan hilangnya keseimbangan osmotik,

selanjutnya terjadi penonjolan membran sitoplasma, terbentuk vesikel dan

keluarnya sitoplasma, dapat menghambat perbaikan sel dan akhirnya terjadi

kematian sel. Kerugian penggunaan klorheksidin sebagai obat kumur adalah

terjadi pewarnaan pada gigi dan lidah serta menyebabkan iritasi pada mukosa

(Sumono dkk., 2009). Xylitol adalah gula alkohol atau polyol yang secara alami

terdapat dalam metabolisme manusia, dan dapat digunakan secara aman dalam

produk dental ataupun bahan makanan. Xylitol dilaporkan dapat mempengaruhi

sintesis polisakarida S.mutans, yang mengarah pada penurunan perlekatan bakteri.

Triklosan adalah komponen organik dengan kemampuan antibakteri yang telah

digunakan dalam pasta gigi. Triklosan menghambat pertumbuhan S.mutans

dengan mensensitisasi glikolisis untuk menghambat asam dengan bekerjasama

dengan karier proton transmembran yang bersifat asam lemah, seperti fluoride.

Xylitol dapat dianggap sebagai substansi pencegah plak yang lebih aman

digunakan daripada triklosan, karena triklosan dapat bereaksi dengan klorin dalam

air keran dan membentuk kloroform yang bersifat toksik (Forrsten, dkk., 2010)


17

Penelitian yang dilakukan oleh Sumono dkk. (2009) menunjukkan bahwa

kumur dengan air rebusan daun salam dapat mengurangi jumlah koloni bakteri

Streptococcus sp., dan semakin tinggi konsentrasi rebusan daun salam maka

jumlah bakteri Streptococcus sp. akan semakin sedikit. Hal ini disebabkan adanya

kandungan kimia aktif daun salam yaitu tanin (senyawa fenol, bekerja dengan

mendenaturasi protein dan menurunkan tegangan muka, sehingga permeabilitas

bakteri meningkat, pertumbuhan sel terhambat dan akhirnya kematian sel),

flavonoid, minyak atsiri 0,05% (mempunyai efek analgesik) yang terdiri dari sitral

dan eugenol.

D. Maserasi

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana dengan merendam

serbuk simplisia dalam cairan penyari. Prinsip dasar maserasi adalah cairan

penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang

mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan

konsentrasi antara larutan di dalam dan di luar sel, maka larutan yang terpekat

didesak ke luar hingga terjadi keseimbangan. Maserasi digunakan untuk penyarian

simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari,

tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam cairan penyari, tidak

mengandung benzoin, stirak dan lain-lain. Keuntungan cara penyarian dengan

maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan

mudah diusahakan, sedangkan kerugiannya adalah pengerjaan lama dan penyarian

kurang sempurna (DepKes RI, 1986).


18

Cairan pelarut dalam proses pembuatan ekstrak dipilih pelarut yang baik

(optimal) yang dapat melarutkan senyawa bioaktif. Kebijakan dan peraturan

pemerintah membatasi cairan pelarut yang diperbolehkan, yaitu air, etanol serta

campurannya. Metanol dihindari penggunaannya karena sifatnya yang toksik

(Sidik dan Mudahan, 2000 cit., Paribasa,2007). Air dipertimbangkan sebagai

penyari karena murah dan mudah diperoleh, stabil, tidak mudah menguap dan

tidak mudah terbakar, tidak beracun dan alamiah, tetapi sebagai penyari kerugian

air adalah tidak selektif, sari dapat ditumbuhi kapang dan bakteri, serta cepat

rusak dan untuk pengeringan dibutuhkan waktu yang lama. Sedangkan etanol

meskipun harganya cukup mahal, tetap dipertimbangkan sebagai penyari karena

lebih selektif; kapang, khamir dan bakteri lebih sulit tumbuh dalam etanol 20%

keatas; dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan; pengeringan dalam

waktu singkat. Etanol dapat melarutkan alkaloid, glikosida, flavonoid, damar,

klorofil, lemak, tanin dan saponin (DepKes RI, 1986).

E. Streptococcus mutans

Genus Streptococcus memiliki sel berbentuk bulat (spherical) atau bulat

telur, dengan diameter 0,5-2,0 µm, berpasangan atau berbentuk rantai ketika

tumbuh pada media cair; terkadang memanjang pada aksis rantai menjadi bentuk

lanset, nonmotil, tidak berspora dan merupakan gram positif, beberapa spesies

tidak berkapsula, fakultatif anaerob, kemoorganotrof, membutuhkan media yang

kaya nutrient untuk tumbuh dan terkadang 5% CO2, metabolit dari hasil

fermentasi sebagian besar adalah laktat bukan gas, hasil negatif pada uji katalase.


19

Umumnya menyerang sel darah merah, tumbuh pada temperatur 25-45°C

(optimum 37°C), parasit bagi vertebrata, kebanyakan tinggal atau berhabitat di

mulut dan jalur pernapasan bagian atas; beberapa spesies bersifat patogen bagi

manusia dan hewan. Genus Streptococcus menunjukkan hasil positif pada uji

Voges-Proskauer (VP), serta membentuk asam dari inulin, laktosa, manitol,

raffinosa, salisin, sorbitol, dan trehalose (Holt, dkk., 2000).

Pada proses terbentuknya karies, produksi asam laktat meningkat ketika

sukrosa masuk ke dalam mulut melalui makanan berat atau ringan dan

menghasilkan penurunan pH mulut. Jadi, jika keasaman adalah prasyarat untuk

terbentuknya karies, maka hanya spesies yang dapat tumbuh subur dalam

lingkungan asam, disebut spesies asidofilik, yang dapat berperan dalam

menghasilkan karies. Spesies tersebut adalah Lactobacillus casei, Veilonella

dispar dan terutama Streptococcus mutans yang dapat mendominasi tempat yang

sebelumnya diduduki oleh spesies lain. Namun diantara semua spesies bakteri

rongga mulut tersebut, S.mutans merupakan penyebab utama terjadinya karies

gigi. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu: pertama, S.mutans adalah

bakteri anaerobik yang diketahui membentuk asam laktat sebagai bagian dari

metabolismenya (Simon, 2007), dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan

spesies Streptococci lainnya (Safitri, 2004). S.mutans juga mampu membuat

bahan cadangan makanan intraseluler yang serupa dengan glikogen. Sintesa dari

polisakarida intraseluler ini terjadi bila ada gula dalam jumlah berlebihan. Apabila

persediaan gula yang eksogen sudah habis terpakai, maka bakteri S.mutans akan

memecah kembali polisakarida intraseluler yang sudah disimpannya (Nasution,


20

2006), dengan demikian dapat menghasilkan asam terus menerus (Safitri, 2004).

Kemudian adanya kemampuan S.mutans dalam berikatan dengan permukaan gigi

saat terdapat sukrosa dengan membentuk glukan tak larut air, suatu polisakarida

yang membantu perikatan bakteri dengan gigi. Faktor virulensi terpenting adalah

sifat asidofilik S.mutans. Tidak seperti kebanyakan mikroorganisme mulut,

S.mutans tumbuh subur dalam kondisi asam dan menjadi bakteri yang dominan

dalam kultur dengan pengurangan pH yang tetap. Selain itu, tidak seperti spesies

lain di plak yang metabolismenya lambat pada pH rendah, metabolisme S.mutans

meningkat secara pasti, sebagai sistem penggerak proton yang digunakan untuk

transport nutrient melalui dinding selnya dalam lingkungan ber-pH rendah atau

lingkungan dengan kadar glukosa tinggi, yang dimodulasi oleh keberadaan ion

hidrogen yang meningkat seiring dengan keasaman. Bakteri S.mutans dapat

menurunkan atau menjaga pH mulut pada nilai keasaman yang tidak biasa,

menciptakan kondisi yang sesuai untuk dirinya sendiri namun tidak sesuai untuk

spesies lain yang pernah hidup bersama dengan S.mutans. Penurunan pH inilah

yang menghasilkan demineralisasi dan kavitasi (pembentukkan lubang pada gigi).

Keduanya meningkat bersamaan dengan peningkatan laju pertumbuhan S.mutans

(Simon, 2007).

S.mutans dapat membentuk polisakarida ekstraseluler/Extracellular

Polysaccharides (EPS) ketika terdapat sukrosa, fruktosa dan/atau glukosa. EPS

adalah polimer rantai panjang berbobot molekul besar yang merupakan faktor

penting dari kariogenisitas S.mutans. Energi dari glukosa dan fruktosa

memberikan suplai energi bebas yang diperlukan dalam sintesis EPS.


21

Homopolisakarida glukosa yang disebut glukan diproduksi oleh

glukosiltransferase (GTF). Glukan tidak larut air menyediakan sumber substrat

yang dapat difermentasi dan mampu meningkatkan kariogenisitas EPS dengan

meningkatkan akses nutrien. Glukan berperan sebagai adesif terhadap permukaan

gigi dan merupakan senyawa pokok dalam kariogenisitas S.mutans. Sebagai

tambahan, glukan diperlukan dalam interaksi adesif antar sel dan antara sel

dengan permukaan gigi dalam plak dengan agregasi bakterial yang dimediasi

dekstran (Forssten, dkk., 2010). EPS yang dihasilkan melekat kuat pada gigi dan

membentuk plak gigi yang akan ditempati streptococci, kemudian terjadi

fermentasi fruktosa menjadi bentuk asam laktat. Selanjutnya, adanya asam laktat

ini akan menyebabkan email gigi mengalami decalcification (penurunan jumlah

kalsium) dan softening (gigi semakin melunak). Pada akhirnya akan terbentuk

lubang-lubang kecil yang disebut karies gigi (Cappuccino, dkk., 2008).

F. Pengujian Potensi Antibakteri

Antibakteri adalah senyawa pembasmi bakteri yang bersifat toksik untuk

bakteri, namun relatif tidak toksik untuk inangnya (Sulistia, 1995).

Terdapat 2 metode pengujian antibakteri, yakni:

1. Uji difusi

Prinsip metode difusi yaitu pengukuran potensi antibakteri berdasarkan

diameter zona hambat pertumbuhan bakteri karena berdifusinya obat dari titik

awal pemberian ke daerah difusi (Volk dan Wheeler, 1988). Terdapat dua macam

metode difusi, yaitu:


22

a. Kirby Bauwer/ paper disc. Paper disc yang berisi agen antibakteri

diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikrobia yang akan berdifusi

pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan

pertumbuhan mikrobia oleh agen antibakteri pada permukaan media agar (Pratiwi,

2008).

b. Sumuran. Pada agar yang telah ditanami mikroba, dibuat sumuran

dengan garis tengah tertentu. Dan ke dalam sumuran diberi larutan uji antimikroba

dan diinkubasikan pada suhu 370C selama 18-24 jam. Parameter yang diamati

adalah diameter zona hambat yang dihasilkan larutan uji antimikroba (Edber,

1986).

2. Uji dilusi

Prinsip metode dilusi adalah pengenceran obat atau antibakteri hingga

didapatkan beberapa konsentrasi yang kemudian akan diuji untuk mendapatkan

nilai Kadar Hambat Minimum (KHM) dan nilai Kadar Bunuh Minimum (KBM)

(Sulistia, 1995).Sejumlah obat tertentu dicampurkan pada pembenihan bakteri

yang cair atau padat. Kemudian pembenihan tersebut ditanami dengan bakteri

yang diperiksa dan dieram. Keuntungn metode ini adalah memungkinkan adanya

suatu hasil kuantitatif, yang menunjukan jumlah obat yang diperlukan untuk

menghambat/mematikan mikroorganisme yang diperiksa (Jawetz, Melnick, dan

Adelberg, 2007). Metode dilusi meliputi hal sebagai berikut.

a. Dilusi padat. Pada metode dilusi padat, setiap konsentrasi antibakteri

dicampurkan dengan media agar, kemudian ditanami bakteri (Jawetz, Melnick,

dan Adelberg, 1991).


23

b. Dilusi cair. Pada metode dilusi cair, masing-masing konsentrasi

dicampurkan langsung dengan media (Jawetz, dkk., 1991).

Parameter yang diukur pada metode dilusi cair adalah tingkat kekeruhan

yang menunjukkan nilai Optical Density (OD), yakni nilai kerapatan yang

menunjukkan pertumbuhan mikrobia uji dibandingkan dengan blanko standar

autozero. Bakteri yang bermultiplikasi pada media cair akan menyebabkan media

menjadi keruh. Alat yang digunakan untuk pengukuran adalah spektrofotometer

atau kolorimeter dengan cara membandingkan OD antara media tanpa

pertumbuhan bakteri dan media dengan pertumbuhan bakteri (Pratiwi, 2008).

Spektrofotometer dapat mengukur kepekatan sel dalam suspensi dalam %T

(transmittance) atau OD (jumlah cahaya yang diabsorpsi dan disebarkan). Dalam

mikrobiologi digunakan OD sebagai satuan hitungan, karena OD sebanding

dengan kepekatan sel dalam suspensi biakan (Lay, 1994). Pada spektrofotometer,

berkas cahaya ditransmisikan melalui suspensi bakteri lalu diteruskan ke detektor

sensitif cahaya. Jika jumlah bakteri meningkat, sedikit cahaya yang akan

diteruskan ke detektor. Perubahan intensitas cahaya akan terlihat pada skala yang

terdapat pada alat, yaitu nilai absorbans atau densitas optik (optical density)

(Radji, 2010).

Kadar Hambat Minimum (KHM) suatu antibiotik adalah konsentrasi

terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan mikroba tertentu. Kadar

Bunuh Minimum suatu antibiotik adalah konsentrasi antibiotik terendah yang

dapat membunuh pertumbuhan mikroba tertentu. KHM dan KBM dapat

ditentukan dengan metode tabung dilusi. Prosedur ini digunakan untuk


24

menentukan konsentrasi antibiotik yang masih efektif untuk mencegah

pertumbuhan patogen dan mengindikasikan dosis antibiotik yang efektif dalam

mengontrol infeksi pada pasien (Radji, 2010). Penentuan nilai KHM didasarkan

pada konsentrasi terendah senyawa antibakteri dengan nilai OD yang telah

mencapai 0 pada pengukuran dengan spektrofotometer dan masih menunjukkan

pertumbuhan bakteri pada uji penegasan secara streak plate. Nilai KBM

didasarkan pada konsentrasi terendah senyawa antibakteri dengan nilai OD yang

telah mencapai 0 pada pengukuran dengan spektrofotometer dan sudah tidak

menunjukkan pertumbuhan bakteri pada uji penegasan secara streak plate

(McKane dan Kandel, 1996).

G. Landasan Teori

Teh hijau dibuat dari daun teh yang belum difermentasikan dan

mengandung antioksidan kuat terutama katekin dengan konsentrasi tertinggi.

Katekin merupakan senyawa flavonoid dari golongan flavanol yang terkandung

dalam teh hijau. Adanya kandungan katekin terutama EGCG pada teh hijau

menghasilkan daya antibakteri yang efektif dalam menghambat bakteri mulut

penyebab karies gigi, salah satunya adalah S.mutans yang merupakan bakteri

pencetus terjadinya karies. S.mutans dapat menghasilkan glucosyl transferase

(GTF) yang digunakan untuk mengubah sukrosa menjadi polisakarida

ekstraseluler (EPS). Glukan yang dihasilkan oleh bakteri membantu EPS untuk

melekat pada email gigi dan menginduksi terjadinya agregasi berbagai spesies

bakteri pada permukaan gigi yang disebut plak. Dari proses terjadinya plak gigi


25

ini dihasilkan asam yang menyebabkan penurunan kalsium dan pelunakan pada

gigi. Plak yang dibiarkan lama kelamaan menyebabkan terbentuknya lubang-

lubang halus pada permukaan gigi yang disebut karies.

Mekanisme katekin yaitu berinteraksi dengan sel bakteri melalui proses

adsorbsi yang melibatkan ikatan hidrogen, sehingga terbentuk suatu kompleks

protein. Akan tetapi, kompleks protein yang terbentuk relatif lemah sehingga

segera terurai dan gugusan fenol terpenetrasi ke dalam sel dan menyebabkan

denaturasi protein yang pada akhirnya menyebabkan pelisisan sel bakteri (Parwata

dan Dewi, 2008). Katekin didapatkan dari ekstrak etanol hasil maserasi teh hijau.

Adanya potensi antibakteri dilihat dengan metode difusi paper disc berdasarkan

terbentuknya diameter zona jernih di sekitar paper disc.

Hasil penelitian ini dapat menjadi informasi kepada masyarakat tentang

efektifitas ekstrak etanol teh hijau dalam menghambat karies gigi dan dapat

dijadikan dasar untuk pengembangan sediaan farmasetik yang lebih efektif dan

efisien digunakan di masyarakat. Kedua hal tersebut diharapkan dapat mengurangi

prevalensi kasus karies gigi di Indonesia.

H. Hipotesis

Berbagai variasi konsentrasi ekstrak etanol teh hijau memiliki potensi

antibakteri terhadap S. mutans penyebab karies gigi.


26

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni

dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Penelitian dilakukan di

Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada

dan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Laboratorium Mikrobiologi, dan

Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas: ekstrak etanol teh hijau dengan variasi konsentrasi

EGCG 0,25 ; 0,5 ; 0,75 ; 1 ; 2,5 ; 5 ; 7,5 ; dan 10 mg/mL berdasarkan

pengembangan konsentrasi dari penelitian sebelumnya (Pratikno, 2003).

b. Variabel tergantung: diameter zona hambat ekstrak etanol teh hijau

terhadap pertumbuhan S. mutans, nilai KHM, nilai KBM.

c. Variabel pengacau terkendali: jenis bakteri uji (S.mutans), waktu

inkubasi (24 jam), suhu inkubasi (37°C), kepadatan suspensi bakteri uji

setara dengan larutan standar Mc. Farland II (6.108 CFU/mL), asal teh

hijau (Perkebunan Teh Rumpun Sari Medini Boja Kabupaten Kendal,


27

Jawa Tengah), metode ekstraksi (maserasi), volume suspensi bakteri uji

(1 mL), volume senyawa uji dalam paper disc (25 µL).

2. Definisi operasional

a. Teh hijau adalah daun dari tumbuhan teh (Camellia sinensis L.) yang

diperoleh dari Perkebunan Teh Rumpun Sari Medini Boja, Kabupaten

Kendal, Jawa Tengah dengan proses pengolahan berdasarkan surat

keterangan dari PT Medini Boja.

b. Potensi antibakteri adalah kemampuan ekstrak etanol teh hijau dalam

menghambat atau membunuh bakteri uji S. mutans dibandingkan dengan

kontrol negatif yang ditunjukkan dari diameter zona hambat dan nilai

KHM dan KBM.

c. Ekstrak etanol teh hijau adalah ekstrak yang diperoleh dengan cara

mengekstraksi daun teh secara maserasi dengan cara merendam

simplisia dalam larutan penyari etanol selama tiga hari, sehingga

didapatkan ekstrak teh kental yang kemudian diencerkan sesuai variasi

konsentrasi yang telah ditentukan. Proses ekstraksi dilakukan

berdasarkan prosedur kerja dari Lembaga Penelitian dan Pengujian

Terpadu Universitas Gajah Mada.

d. Difusi paper disc, yaitu suatu metode uji potensi antibakteri dengan

didasarkan pada proses terdifusinya ekstrak etanol daun teh hijau dalam

paper disc ke media sekitar yang sudah diinokulasikan S.mutans dengan

waktu inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C.


28

e. Dilusi cair, yakni metode uji penentuan nilai KHM dan KBM dari

berbagai variasi konsentrasi EGCG ekstrak etanol daun teh hijau dengan

melihat nilai Optical Density (OD) menggunakan spektrofotometer

visible.

f. Zona hambat adalah zona jernih di mana terdapat pengurangan

pertumbuhan S. mutans dilihat dari kejernihan media dibandingkan

dengan kontrol negatif.

g. Kultur murni S. mutans adalah kultur yang diperoleh dari hasil reisolasi

yang telah diuji kemurnian dan identitasnya sesuai Holt, dkk. (2000).

h. Optical Density (OD) adalah nilai kerapatan optik berdasarkan kekeruhan

yang menunjukkan pertumbuhan populasi sel bakteri S. mutans

dibandingkan blanko autozero menggunakan spektrofotometer.

i. Kadar Hambat Minimum (KHM) adalah konsentrasi terendah dari

ekstrak etanol teh hijau yang dapat menghambat atau mengurangi

populasi S.mutans dalam media.

j. Kadar Bunuh Minimum (KBM) adalah konsentrasi terendah dari ekstrak

etanol teh hijau yang dapat membunuh atau menghilangkan sama sekali

populasi S.mutans dalam media.

C. Bahan

Teh hijau yang diperoleh dari Perkebunan Teh Rumpun Sari Medini

Boja, Kabupaten Kendal, Jawa Tengah, yang didapatkan dari saudari Maria Siska

Triyuniar Kusumastuti (Lampiran 1 dan 2), kultur bakteri strain S. mutans yang

telah diuji kemurnian dan identitasnya di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas


29

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, etanol, aquadest steril, media

Nutrien Broth (NB), media Nutrien Agar (NA), cairan standar Mc. Farland II

(6.108 CFU/mL), larutan pembanding epigallo catechin gallate (EGCG).

D. Alat

Alat-alat gelas: beaker glass (Pyrex), erlenmeyer (Pyrex), tabung reaksi

(Pyrex), cawan petri (Pyrex), pipet volume (Pyrex), flakon (Pyrex). Oven

(Memmert 7200 Tuttlingen, Germany), autoklaf (KT-40, ALP co, Lt, Hamurashi

Tokyo, Japan), mikro pipet (Ependorf-Netler-Hinz), vortex (Janke & Kunkel, Ika-

labotechnic, werk VF 1), bunsen, sengkelit (loop), timbangan/ neraca analitik

(Mettler PC 2000), penangas magnetik (Janke & Kunkel, IKA-Combimag RCT

tipe RCT Nr. 61801), stirer, lemari es, penggaris, pipet filler, Spektrofotometer

UV-Visible.

E. Tata Cara Penelitian

1. Identifikasi teh hijau

Daun teh diperoleh dari Perkebunan Teh Rumpun Sari Medini Boja,

Kabupaten Kendal, Jawa Tengah dan diolah tanpa mengalami proses fermentasi

untuk menjaga senyawa aktif yang terkandung di dalamnya, serta dilakukan

identifikasi daun teh berdasarkan prosedur kerja dari Laboratorium Penelitian dan

Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.


30

2. Pembuatan serbuk teh hijau

Daun teh kering yang diperoleh dari Perkebunan Teh Rumpun Sari Medini

Boja, Kabupaten Kendal, Jawa Tengah diserbuk sesuai Prosedur kerja di

Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada

menggunakan mesin penyerbuk dengan saringan berdiameter 1 mm.

3. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau

Pembuatan ekstrak etanol teh hijau dilakukan di Laboratorium Penelitian

dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada. Sebanyak 400 g serbuk

daun teh dilarutkan dalam 3000 mL etanol sedikit demi sedikit. Diaduk selama 30

menit, diamkan selama 24 jam, disaring kemudian diulang sebanyak tiga kali.

Filtrat yang didapat diuapkan menggunakan vaccum rotary evaporator dengan

suhu 70°C.

4. Verifikasi kualitatif-kuantitatif kandungan senyawa epigalokatekin-3-galat (EGCG) dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Spektrofotometer Densitometri Verifikasi kualitatif dan kuantitatif EGCG dilakukan berdasarkan prosedur

kerja yang dilakukan oleh Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu

(LPPT) Universitas Gadjah Mada. Sampel ditimbang secara seksama dan

diekstraksi dengan 1 ml etanol, kemudian divortex selama 2 menit. Spoting

sampel sebanyak 10 µL pada plate silikagel F254 dan disertakan pembanding

EGCG. Masukkan hasil spoting (penotolan) ke dalam chamber yang telah

dijenuhkan dengan fase geraknya, yaitu kloroform-asam asetat-asam formiat-

isopropanol (16:2:2:8 v/v). Elusi hingga batas, diangkat dan dikeringkan. Amati


31

hasil perambatan spot menggunakan lampu UV 254 nm dan perhitungan kadar

EGCG dengan KLT-densitometri pada panjang gelombang 305 nm.

5. Uji kemurnian dan identifikasi bakteri uji

Uji kemurnian dan identifikasi bakteri dilakukan di Laboratorium

Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Kultur

S.mutans diambil sebanyak 1 loop dengan jarum ose kemudian di inokulasikan

pada media cawan NA dengan metode streak plate. Setelah diinkubasi selama 24

jam pada suhu 37°C, koloni bakteri yang terpisah diisolasi kembali beberapa kali

pada media NA miring dan NB.

Koloni hasil isolasi kembali kemudian diidentifikasi dengan beberapa

metode, yaitu pengecatan gram dan uji biokimia yang meliputi uji Katalase,

Oksidasi-Fermentasi (O-F), Methyl Red (MR) - Voges-Proskauer (VP), dan media

Triple Sugar Iron Agar (TSIA). Uji ini disesuaikan dengan karakteristik khas

S.mutans berdasarkan buku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology

(Holt,dkk., 2000).

a. Pengecatan Gram. Uji identifikasi bakteri uji diawali dengan pengecatan

Gram untuk mengetahui sifat Gram dan bentuk sel bakteri uji. Pada pengecatan

Gram ini kultur dari media NA miring dioleskan dahulu pada gelas obyek lalu

ditetesi aquadest dan difiksasi dengan melewatkan gelas obyek tersebut diatas

bunsen hingga bakteri kering. Setelah proses fiksasi, gelas benda yang sudah

terdapat bakteri tersebut dicat dengan menggunakan beberapa reagen, yaitu Gram

A (Kristal violet), Gram B (Larutan iodium), Gram C (Alkohol 96%), dan Gram

D (Safranin).


32

b. Uji katalase. Satu sampai dua tetes 30% hidrogen peroksida diletakkan

pada gelas benda, kemudian ditambahkan 1 ose atau 2-3 tetes suspensi isolat

murni bakteri uji. Katalase positif ditandai dengan pembentukan buih seketika,

dibandingkan dengan kontrol. S. mutans bersifat katalase negatif berdasarkan

buku panduan determinasi bakteri (Holt, dkk., 2000).

c. Uji oksidasi-fermentasi (O-F). Isolat murni bakteri uji diinokulasikan

dalam empat tabung berisi media O-F yang mengandung 1% dekstrosa

(karbohidrat). Tabung 1 ditutup dengan parafin lunak, tabung 2 tidak ditutup

parafin, tabung 3 digunakan sebagai kontrol ditutup parafin, dan tabung 4

digunakan sebagai kontrol yang tidak ditutup parafin, kemudian diinkubasi selama

24 jam pada suhu 370C, dan perlakuan dibandingkan dengan kontrol. Proses

oksidasi terjadi pada bakteri aerob sedangkan proses fermentasi terjadi pada

bakteri anaerob. Hasil positif jika terjadi perubahan warna dari hijau menjadi

kuning pada tabung 1, dan tidak berubah warna pada tabung 2 yang menunjukkan

bakteri uji bersifat anaerob. S. mutans melakukan metabolisme secara fermentasi

dan bersifat fakultatif anaerob (uji O-F positif) berdasarkan buku panduan

determinasi bakteri (Holt, dkk., 2000).

d. Uji Methyl Red (MR). Isolat murni bakteri uji diinokulasikan dalam

tabung berisi media MR-VP, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C.

Setelah masa inkubasi, ditambahkan beberapa tetes reagen metil merah. Larutan

dikocok dengan hati-hati. Perubahan warna dibaca setelah 30 menit. Hasil positif

jika terjadi perubahan warna menjadi merah setelah 30 menit penambahan reagen.


33

Berdasarkan buku panduan determinasi bakteri (Holt, dkk., 2000), S. mutans

membentuk asam dari proses fermentasi karbohidrat (uji MR positif).

e. Uji Voges Proskauer (VP). Isolat murni bakteri uji diinokulasikan dalam

tabung berisi media MR-VP, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C.

Setelah masa inkubasi, ditambahkan 0,6 mL larutan alpha-naphtol 5% dilanjutkan

0,2 mL KOH 40%. Larutan dikocok dengan hati-hati, dilonggarkan tutupnya, dan

dikocok kembali, diulangi setiap 5 menit. Perubahan warna dibaca setelah 30

menit. Hasil positif jika terjadi perubahan warna menjadi merah setelah 30 menit

penambahan reagen. Berdasarkan buku panduan determinasi bakteri (Holt, dkk.,

2000), S. mutans membentuk asam dari proses fermentasi karbohidrat (uji VP

positif).

f. Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA). Isolat murni bakteri diinokulasikan

dalam tabung berisi media TSIA secara tusukan menggunakan jarum inokulasi

dan streak menggunakan jarum ose. Perubahan warna media TSIA dari merah-

orange menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi gula, dan pembentukan

H2S dibandingkan dengan kontrol. Berdasarkan buku panduan determinasi bakteri

(Holt, dkk., 2000), S. mutans membentuk asam dari proses fermentasi karbohidrat

(uji TSIA positif).

6. Uji potensi antibakteri ekstrak etanol teh hijau terhadap S.mutans dengan metode difusi paper disc a. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak etanol teh hijau. Dibuat delapan

variasi konsentrasi teh hijau, yaitu 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2,5; 5; 7,5; dan 10 mg/mL.

Konsentrasi ini berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Pratikno (2003)

dengan beberapa modifikasi variasi, sesuai tabel I:


34

Tabel I. Pengenceran ekstrak etanol teh hijau

b. Pembuatan media Nutrient Agar. Sebanyak 3 g medium Agar dan 2 g NB

dilarutkan dengan 125 mL aquadest steril dalam erlenmeyer. Larutan dipanaskan

dan diaduk di atas penangas magnetik hingga terlarut sempurna yang ditandai

dengan warna larutan menjadi jernih. Selanjutnya diautoklaf pada suhu 121°C

selama 15 menit.

c. Pembuatan media Nutrient Broth. Sebanyak 8 g media NB dilarutkan

dengan 1000 mL aquadest steril dalam erlenmeyer sambil diaduk dan dipanaskan

di atas penangas magnetik. Setelah seluruh NB melarut, masukkan media NB ke

dalam tabung reaksi untuk diautoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.

d. Pembuatan suspensi bakteri uji. Satu ose kultur murni S. mutans diambil

dan dimasukkan ke dalam media cair NB kemudian diinkubasi selama 24 jam

pada suhu 370C. Kekeruhan media NB dibandingkan dengan cairan standar Mc.

Farland II (6.108 CFU/mL). Apabila hasil dari kultur dalam NB tidak sama, maka

dapat ditambahkan NB steril hingga kekeruhannya setara dengan cairan standar

Mc. Farland II (6.108 CFU/mL). Apabila hasilnya sudah setara dengan cairan

No. Konsentrasi (mg/mL)

Ekstrak Daun Teh Hijau 10 mg/mL (mL)

Aquadest steril (mL)

Volume Akhir (mL)

1 0,25 0,35 13,65 14 2 0,50 0,70 13,30 14 3 0,75 1,05 12,95 14 4 1,00 1,40 12,60 14 5 2,50 3,50 8,500 14 6 5,00 7,00 7,000 14 7 7,50 10,5 3,500 14 8 10,00 14 0 14


35

standar Mc. Farland II (6.108 CFU/mL), maka dapat diperkirakan terdapat sel

bakteri sebanyak 6 x 108 CFU/mL.

e. Uji potensi ekstrak etanol teh hijau terhadap S.mutans secara difusi paper

disc.

1) Kontrol kontaminasi media

Diambil tabung reaksi yang berisi 20 mL media NA dengan suhu 40-

500C dan dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat. Setelah memadat,

inkubasi media secara terbalik pada suhu 37°C selama 24 jam. Amati ada

tidaknya pertumbuhan mikroorganisme pada media.

2) Kontrol pertumbuhan bakteri uji

Diambil tabung reaksi yang berisi 20 mL media NA, dibiarkan agak

dingin (40-500C). Inokulasikan 1 mL suspensi bakteri S. mutans lalu divortex,

dimasukkan dalam cawan petri, dan dibiarkan memadat. Inkubasikan secara

terbalik selama 24 jam dan pada suhu 37°C. Amati pertumbuhan bakteri uji S.

mutans secara normal pada media NA.

3) Kontrol positif

Diambil 0,4 mL EGCG murni 10mg/mL dan dimasukkan ke dalam

flakon. Encerkan dengan menggunakan aquadest steril dan buat menjadi beberapa

variasi konsentrasi, yaitu 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 2,5; 5,0; 7,5 dan 10 mg/mL dan

masukkan dalam flakon. Autoklaf selama 1 jam dengan suhu 80°C.

4) Uji potensi

Sebanyak 1 mL suspensi bakteri uji diinokulasikan ke dalam 15-20

mL media NA yang masih hangat, kemudian dituang ke dalam cawan petri dan


36

dibiarkan memadat. Setelah media memadat, diletakkan lima buah disc blank

dalam media cawan. Satu disc blank diisikan kontrol negatif, yaitu aquadest steril

dan empat disc blank, yang diletakkan pada empat kuadran berbeda, diisikan

variasi ekstrak (0,25 ; 0,5 ; 0,75 ; 1 ; 2,5 ; 5 ; 7,5 ; dan 10 mg/mL) masing-masing

sebanyak 25 µL. Kemudian diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 370C. Dibuat

replikasi sebanyak enam replikasi untuk mendapatkan data analisis statistik yang

valid.

7. Uji penentuan nilai KHM dan KBM ekstrak etanol teh hijau terhadap S.mutans dengan metode dilusi cair a. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak etanol. Dari hasil orientasi, dibuat

variasi konsentrasi teh hijau di mana pada konsentrasi tersebut memunculkan zona

hambat yang dilihat dari hasil uji potensi antibakteri. Dibuat 14 variasi konsentrasi

ekstrak etanol teh hijau (0,1; 0,2; 0,25; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,75; 0,8; 0,9; 1,0; 2;

2,5 mg/mL) dengan penurunan variasi konsentrasi sampai konsentrasi sekecil

mungkin yang menunjukkan potensi antibakteri dari uji difusi paper disc pada

tahap 6 yang selanjutnya menjadi acuan untuk memperoleh nilai KHM dan KBM.

b. Uji penentuan nilai KHM-KBM ekstrak etanol teh hijau terhadap

S.mutans dengan metode dilusi cair. Kontrol positif dibuat untuk 14 variasi

konsentrasi teh hijau. Ke dalam 15 mL media NB dimasukkan 1 mL ekstrak

etanol teh hijau dengan variasi konsentrasi 0,1; 0,2; 0,25; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7;

0,75; 0,8; 0,9; 1,0; 2; 2,5 mg/mL. Dilakukan pengukuran OD pada masing-masing

variasi konsentrasi teh hijau di jam ke-0. Pembuatan kontrol positif ini dilakukan

ketika akan dilakukan pengukuran absorbansi perlakuan.


37

Dibuat 14 media NB pada tabung reaksi masing-masing 15 mL. Ke

dalam 15 mL media NB diinokulasikan 1 mL suspensi bakteri uji yang setara

dengan Mac. Farland II (6.108 CFU/mL), kemudian dimasukkan 1 ml ekstrak teh

hijau dengan variasi konsentrasi 0,1; 0,2; 0,25; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,75; 0,8;

0,9; 1,0; 2; 2,5 mg/mL yang telah dibuat sebelumnya. Tabung divortex dan

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C.

c. Penegasan hasil untuk penentuan nilai KHM dan KBM. Setelah inkubasi,

hasil pertumbuhan bakteri diamati dan dicatat, kemudian dibandingkan dengan

kontrol negatif. Nilai kuantitatif jumlah bakteri hidup dalam media NB diukur

berdasarkan kekeruhan yang menunjukkan OD dengan melihat nilai

absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer Visible pada panjang

gelombang 600 nm dan dibandingkan dengan kontrol negatif (Ainiyah, 2006;

Lasmayanty, 2007). Hasil pengukuran absorbansi pada tabung dengan nilai OD

sama dengan nol dilakukan uji penegasan hasil dengan inokulasi pada media NA

secara streak plate, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi,

bila pada media tidak terdapat pertumbuhan bakteri sama sekali, maka konsentrasi

ekstrak teh hijau tersebut dinyatakan sebagai KBM. Namun, jika masih terdapat

pertumbuhan bakteri, maka konsentrasi ekstrak teh hijau tersebut dinyatakan

sebagai KHM.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data yang didapat berupa diameter zona hambat, dianalisis secara

statistik dengan menggunakan uji Kruskal Wallis untuk mengetahui perbedaan

bermakna antara berbagai konsentrasi ekstrak etanol teh hijau dan kontrol negatif


38

(aquadest steril). Jika pada uji Kruskal Wallis menghasilkan nilai p < 0,05, maka

dapat dilanjutkan dengan melakukan analisis Post Hoc.

Data berupa nilai KHM dan KBM dianalisis secara deskriptif. Nilai

KHM dan KBM didapatkan dengan metode dilusi cair dengan mengukur

kekeruhan yang menunjukkan nilai optical density (OD) dengan melihat

absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer visible. Nilai KHM didapatkan

pada konsentrasi ekstrak etanol dengan OD = 0 yang masih menunjukkan adanya

pertumbuhan bakteri pada uji penegasan. Sedangkan nilai KBM didapatkan pada

konsentrasi ekstrak etanol dengan OD = 0 yang tidak menunjukkan adanya

pertumbuhan bakteri pada uji penegasan.


39

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Identifikasi Daun Teh

Daun teh yang digunakan merupakan daun teh yang diolah tanpa proses

fermentasi dan diambil dari Perkebunan Teh Rumpun Sari Medini, Boja pada

ketinggian 1500 meter (ketinggian optimum 1200-2000 m), karena menurut

Suseno (1977), semakin tinggi letak suatu tempat memiliki suhu yang semakin

rendah dan menghasilkan kandungan senyawa dalam teh yang lebih baik dari sisi

kualitas dan kuantitas dibandingkan teh yang ditanam di dataran rendah maupun

sedang.

Identifikasi tanaman bertujuan untuk memastikan bahwa daun teh yang

digunakan benar-benar berasal dari tanaman teh (Camelia sinensis L.), sesuai

dengan surat keterangan identifikasi teh hijau yang dikeluarkan oleh PT Rumpun

Sari Medini (Lampiran 1) bahwa bahan penelitian yang digunakan dalam

penelitian ini merupakan daun teh hijau yang dibuat dari tanaman teh (Camelia

sinensis L.).

B. Pembuatan Serbuk Teh Hijau

Teh hijau kering yang didapat dari PT Rumpun Sari Medini, Boja

diserbuk oleh Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas

Gadjah Mada dengan menggunakan mesin penyerbuk dengan saringan

berdiameter 1 mm sesuai prosedur kerja dari LPPT UGM (Lampiran 3).

Penyerbukan dilakukan untuk meningkatkan luas total permukaan sehingga hasil


40

ekstraksi yang diperoleh lebih banyak karena semakin banyak pelarut yang dapat

kontak langsung dengan serbuk.

C. Pembuatan Ekstrak Etanol Teh Hijau

Penelitian dilanjutkan dengan pembuatan ekstrak etanol teh hijau.

Pembuatan ekstrak etanol teh hijau dilakukan di Laboratorium Penelitian dan

Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada dengan metode maserasi

sesuai prosedur kerja dari LPPT UGM (Lampiran 3). Ekstraksi merupakan

penyarian zat-zat aktif dari simplisia yang bertujuan untuk menarik komponen

kimia yang terkandung di dalamnya. Terdapat berbagai metode ekstraksi salah

satunya adalah metode ekstraksi maserasi.

Proses filtrasi ekstrak etanol daun teh hijau dilakukan menggunakan alat

vaccum rotary evaporator. Prinsip kerja alat ini adalah pemisahan pelarut dari

sampel dengan menggunakan panas dalam bejana berputar pada tekanan rendah.

Pelarut yang digunakan adalah etanol karena etanol lebih selektif; kapang, khamir

dan bakteri lebih sulit tumbuh dalam etanol 20% keatas; dapat bercampur dengan

air pada segala perbandingan; pengeringan dalam waktu singkat. Etanol dapat

melarutkan alkaloid, glikosida, flavonoid, damar, klorofil, lemak, tanin dan

saponin (DepKes RI, 1986). Dari proses ekstraksi dengan menggunakan 400 g

serbuk teh hijau dan 3000 mL etanol didapatkan hasil ekstrak sebesar 112,070 g

dengan kadar kandungan EGCG dalam ekstrak tersebut adalah sebesar 1,28 %

atau 12,80 mg/mL (Lampiran 4).


41

D. Verifikasi Kualitatif-Kuantitatif Kandungan Senyawa Epigallocatechin Gallate (EGCG) dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan

Densitometri

Verifikasi kualitatif-kuantitatif kandungan senyawa EGCG dilakukan

oleh Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah

Mada. Identifikasi kualitatif EGCG dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis

(KLT) sesuai prosedur kerja dari LPPT UGM Yogyakarta. Prinsip KLT adalah

pemisahan senyawa campuran berdasarkan perbedaan polaritas antara fase diam

dan fase gerak. Volume penotolan sampel yang ditotolkan adalah 10 µL

sedangkan standar adalah sebesar 4 µL. Sampel ditotolkan lebih banyak karena

kadar EGCG dalam ekstrak tersebut belum diketahui dan dikhawatirkan jumlah

EGCG dalam ekstrak terlalu sedikit maka digunakan volume penotolan yang lebih

banyak daripada standar. Hasil perambatan yang didapatkan diidentifikasi

kualitatif dengan menggunakan sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm.

Jika dilihat secara visual bercak tidak menunjukkan warna apapun. Namun ketika

dideteksi kualitatif pada sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm, didapatkan

warna sampel dan standar adalah warna redam/ gelap. Dari hasil pengamatan,

didapatkan Rf sampel yang setara dengan standar, yaitu 0,60.

Identifikasi kuantitatif EGCG dilakukan dengan menggunakan KLT

Densitometri. Prinsip KLT Densitometri adalah pengukuran kadar senyawa

berdasarkan kepekatan atau dense dengan melihat luas area di bawah kurva dari

kurva densitometri yang didapatkan dari alat KLT Densitometri. Standar EGCG

diencerkan menjadi beberapa konsentrasi (Tabel II):


42

Tabel II. Pengenceran standar EGCG

Konsentrasi Standar EGCG (µg)

Volume Stok Standar EGCG (µL)

Volume Pelarut (µL)

0,5 125 875 1,0 250 750 2,0 500 500 µg 1000 0

Masing-masing konsentrasi standar EGCG tersebut kemudian dihitung

luas area di bawah kurva / Area Under Curve (AUC) untuk mendapatkan hasil

regresi linearnya. Profil kromatogram (Lampiran 6) yang terbentuk kemudian

dihitung regresinya (Lampiran 5). Regresi yang telah didapatkan digunakan untuk

menghitung kadar EGCG dalam sampel dengan melihat AUC sampel (Tabel III):

Tabel III. Kadar epigallo catechine-3-gallate

Sampel Konsentrasi

sampel (µg/mL)

Jumlah penotolan

sampel (µg)AUC

EGCG dalam

sampel (µg)

Kadar EGCG

(%) Ekstrak 11,18 111,8 73309.8 1,43153 1,28

E. Uji Kemurnian dan Identifikasi Bakteri Uji

Uji kemurnian dan identifikasi bakteri uji bertujuan untuk memastikan

bahwa kultur bakteri yang digunakan merupakan kultur murni S.mutans dan

bukan kultur campuran sehingga dapat meminimalkan variabel pengacau dan

meningkatkan validitas hasil zona hambat yang didapatkan. Uji kemurnian

dilakukan dengan mereisolasi kultur bakteri uji ke dalam media cawan NA

dengan metode streak plate beberapa kali untuk mendapatkan koloni terpisah.

Koloni terpisah tersebut selanjutnya diuji identifikasi. Menurut Holt, dkk. (2000),

uji identifikasi ini dilakukan dengan menggunakan beberapa metode pengujian,


43

yaitu pengecatan Gram, uji katalase, uji oksidasi-fermentasi (OF), uji Methyl Red

(MR), uji Voges-Proskaeur (VP), dan uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA).

Sebelum dilakukan pengecatan, bakteri dioleskan dahulu pada gelas

obyek lalu ditetesi aquadest dan difiksasi dengan melewatkan gelas obyek tersebut

di atas bunsen hingga bakteri kering. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri

tanpa mengubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas gelas

benda, mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel, membuat sel bakteri

menjadi kaku sehingga ketika diamati dengan mikroskop bakteri dapat terlihat

dengan mudah. Pengecatan Gram bertujuan untuk memberi kekontrasan warna

pada sel sehingga dapat mengetahui jenis Gram bakteri uji. Pengecatan ini

merupakan pengecatan positif karena dilakukan dengan mewarnai bakteri dengan

berbagai cat. Zat warna atau cat yang digunakan adalah Gram A (Kristal violet),

Gram B (Larutan iodium), Gram C (Alkohol 96%), dan Gram D (Safranin).

Kristal violet merupakan zat pewarna utama yang akan memberikan warna ungu

pada sel bakteri Gram positif. Larutan iodium berfungsi sebagai zat pewarna

sekunder yang akan memperkuat zat warna utama. Alkohol 96% berfungsi

sebagai zat peluntur dinding sel bakteri. Safranin berfungsi sebagai zat lawan

yang akan mewarnai dinding sel bakteri Gram negatif dengan warna merah.

Bakteri Gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang jauh lebih

tebal daripada dinding sel bakteri Gram negatif. Penambahan kristal violet dan

iodium akan menyebabkan terbentuknya kompleks kristal violet iodium

ribonukleat berwarna ungu yang berikatan kuat pada peptidoglikan. Ketika

ditambahkan zat peluntur (alkohol 96%) bakteri akan mengalami dehidrasi yang


44

menyebabkan pori-pori mengkerut sehingga mempertahankan warna ungu,

sedangkan lapisan peptidoglikan pada dinding sel bakteri Gram negatif sangat

tipis sehingga ketika ditambahkan alkohol 96% peptidoglikan akan tereksitasi

yang menyebabkan pori-pori melebar sehingga warna ungu memudar. Pengecatan

Gram memiliki beberapa kelemahan, antara lain terbacanya bakteri Gram positif

sebagai Gram negatif yang disebabkan karena adanya kerusakan pada dinding sel

oleh fiksasi, pemberian pewarna dan pencucian alkohol yang berlebihan.

Hasil pengecatan Gram menunjukkan bahwa bakteri uji merupakan

bakteri Gram positif (berwarna ungu), berbentuk bulat oval memanjang, berkoloni

membentuk rantai, dan tidak berspora (Lampiran 8a). Hasil ini sesuai dengan

karakteristik S.mutans yang ada dalam buku panduan determinasi bakteri (Holt,

dkk., 2000), sehingga dapat diambil kesimpulan sementara bahwa bakteri uji yang

digunakan merupakan kultur murni S.mutans. Namun tetap diperlukan uji lanjutan

untuk dapat menegaskan kesimpulan sementara tersebut.

Uji katalase bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri uji dalam

menghasilkan enzim katalase yang mengkatalisis peruraian hidrogen peroksida

menjadi O2 dan air. Hidrogen peroksida merupakan senyawa toksik yang dapat

menginaktifkan enzim esensial di dalam sel sehingga keberadaannya dalam sel

bakteri perlu diuraikan menjadi senyawa tidak berbahaya, yaitu air dan O2.

Biasanya bakteri yang bersifat aerob dapat menghasilkan enzim katalase untuk

menguraikan hidrogen peroksida yang ditandai dengan terbentuknya buih atau

gelembung udara, sedangkan bakteri anaerob obligat tidak menghasilkan enzim


45

katalase sehingga tidak terbentuk gelembung. Hasil yang didapatkan adalah

negatif, sesuai dengan buku panduan determinasi bakteri (Holt, dkk., 2000).

Uji O-F bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

memetabolisme karbohidrat secara oksidatif-fermentatif. Media yang digunakan

adalah media O-F yang ditambah 1% dekstrosa. Pada uji O-F ini digunakan 2

tabung reaksi media O-F yang ditutup dan tidak ditutup parafin. Tujuan penutupan

dengan parafin adalah supaya tidak terjadi kontak dengan udara luar dan

menciptakan suasana anaerob dalam tabung. Secara teoritis bakteri yang bersifat

aerob akan mengubah warna media O-F pada tabung reaksi yang tidak ditutup

parafin dari hijau menjadi kuning tetapi tidak mengubah warna media O-F pada

tabung reaksi yang ditutup parafin. Sedangkan bakteri anaerob ataupun anaerob

fakultatif akan mengubah warna kedua media O-F baik yang ditutup atau tidak

ditutup parafin dari hijau menjadi kuning. Perubahan media menjadi kuning

disebabkan karena terbentuknya asam piruvat dari hasil metabolisme karbohidrat

bakteri. Hasil yang didapatkan adalah pada kedua tabung media O-F terjadi

perubahan warna dari hijau menjadi kuning. Hal tersebut membuktikan bahwa

bakteri uji yang digunakan merupakan bakteri anaerob atau fakultatif anaerob,

sesuai dengan karakteristik S.mutans dalam buku manual determinasi bakteri

(Holt, dkk., 2000).

Uji methyl red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi

campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan

berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media

tumbuh. Penambahan indikator methyl red dapat menunjukkan perubahan pH


46

media menjadi asam karena indikator methyl red akan berwarna merah pada

lingkungan dengan pH 4,4 dan berwarna kuning pada lingkungan dengan pH 6,2.

Hasil yang didapatkan adalah terjadi perubahan warna media MR dari kuning

menjadi merah. Hal ini membuktikan bahwa bakteri uji melakukan fermentasi dan

menghasilkan produk asam.

Uji VP digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang

melakukan fermentasi karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol. Penambahan 40%

KOH dan 5% alfa naftol dapat menentukan adanya asetoin, suatu senyawa

pemuka dalam sintesis 2,3-butanadiol. Jika dibandingkan kontrol yang berwarna

hijau kehitaman, hasil perlakuan yang berwarna merah oranye menunjukkan

bahwa bakteri uji memfermentasikan glukosa dan menghasilkan produk asam.

Berdasarkan hasil berbagai uji identifikasi di atas dan dicocokkan dengan buku

panduan determinasi bakteri (Holt, dkk., 2000) dapat disimpulkan bahwa bakteri

uji yang digunakan benar merupakan S. mutans.

F. Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Teh Hijau terhadap S.mutans dengan Metode Difusi Paper Disc

1. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak etanol teh hijau

Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak etanol teh hijau dilakukan oleh

LPPT UGM Yogyakarta sesuai prosedur dari LPPT UGM Yogyakarta. Dari hasil

uji KLT Densitometri didapatkan kadar EGCG dalam ekstrak daun teh hijau

sebanyak 1,28% atau 12,80 mg/mL. Dari konsentrasi tersebut dilakukan

pengenceran untuk membuat kadar EGCG 10 mg/mL dengan mengambil 50 g

ekstrak daun teh hijau kemudian ditambahkan aquadest steril hingga volume 64


47

mL. Berdasarkan penelitian sebelumnya (Pratikno, 2003) dibuat pengenceran

berbagai variasi konsentrasi ekstrak etanol teh hijau, yaitu 0,25; 0,5; 0,75; 1,0;

2,5; 5,0; 7,5; dan 10,0 mg/mL (Tabel IV).

Tabel IV. Pengenceran ekstrak etanol teh hijau

Pengenceran perlu dilakukan untuk mengetahui konsentrasi berapa dari

ekstrak etanol teh hijau yang berpotensi menghambat dan membunuh bakteri

S.mutans penyebab karies gigi, sehingga dapat diketahui dosis terapi yang efektif

dari ekstrak etanol teh hijau untuk dikembangkan menjadi berbagai bentuk

sediaan farmasi baru yang dapat digunakan dengan mudah oleh masyarakat.

2. Pembuatan media Nutrient Agar

Media Nutrient Agar (NA) digunakan untuk pengujian potensi

antibakteri ekstrak etanol teh hijau dengan metode difusi paper disc. Media agar

adalah ekstrak dari rumput laut, tersusun dari kompleks karbohidrat yang

kebanyakan adalah galaktosa. Media ini sangat umum digunakan untuk

menumbuhkan bakteri dan sesuai untuk pertumbuhan S.mutans. Media NA berisi

5 g NaCl, 5 g pepton, 2 g ekstrak ragi, 1 g serbuk Lab Lemco, dan 15 g agar. Pada

No. Konsentrasi (mg/mL)

Ekstrak Daun Teh Hijau 10 mg/mL

(mL)

Aquadest steril (mL)

Volume Akhir (mL)

1 0,25 0,350 13,650 14 2 0,50 0,700 13,300 14 3 0,75 1,050 12,950 14 4 1,00 1,400 12,600 14 5 2,50 3,500 8,500 14 6 5,00 7,000 7,000 14 7 7,50 10,500 3,500 14 8 10,00 14,000 0,000 14


48

proses pembuatannya terjadi perubahan media menjadi coklat bening kekuningan

yang menandakan bahwa media telah homogen atau tercampur sempurna dalam

pelarutnya. Sterilisasi dengan menggunakan autoklaf dilakukan selama 15 menit

pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm. Prinsip kerja autoklaf adalah sterilisasi

menggunakan panas uap bertekanan. Adanya tekanan akan membantu uap panas

untuk penetrasi ke dalam sel mikroba sehingga dinding sel mikroba akan lisis

akibat panas tinggi dari uap tersebut. Suhu 121°C dan waktu 15 menit yang

digunakan adalah berdasarkan standar sterilisasi autoklaf. Suhu 121°C dan waktu

15 menit diharapkan sudah cukup untuk membunuh mikroba kontaminan yang

mungkin mengkontaminasi media selama proses penyimpanan maupun

pembuatan media. Dari 16 tabung yang masing-masing berisi 15 mL media, 12

tabung akan digunakan sebagai perlakuan 8 konsentrasi variasi ekstrak etanol teh

hijau dengan replikasi sebanyak 6 kali, 2 tabung sebagai kontrol EGCG, 1 tabung

sebagai kontrol media dan 1 tabung sebagai kontrol pertumbuhan.

3. Pembuatan media Nutrient Broth

Media Nutient Broth (NB) dalam penelitian ini digunakan dalam uji

penentuan nilai KHM dan KBM dengan metode dilusi cair. Pembuatan media NB

dengan cara melarutkan 8 g NB ke dalam 1000mL pelarut aquadest steril sesuai

dengan keterangan pembuatan yang tertera pada kemasan media NB dari pabrik

produsen media tersebut. Media dimasukkan dalam labu erlenmeyer dan

dipanaskan di atas penangas magnetik sambil diaduk dengan magnetik stirer

hingga media menjadi jernih. Warna media yang dihasilkan adalah coklat bening

kekuningan. Media NB memiliki viskositas yang lebih rendah dari pada NA dan


49

lebih mudah larut homogen ketika dipanaskan dan diaduk. Selanjutnya larutan

media yang sudah homogen dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan disterilisasi

menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm.

4. Pembuatan suspensi bakteri uji

Sebelum dilakukan uji potensi, bakteri uji S.mutans perlu ditumbuhkan

pada media Nutrient Broth (NB) yang kemudian disetarakan dengan larutan Mac.

Farland II. Larutan Mac. Farland II merupakan larutan pembanding yang berisi

0,2 mL Barium Klorida dan 9,8 mL H2S. Kekeruhan larutan standar Mac. Farland

II setara dengan 6.108 CFU/mL jumlah bakteri (Bresson and Borges, 2004).

Tujuan penyetaraan adalah supaya jumlah bakteri yang digunakan dapat dikontrol

(6.108 CFU/mL ) sehingga meminimalkan terjadinya bias.

5. Uji potensi ekstrak etanol teh hijau terhadap S.mutans secara difusi paper disc

a. Kontrol kontaminasi media. Kontrol kontaminasi media berfungsi

sebagai media pembanding bagi media perlakuan dan untuk mengetahui apakah

perlakuan sudah dilakukan secara steril atau belum. Pada kontrol ini media NA

cair (suhu >40°C) dituang ke dalam cawan petri dan setelah memadat media

langsung diinkubasi terbalik. Inkubasi dalam inkubator dilakukan secara terbalik

untuk mencegah menetesnya uap air dari media NA yang dituang ke dalam cawan

petri. Adanya air pada media NA dapat memicu tumbuhnya mikroba kontaminan

seperti kapang dan khamir pada media. Kontrol kontaminasi media harus bersih

dari bakteri. Jika setelah inkubasi media tertumbuhi bakteri, maka penelitian harus

diulang karena hal ini menandakan bahwa perlakuan tidak steril. Hasil perlakuan


50

terhadap kontrol media ini menandakan bahwa perlakuan dilakukan secara steril,

dilihat dari bersihnya media.

b. Kontrol pertumbuhan bakteri uji. Kontrol pertumbuhan bakteri uji

berfungsi untuk mengetahui pertumbuhan normal bakteri uji tanpa adanya

perlakuan dari ekstrak etanol teh hijau. Proses inokulasi suspensi bakteri S.mutans

dalam media NA dilakukan secara pour plate sebelum media NA memadat (±

40°C) untuk menghasilkan pertumbuhan bakteri yang merata pada seluruh bagian

media. Inkubasi dilakukan dalam inkubator yang diatur suhunya yaitu 37°C

selama 24 jam sesuai dengan waktu dan suhu tumbuh optimal S.mutans. Inkubasi

dilakukan terbalik supaya uap air yang terbentuk dari hasil respirasi bakteri

maupun dari kondensasi uap panas media NA tidak menetes ke atas media karena

dapat menyebabkan pola pertumbuhan bakteri S.mutans terganggu atau terjadi

spreader dan dapat juga memicu tumbuhnya mikroba lain seperti kapang dan

khamir. Pertumbuhan bakteri yang dihasilkan pada penelitian adalah bakteri

tumbuh secara merata pada seluruh bagian media baik di bagian permukaan,

tengah maupun bagian dasar media.

c. Kontrol positif. Kontrol positif berfungsi sebagai pembanding bagi

perlakuan. Berbagai konsentrasi kontrol positif ini dibuat dari pengenceran EGCG

murni 10 mg/mL dengan pengenceran menggunakan pelarut aquadest steril.

Setelah seluruh variasi konsentrasi tersedia, EGCG disterilisasi dengan autoklaf

selama 1 jam pada suhu 80°C. Pemanasan tidak boleh mencapai 100°C karena

dapat merusak EGCG.


51

d. Uji potensi. Uji potensi ekstrak etanol teh hijau bertujuan untuk

mengetahui kemampuan ekstrak etanol teh hijau dalam menghambat dan atau

membunuh bakteri S.mutans. Uji potensi ini dilakukan menggunakan metode

difusi paper disc dengan melihat zona jernih disekitar paper disc yang telah diberi

ekstrak etanol teh hijau dalam media NA yang telah diinokulasi bakteri S.mutans.

Prinsip metode difusi paper disc adalah terdifusinya senyawa uji dari paper disc

ke dalam media tumbuh bakteri ke segala arah. Jumlah bakteri yang

diinokulasikan adalah sejumlah 1 mL yang setara larutan Mac. Farland II. Adanya

penyetaraan dengan larutan Mac. Farland II ini bertujuan supaya jumlah bakteri

dalam 1 mL larutan setara dengan 6.108 CFU. Dengan demikian diharapkan

pertumbuhan bakteri tidak overlaping dan tumbuh secara merata dengan adanya

koloni terpisah. Volume 25 µl yang ditambahkan dalam paper disc didapatkan

dari hasil orientasi sebelumnya. Variasi konsentrasi ekstrak yang digunakan

adalah 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 2,5; 5,0; 7,5; dan 10 mg/mL. Delapan variasi

konsentrasi tersebut didapatkan dari modifikasi variasi konsentrasi pada penelitian

sebelumnya (Pratikno, 2003) dan dibuat replikasi sebanyak 6 kali untuk

mendapatkan hasil analisis statistik yang valid. Kontrol positif yaitu

Epigallocathecin galate (EGCG) juga dibuat variasi konsentrasi 8 konsentrasi

sesuai dengan variasi konsentrasi perlakuan dan seharusnya dibuat 6 replikasi.

Namun karena keterbatasan bahan maka tidak dapat dilakukan replikasi. Kontrol

negatif yang digunakan adalah aquadest. Tujuan digunakan kontrol negatif ini

adalah untuk mengetahui apakah pelarut dari ekstrak etanol teh hijau, yaitu

aquadest, memiliki daya antibakteri atau tidak. Jika pelarut memiliki daya


52

antiibakteri, hal ini dapat membiaskan hasil pengukuran daya antibakteri ekstrak.

Seluruh perlakuan di atas dilakukan di dekat api bunsen dengan radius ± 20 cm

untuk menjaga sterilitas setiap perlakuan. Dalam radius 20 cm tersebut diharapkan

dapat menghindarkan media dari bakteri kontaminan di udara sekitar. Sebelum

diinkubasi, seluruh media NA cawan petri dengan berbagai perlakuan tersebut

dibungkus menggunakan plastik pembungkus. Tujuannya adalah supaya bakteri

dari luar atau dari lingkungan tidak dapat masuk ke dalam cawan petri terutama

pada saat inkubasi dalam inkubator. Dalam inkubator terdapat aliran udara yang

dapat membantu bakteri dari luar cawan masuk ke dalam cawan dan

mengkontaminasi media sehingga hasil yang didapatkan tidak valid.

Setelah inkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37°C, adanya

zona jernih di sekitar paper disc diamati dan diameternya diukur dengan

menggunakan penggaris kemudian dibandingkan dengan kontrol negatif

(Lampiran 9) (Tabel V):

Tabel V. Hasil uji potensi antibakteri ekstrak etanol teh hijau dengan berbagai variasi konsentrasi EGCG dibandingkan dengan kontrol

Konsentrasi Ekstrak Etanol Teh Hijau

(mg/mL)

Diameter Zona Hambat (mm) Replikasi

Rata-rata Diameter Zona Hambat (mm)

Diameter Kontrol

Positif (mm) I II III IV V VI 0,25 6 6 6 6 6 6 6 6 0,50 8 10 10 10 10 10 9,67 6 0,75 8 9 9 9 9 10 9 6 1,00 9 10 13 13 13 12 11,67 6 2,50 16 6 9 11 11 11 10,67 9 5,00 15 15 12 19 20 12 15,5 10 7,50 21 20 19 21 20 21 20,33 15 10,00 21 20 20 22 21 21 20,83 13

Diameter kontrol negatif (mm) 6 6 6 6 6 6 6 -


53

Dari hasil pengukuran diameter zona hambat, perlakuan pada konsentrasi

0,5 hingga 10 mg/mL memberikan zona hambat yang lebih besar daripada kontrol

positif dengan konsentrasi yang sama. Hal ini disebabkan karena dalam ekstrak

etanol teh hijau tidak hanya terdapat EGCG saja yang bersifat antibakteri, tetapi

juga terdapat epikatekin, epikatekin-3-galat dan epigalokatekin. Sedangkan

kontrol positif yang digunakan merupakan EGCG murni. Pada peningkatan

konsentrasi kontrol positif, yaitu konsentrasi 0,25-1,00 mg/mL, tidak terjadi

perbedaan diameter zona hambat bahkan pada kontrol positif konsentrasi 7,5-10,0

mg/mL dan perlakuan konsentrasi 0,5-0,75 mg/mL dan 1,0-2,5 mg/mL terjadi

penurunan diameter zona hambat. Hal ini tidak sesuai dengan teori yang ada yaitu

semakin tinggi konsentrasi, kandungan EGCG akan semakin besar dan diameter

zona hambat yang dihasilkan juga akan semakin besar. Hal ini disebabkan ketika

dilakukan pengenceran kontrol positif, penambahan aquadest berlebih atau

kurangnya jumlah EGCG yang diambil dari stok EGCG murni konsentrasi 10

mg/mL. Sedangkan penurunan diameter zona hambat pada perlakuan konsentrasi

0,5-0,75 mg/mL dan konsentrasi 1,0-2,5 mg/mL dapat disebabkan karena terjadi

endapan ekstrak etanol teh hijau yang tidak dapat dihomogenkan kembali

meskipun telah dilakukan pemanasan sederhana dengan menggunakan bunsen

sebelum dilakukan pengambilan ekstrak. Sehingga konsentrasi ekstrak yang

diambil dapat menjadi lebih tinggi atau lebih rendah dari konsentrasi yang

seharusnya.

Analisis data secara statistik dengan menggunakan uji one-way ANOVA

dilakukan untuk mengetahui perbedaan bermakna antara berbagai konsentrasi


54

ekstrak etanol teh hijau dibandingkan kontrol negatif (aquadest steril). Namun

karena data yang didapatkan tidak terdistribusi normal maka digunakan uji

alternatifnya yaitu uji Kruskal-Wallis. Nilai p pada hasil uji one-way ANOVA

maupun Kruskal-Wallis harus < 0,05 yang berarti bahwa terdapat perbedaan

bermakna antar variasi konsentrasi ekstrak etanol teh hijau dibandingkan kontrol

negatif. Dari hasil uji Kruskal-Wallis didapatkan hasil p = 0,000 (Lampiran 10).

Oleh karena nilai p < 0,05, maka dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan

bermakna antar konsentrasi ekstrak etanol teh hijau.

Untuk mengetahui konsentrasi mana yang mempunyai perbedaan, maka

dilanjutkan dengan analisis Post Hoc. Alat untuk melakukan analisis Post Hoc

untuk uji Kruskal-Wallis adalah dengan uji Mann-Whitney (Dahlan, 2009). Dari

hasil uji Mann-Whitney didapatkan 8 pasang kelompok konsentrasi perlakuan

yang berbeda tidak bermakna, yaitu konsentrasi 0,25 mg/mL dengan kontrol

negatif (aquadest), konsentrasi 0,5 mg/mL dengan 0,75 mg/mL, konsentrasi 0,5

dengan 1,0 mg/mL, konsentrasi 0,5 mg/mL dengan 2,5 mg/mL, konsentrasi 0,75

mg/mL dengan 2,5 mg/mL, konsentrasi 1,0 mg/mL dengan 2,5 mg/mL,

konsentrasi 1,0 mg/mL dengan 5,0 mg/mL, dan konsentrasi 7,5 mg/mL dengan 10

mg/mL. Secara berturut-turut nilai signifikansinya adalah 1,000; 0,080; 0,070;

0,242; 0,132; 0,371; 0,073; dan 0,150.

G. Uji Penentuan Nilai KHM dan KBM Ekstrak Etanol Teh Hijau terhadap S.mutans dengan Metode Dilusi Cair

Kadar Hambat Minimum (KHM) suatu antibiotik adalah konsentrasi

terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan mikroba tertentu. Kadar


55

Bunuh Minimum suatu antibiotik adalah konsentrasi antibiotik terendah yang

dapat membunuh pertumbuhan mikroba tertentu (Radji, 2010). Penentuan nilai

KHM didasarkan pada konsentrasi terendah senyawa antibakteri dengan nilai OD

yang telah mencapai 0 pada pengukuran dengan spektrofotometer dan masih

menunjukkan pertumbuhan bakteri pada uji penegasan secara streak plate. Nilai

KBM didasarkan pada konsentrasi terendah senya wa antibakteri dengan nilai OD

yang telah mencapai 0 pada pengukuran dengan spektrofotometer dan sudah tidak

menunjukkan pertumbuhan bakteri pada uji penegasan secara streak plate

(McKane dan Kandel, 1996). Nilai KHM dan KBM digunakan untuk menentukan

konsentrasi minimal suatu senyawa antimikroba yang masih efektif untuk

mencegah/ membunuh pertumbuhan bakteri patogen, sehingga dapat

dikembangkan menjadi suatu bentuk sediaan farmasi yang dapat digunakan

dengan mudah oleh masyarakat luas dan sebagai upaya menurunkan prevalensi

karies gigi akibat infeksi bakteri terutama S.mutans.

1. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak etanol

Untuk mendapatkan konsentrasi terkecil yang dapat menghambat dan

membunuh S.mutans dibuat beberapa konsentrasi, maka berdasarkan hasil

orientasi pengukuran potensi antibakteri, dibuat variasi konsentrasi yang baru,

yaitu 0,1; 0,2; 0,25; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,75; 0,8; 0,9; 1,0; 2; 2,5 mg/mL.

Berbagai variasi konsentrasi untuk pengujian KHM dan KBM dibuat

menggunakan ekstrak etanol konsentrasi 0,5; 1; dan 5 mg/mL yang kemudian

diencerkan menjadi berbagai konsentrasi tersebut.


56

2. Uji penentuan nilai KHM-KBM ekstrak etanol teh hijau terhadap S.mutans dengan metode dilusi cair Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan media NB sebagai media

tumbuh bakteri S.mutans, dengan menanamkan 1 mL bakteri S.mutans, yang

setara dengan 6.108 CFU, ke dalam tabung reaksi yang berisi 15 mL media NB.

Bakteri diambil dari bagian tengah media tumbuh bakteri. Hal ini dilakukan

karena bakteri S.mutans merupakan bakteri fakultatif anaerob, sehingga area

tumbuh bakteri ini yang paling dominan adalah bagian tengah tabung media.

Kemudian baru ditambahkan ekstrak etanol teh hijau sebanyak 1 mL. Hal ini

dilakukan untuk semua variasi konsentrasi. Dilakukan vortex setiap kali

pencampuran supaya homogen dan bakteri dapat tumbuh merata di seluruh bagian

tabung. Setelah tabung reaksi ditutup rata, tabung dibungkus dengan plastik

pembungkus untuk menjaga agar udara luar tidak masuk ke dalam tabung dan

mengkontaminasi media terutama pada saat penyimpanan. Kemudian dilakukan

inkubasi di dalam inkubator dengan suhu 37 °C selama 24 jam yang merupakan

suhu dan waktu optimal bagi bakteri untuk tumbuh.

3. Penegasan hasil untuk penentuan nilai KHM dan KBM

Setelah waktu inkubasi, dilakukan pengukuran kekeruhan bakteri yang

ditunjukkan oleh Optical Density (OD) yang dilihat dari absorbansi yang tercatat

pada Spektrofotometer Visible pada panjang gelombang 600 nm.

Spektrofotometer dapat mengukur kepekatan sel dalam suspensi dengan OD

(jumlah cahaya yang diabsorpsi dan disebarkan) sebagai satuan hitungan, karena

OD sebanding dengan kepekatan sel dalam suspensi biakan. Kerapatan optik

suatu suspensi tidak langsung menunjukkan jumlah sel dalam suatu populasi,


57

namun menunjukkan jumlah cahaya yang disebarkan oleh populasi tersebut.

Untuk memperoleh jumlah mikroorganisme, maka nilai kerapatan optik harus

disetarakan terlebih dahulu dengan jumlah mikroorganisme (CFU/ml). Untuk

memperoleh nilai ini dilakukan berbagai pengenceran sampel yang digunakan

dalam OD (Lay, 1994).

Perlakuan dibandingkan dengan kontrol positif yang dibuat tanpa

inkubasi atau dibuat pada saat akan dilakukan pengukuran (t=0). Hal ini dilakukan

dengan tujuan supaya dalam kontrol positif tidak tumbuh bakteri dan yang akan

terukur oleh spektrofotometer adalah absorbansi ekstrak dan NB saja. Kontrol

positif merupakan media NB yang diberi berbagai konsentrasi ekstrak etanol yang

disesuaikan variasi konsentrasi baru pada perlakuan, yaitu 0,1; 0,2; 0,25; 0,3; 0,4;

0,5; 0,6; 0,7; 0,75; 0,8; 0,9; 1,0; 2; 2,5 mg/mL. Sedangkan blanko yang digunakan

sebagai auto zero dalam pengukuran absorbansi adalah media NB saja.

Dari hasil penelitian, jika dilihat secara kualitatif, semakin tinggi

konsentrasi teh hijau yang ditambahkan maka warna media menjadi semakin

coklat keruh. Pada beberapa konsentrasi awal warna tabung perlakuan berwarna

putih susu agak bening dan lama kelamaan, bersamaan dengan peningkatan

konsentrasi ekstrak yang ditambahkan, warnanya berubah menjadi kekuningan

dan akhirnya berwarna coklat keruh, yaitu pada konsentrasi 2 dan 2,5 mg/mL

(Tabel VI):


58

Tabel VI. Hasil pengukuran OD dengan spektrofotometer Visible pada λmax 600 nm

No. Konsentrasi Ekstrak

Etanol Teh Hijau

(mg/mL)

Absorbansi Kontrol Positif

Absorbansi Perlakuan

Optical Density

1 0,1 0,101 0,365 0,264 2 0,2 0,190 0,350 0,160 3 0,25 0,234 0,383 0,149 4 0,3 0,233 0,498 0,266 5 0,4 0,332 0,406 0,074 6 0,5 0,5265 0,8515 0,325 7 0,6 0,469 0,6715 0,2025 8 0,7 0,619 0,8045 0,1855 9 0,75 0,803 0,836 0,033 10 0,8 0,9435 0,786 -0,1575 11 0,9 0,8275 0,904 0,0765 12 1,0 1,006 1,114 0,108 13 2,0 2,935 2,160 -0,775 14 2,5 3,000 1,549 -1,451

Dari hasil pengukuran OD didapatkan bahwa ekstrak etanol teh hijau

konsentrasi 2,0 dan 2,5 mg/mL bernilai negatif (≤ 0), maka diperlukan uji

penegasan secara streak plate untuk mengetahui nilai KHM dan KBM.

4. Uji penegasan hasil dengan metode streak plate

Uji penegasan bertujuan untuk menegaskan apakah hasil konsentrasi

yang didapatkan benar-benar merupakan KHM dan KBM dari ekstrak etanol teh

hijau terhadap S.mutans. Uji penegasan ini dilakukan dengan men-streak

konsentrasi campuran ekstrak-bakteri yang memiliki OD sama dengan nol atau

kurang dari nol pada media cawan NA. Uji penegasan dilakukan terhadap

konsentrasi 0,7; 0,75; 0,8; 0,9; 1,0; 2,0 dan 2,5 mg/mL sedangkan yang


59

menunjukkan OD = 0 hanya konsentrasi 2,0 dan 2,5 mg/mL. Hal ini dilakukan

untuk menegaskan bahwa konsentrasi 0,7; 0,75; 0,8; 0,9 dan 1,0 mg/mL bukan

merupakan konsentrasi yang menunjukkan nilai KHM maupun KBM dari ekstrak

etanol teh hijau dalam menghambat/membunuh bakteri S.mutans.

Dari hasil uji penegasan didapatkan bahwa konsentrasi 0,7; 0,75; 0,8;

0,9; 1,0; 2,0; dan 2,5 mg/mL ditumbuhi bakteri pada area streak, sedangkan

kontrol media bersih atau tidak ditumbuhi bakteri (Lampiran 12). Kontrol media

disini berfungsi untuk mengetahui sterilitas media. Kontrol media yang bersih

menunjukkan bahwa proses uji penegasan telah dilakukan secara aseptis. Namun

pada penegasan ke tujuh konsentrasi tersebut tetap ditumbuhi bakteri dengan

konsentrasi 2,0 dan 2,5 mg/mL memiliki OD ≤ 0. Sehingga dapat disimpulkan

bahwa konsentrasi 2,0 mg/mL merupakan nilai KHM dari ekstrak etanol teh hijau

karena merupakan konsentrasi terkecil dengan OD ≤ 0 namun masih

menunjukkan pertumbuhan bakteri pada uji penegasan secara streak plate. Nilai

KBM ekstrak etanol teh hijau dalam penelitian ini belum didapatkan.


60

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Berbagai variasi konsentrasi ekstrak etanol teh hijau dari Perkebunan Teh

Rumpun Sari Medini Boja, Kabupaten Kendal, Jawa Tengah memiliki

perbedaan potensi antibakteri. Semakin besar konsentrasi ekstrak etanol

teh hijau, semakin besar pula potensi antibakteri yang dihasilkan.

2. Kadar Hambat Minimum (KHM) ekstrak etanol teh hijau terhadap

S.mutans yang dihasilkan adalah pada konsentrasi 2,0 mg/mL dan Kadar

Bunuh Minimum (KBM) dalam penelitian ini belum didapatkan.

B. Saran

1. Sebaiknya dilakukan uji sterilitas ekstrak sebelum dilakukan uji potensi

maupun uji penentuan KHM dan KBM.

2. Perlu dilakukan uji penegasan pada ekstrak etanol teh hijau konsentrasi >

2,5 mg/mL untuk mendapatkan nilai KBM.


61

DAFTAR PUSTAKA

Agoes, A., 2010, Tanaman Obat Indonesia, Buku 3, 95-97, Salemba Medika, Jakarta.

Ainiyah, U., 2006, Pola Produksi Enzim Glukosiltransferase oleh Streptococcus mutans yang Diisolasi dari Karies Gigi Manusia, Skripsi, Universitas Airlangga, Surabaya.

Alschuler, L., 1998, Green Tea: Healing Tonic, Am. J. Natur. Med., (5): 28-31.

Arisandi, Y., dan Andriani, Y., 2006, Khasiat Berbagai Tanaman Untuk Pengobatan, 458-459, Eska Media, Jakarta.

Atlas, M. R., 1997, Principles of Microbiology, 2nd Ed., 68-69, 138, 171-172, 681, 1218, Wm. C. Brown Publishers, USA.

Cappuccino, G. J. and Sherman, N., 2008, Microbiology a Laboratory Manual, 8th Ed., 431, Pearson Education Incorporation, USA.

Dahlan, M.S., 2009, Statistik Untuk Kedokteran dan Kesehatan, 83-95, Penerbit Salemba Medika, Jakarta.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986, Sediaan Galenik, 6-7, 10-11, 16-17, Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta.

Edber, S.C., 1986, Antibiotik dan Infeksi, 15-20, Penerbit EGC, Jakarta.

Forssten, S.D., Bjorklund, M., dan Ouwehand, A.C., 2010, Streptococcus mutans, Caries and Simulation Models, Nutrients, 2, 290-298.

Hartoyo, A., 2003, Teh dan Khasiatnya Bagi Kesehatan: Sebuah Tinjauan Ilmiah, 11-15, Kanisius, Yogyakarta.

Holt, G. J., Krieg, R. N, Sneath, A. H. P, Staley, T. J, dan Williams, T. S., 2000, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th Ed., 532, 554, Lippincott Williams & Wilkins USA.

Indrawati, I., 2009, Potensi Ekstrak Air, Ekstrak Etanol dan Minyak Atsiri Bawang Merah (Allium cepa L.) Kultivar Batu Terhadap Isolat Bakteri Asal Karies Gigi, Jurnal Biotika, 7(1), 40-48.

Irhamsyah, 2003, Mikroorganisme Dihubungkan dengan Pembentukan Karies, Skripsi, 1-2, Universitas Sumatra Utara, Medan.

Islam, B., Khan, S.N., dan Khan, A.U., 2007, Dental Caries: From Infection to Prevention, Med. Sci. Monit., 13(11), RA196-203.

Jawetz, Melnick, J.L., dan Adelberg, E.A., 1991, Medical Microbiology, 154-155, Appleton dan Lange, California.


62

Jawetz, Melnick, J.L., dan Adelberg, E.A., 2007, Mikrobiologi Kedokteran, 23, 170, Penerbit EGC, Jakarta.

Lasmayanty, M., 2007, Potensi Antibakteri Propolis Lebah Madu Trigona spp. terhadap Bakteri Kariogenik (Streptococcus mutans), Skripsi, 1-32, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Lay, W.B, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, 64, PT. Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Lucida, H., Bakhtiar, A., dan Putri, W.A., 2007, Formulasi Sediaan Antiseptik Mulut dari Katekin Gambir, J. Sains Tek. Far., 12 (1), 1-7.

Matsunaga, T., Nakahara, A., Minnatul, K.M., Noiri, Y., Ebisu, S., Kato, A., dkk., 2010, The Inhibitory Effects of Catechins on Biofilm Formation by the Periodontopathogenic Bacterium, Eikenella corrodens, Biosci., Biotechnol., Biochem., 74 (12), 2445-2450.

McKane, L., dan Kandel, J., 1996, Microbiology: Essentials and Applications, 397-398, McGraw Hill Inc, New York.

Nasution, R.S., 2006, Imunologi Karies Gigi, Skripsi, 9, Universitas Sumatra Utara, Medan.

Paribasa, A.W., 2007, Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Dandang Gendis [Clinacanthus mutans (Burm.f) Lindau] Terhadap Escherichia coli, Skripsi, 8-9, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Parwata I.M.O.A., dan Dewi P.F.S., 2008, Isolasi dan Uji Aktifitas Antibakteri Minyak Atsiri dari Rimpang Lengkuas (Alpinia galanga L.), Jurnal Kimia., 2 (2): 100-104.

Petti, S., Scully, C., 2009, Polyphenols, Oral Health and Disease: A Review, J. Dent., 37 (2009), 413-423.

Pratikno, H., 2003, Pengaruh Daya Antibakterial Teh Hijau dalam Mencegah Karies Gigi, Skripsi, 1-32, Universitas Sumatra Utara, Medan.

Pratiwi, S.T., 2008, Mikrobiologi Farmasi, 110, 188, 190, Penerbit Erlangga, Jakarta.

Radji, M., 2010, Buku Ajar Mikrobiologi: Panduan Mahasiswa Farmasi & Kedokteran, 40, Penerbit EGC, Jakarta.

Safitri, E., 2004, Karies Dini dan Pencegahan Karies Secara Umum, Skripsi, 6, Universitas Sumatra Utara, Medan.

Shimamura, T., Zhao, W., dan Hu, Z, 2007, Mechanism of Action and Potential for Use of Tea Catechin as an Anti-infective Agent, Anti-Infect. Agents in Med. Chem., (6), 57-62.


63

Simon, L., 2007, The Role of Streptococcus mutans And Oral Ecology in The Formation of Dental Caries, http://www.lurj.org/article.php/vol2n2 /caries.xml, diakses tanggal 3 Februari 2012.

Sulistia, G., 1995, Farmakologi dan Terapi, Edisi IV, Bagian Farmakologi, 571-583, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.

Sumono, A., dan Wulan, A., 2009, Kemampuan Air Rebusan Daun Salam (Eugenia polyantha W) dalam Menurunkan Jumlah Koloni Bakteri Streptococcus sp., Majalah Farmasi Indonesia, 20 (3), 112-117.

Susanti, E., 2011, Keajaiban Katekin Teh Hijau pada Fungsi Cardiovaskuler, http://www.putraindonesiamalang.or.id/keajaiban-katekin-teh-hijau-pada-fungsi-cardiovaskuler.html, diakses tanggal 3 Februari 2012.

Suseno, H., 1977, Beberapa Aspek Fisiologi Tanaman Teh, Warta Balai Penelitian Teh dan Kina., 3 (4): 263-268.

Tahir, A., dan Moeen, R., 2011, Comparison of Antibacterial Activity of Water and Ethanol Extracts of Camellia Sinensis (L.) Kuntze Againts Dental Caries and Detection of Antibacterial Components, J. Med. Plant. Res., 5(18), pp. 4504-4510.

Taylor, P.W., Hamilton-Miller, J.M.T., dan Stapleton, P.D., 2005, Antimicrobial Properties of Green Tea Catechins, Food Sci. Technol Bull, (2), 71-81.

Volk dan Wheeler, 1988, Mikrobiologi Dasar, 249-267, Erlangga, Jakarta.

Xu, X., Zhou, X.D., dan Wu, C.D., 2011, The Tea Catechin Epigallocatechin Gallate Suppresses Cariogenic Virulence Factors of Streptococcus mutans, Antimicrob. Agents Chemother., 55(3), p. 1229-1236.

Zaveri, N.T., 2006, Green Tea and Its Polyphenolic Catechins: Medicinal Uses in Cancer and Noncancer Applications, J. Life Sci., 78, 2073-2080.


64

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Identifikasi Teh Hijau


65

Lampiran 2. Certificate of Analysis Ekstrak Etanol Teh Hijau


66

Lampiran 3. Proses Ekstraksi Ekstrak Etanol Teh Hijau

PROSEDUR EKSTRAK MASERASI DAUN TEH


67

Lampiran 4. Data Hasil Ekstraksi Ekstrak Etanol Teh Hijau


68

Lampiran 5. Penentuan Senyawa Identitas Ekstrak Etanol Teh Hijau Secara

Kualitatif dan Kuantitatif


69

Lampiran 6. Profil Kromatogram Ekstrak Etanol Teh Hijau


70

Lampiran 7. Hasil uji kemurnian dan pembuatan stok kultur murni bakteri

uji S. mutans

Keterangan:

A: Isolasi kultur bakteri S. mutans dari Lab. Mikrobiologi USD

B: Reisolasi 1 kultur bakteri S. mutans dari Lab. Mikrobiologi USD

C: Reisolasi 2 kultur bakteri S. mutans dari Lab. Mikrobiologi USD

D: Stok kultur murni bakteri S. mutans dalam media Nutrien Agar miring

A

B

C

D

C

B


71

Lampiran 8. Dokumentasi Uji Kemurnian dan Identifikasi S. mutans

a. Pengecatan Gram

Kesimpulan: bakteri uji S.mutans merupakan bakteri Gram positif (berwarna ungu) dan berbentuk coccus berantai.

b. Uji Oksidasi-Fermentasi (O-F)

Keterangan:

A: Perlakuan uji OF tanpa parafin berwarna kuning

B: Kontrol uji OF tanpa parafin berwarna hijau

C: Perlakuan uji OF parafin berwarna kuning

D: Kontrol uji OF parafin berwarna hijau

Kesimpulan: bakteri uji S. mutans bersifat fakultatif anaerob, dan

memproduksi asam hasil fermentasi-oksidasi dekstrosa.

A B C D


c

d

c. Uji

Ket

Kes

gluk

d. Uji

Ket

Kes

gluk

i Methyl Red

terangan:

A: Perlaku

B: Kontrol

simpulan: ba

kosa

i Voges Pros

terangan:

A: Kontro

B: Perlak

simpulan: ba

kosa.

A

A

d (MR)

uan uji Methy

uji Methyl r

akteri uji S. m

skauer (VP)

ol uji VP ber

kuan uji VP b

akteri uji S. m

B

B

yl red (MR)

red (MR) be

mutans mem

rwarna hijau

berwarna me

mutans mem

berwarna m

erwarna kuni

mproduksi as

u kehitaman

erah oranye

mproduksi as

merah

ing bening

sam hasil fer

n

sam hasil fer

72

rmentasi

rmentasi


73

e. Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Keterangan:

A: Perlakuan uji TSIA berwarna kuning

B: Kontrol uji TSIA berwarna merah oranye

Kesimpulan: bakteri uji S. mutans memproduksi asam hasil fermentasi laktosa, sukrosa, dan dekstrosa.

A B


74

Lampiran 9. Dokumentasi Uji Potensi Ekstrak Etanol Teh Hijau

a. Replikasi I

Keterangan:

A: Kontrol pertumbuhan bakteri uji S.mutans (6.108CFU)

B : Kontrol kontaminasi media NA

C : Kontrol (+) EGCG 0,25 mg/mL

D : Kontrol (+) EGCG 0,5 mg/mL

E : Kontrol (+) EGCG 0,75 mg/mL

F : Kontrol (+) EGCG 1,0 mg/mL

G : Kontrol (+) EGCG 2,5 mg/mL

H : Kontrol (+) EGCG 5,0 mg/mL

I : Kontrol (+) EGCG 7,5 mg/mL

J : Kontrol (+) EGCG 10,0 mg/mL

K & L: Kontrol (-) aquadest

1 : Ekstrak etanol teh hijau 0,25 mg/mL








A

K

E F

B

L

D C

4

2 1

3

J

G

I

H

K

8 7

6

L

5


75

b. Replikasi II

Keterangan:




















J

A

F

B

E

K

D

4

C

L

3

1 2

H

I

K

G

8 L

7

5 6


76

c. Replikasi III

Keterangan:




















K H G

I J 7 8

L

6 5

C D

F

K

1 2

E 3

L

4

A B


77

d. Replikasi IV

Keterangan:




















1 C

L

7 8

2

3 4

L

6 5 G H

J

K

I

D

F E

K

B A


78

e. Replikasi V

Keterangan:




















J I

K

G H

7

6 L

5

8

1

3 4

2 L

C

F

D

K

E

B A


79

f. Replikasi VI

Keterangan:




















A B

E F

K

3 4

L

1 2 C D

I

7

J

8

K

5

L

H 6 G


80

Lampiran 10. Hasil Uji Kruskal-Wallis Diameter Zona Hambat yang

Dihasilkan pada Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Teh

Hijau dengan Berbagai Variasi Konsentrasi EGCG

terhadap S. Mutans dengan Difusi Paper Disc

Ranks

kelomp

ok N Mean Rank

Zone 1 6 7.00

2 6 7.00

3 6 23.25

4 6 18.92

5 6 30.75

6 6 25.92

7 6 38.17

8 6 46.75

9 6 49.75

Total 54

Test Statisticsa,b

Zone

Chi-Square 47.633

df 8

Asymp. Sig. .000

a. Kruskal Wallis Test

b. Grouping Variable:

kelompok

Keterangan: p = 0.000 (p < 0,05) berarti terdapat perbedaan bermakna antar kelompok (konsentrasi ekstrak etanol teh hijau).


81

Lampiran 11. Data Uji Post Hoc (Mann-Whitney) yang Dihasilkan pada Uji

Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Teh Hijau dengan

Berbagai Variasi Konsentrasi EGCG terhadap S. Mutans

dengan Difusi Paper Disc

Konsentrasi 1 (mg/mL)

Konsentrasi 2 (mg/mL) Nilai p Kesimpulan

0,00

0,25 1,000 Berbeda tidak bermakna 0,5 0,001 Berbeda bermakna 0,75 0,002 Berbeda bermakna 1,0 0,002 Berbeda bermakna 2,5 0,007 Berbeda bermakna 5,0 0,002 Berbeda bermakna 7,5 0,002 Berbeda bermakna 10,0 0,002 Berbeda bermakna

0,25

0,0 1,000 Berbeda tidak bermakna 0,5 0,001 Berbeda bermakna 0,75 0,002 Berbeda bermakna 1,0 0,002 Berbeda bermakna 2,5 0,007 Berbeda bermakna 5,0 0,002 Berbeda bermakna 7,5 0,002 Berbeda bermakna 10,0 0,002 Berbeda bermakna

0,5

0,0 0,001 Berbeda bermakna 0,25 0,001 Berbeda bermakna 0,75 0,080 Berbeda tidak bermakna 1,0 0,070 Berbeda tidak bermakna 2,5 0,242 Berbeda tidak bermakna 5,0 0,003 Berbeda bermakna 7,5 0,003 Berbeda bermakna 10,0 0,002 Berbeda bermakna

0,75

0,0 0,002 Berbeda bermakna 0,25 0,002 Berbeda bermakna 0,5 0,080 Berbeda tidak bermakna 1,0 0,015 Berbeda bermakna 2,5 0,132 Berbeda tidak bermakna 5,0 0,003 Berbeda bermakna 7,5 0,003 Berbeda bermakna 10,0 0,003 Berbeda bermakna

1,0

0,0 0,002 Berbeda bermakna 0,25 0,002 Berbeda bermakna 0,5 0,070 Berbeda tidak bermakna 0,75 0,015 Berbeda bermakna


82

2,5 0,371 Berbeda tidak bermakna 5,0 0,073 Berbeda tidak bermakna 7,5 0,003 Berbeda bermakna 10,0 0,003 Berbeda bermakna

2,5

0,0 0,007 Berbeda bermakna 0,25 0,007 Berbeda bermakna 0,5 0,242 Berbeda tidak bermakna 0,75 0,132 Berbeda tidak bermakna 1,0 0,371 Berbeda tidak bermakna 5,0 0,023 Berbeda bermakna 7,5 0,003 Berbeda bermakna 10,0 0,003 Berbeda bermakna

5,0

0,0 0,002 Berbeda bermakna 0,25 0,002 Berbeda bermakna 0,5 0,003 Berbeda bermakna 0,75 0,003 Berbeda bermakna 1,0 0,073 Berbeda tidak bermakna 2,5 0,023 Berbeda bermakna 7,5 0,011 Berbeda bermakna 10,0 0,004 Berbeda bermakna

7,5

0,0 0,002 Berbeda bermakna 0,25 0,002 Berbeda bermakna 0,5 0,003 Berbeda bermakna 0,75 0,003 Berbeda bermakna 1,0 0,003 Berbeda bermakna 2,5 0,003 Berbeda bermakna 5,0 0,011 Berbeda bermakna 10,0 0,150 Berbeda tidak bermakna

10,0

0,0 0,002 Berbeda bermakna 0,25 0,002 Berbeda bermakna 0,5 0,002 Berbeda bermakna 0,75 0,003 Berbeda bermakna 1,0 0,003 Berbeda bermakna 2,5 0,003 Berbeda bermakna 5,0 0,004 Berbeda bermakna 7,5 0,150 Berbeda tidak bermakna

Keterangan: jika nilai p < 0,05 maka terdapat perbedaan bermakna antara dua kelompok (konsentrasi) yang dibandingkan (Dahlan, 2009).


83

Lampiran 12. Dokumentasi Hasil Uji Penegasan Nilai KHM dan KBM

dengan metode Streak plate

A B

C D

E F


84

Keterangan:

A: Kontrol kontaminasi media (bersih)

B: Ekstrak etanol konsentrasi 0,7 mg/mL

C: Ekstrak etanol konsentrasi 0,75 mg/mL

D: Ekstrak etanol konsentrasi 0,8 mg/mL

E: Ekstrak etanol konsentrasi 0,9 mg/mL

F: Ekstrak etanol konsentrasi 1,0 mg/mL

G: Ekstrak etanol konsentrasi 2,0 mg/mL

H: Ekstrak etanol konsentrasi 2,5 mg/mL

Ekstrak etanol teh hijau konsentrasi 0,7; 0,75; 0,8; 0,9; 1,0; 2,0; dan 2,5 mg/mL ditumbuhi bakteri namun kontrol media tetap bersih menandakan bahwa perlakuan sudah aseptis.

HG


85

BIOGRAFI PENULIS

Adelia Indah Pratiwi adalah anak kedua dari tiga

bersaudara dari pasangan Kuntadi Budi Utomo

dan Berowati, lahir di Banjarnegara tanggal 20

Agustus 1990. Penulis mulai masuk bangku

sekolah di TK Kristen YPPPK Purworejo

Klampok pada tahun 1995-1996. Pendidikan

sekolah dasar di SD Kristen YPPPK Purworejo

Klampok pada tahun 1996-2002, pendidikan

sekolah menengah tingkat pertama ditempuh di

SMP Santo Borromeus Purbalingga pada tahun 2002-2005. Pendidikan

selanjutnya ditempuh di SMA Bruderan Purwokerto pada tahun 2005-2008.

Penulis melanjutkan pendidikan strata tingkat pertama (S1) di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama duduk di bangku kuliah penulis

pernah menjadi Asisten Dosen Praktikum Mikrobiologi pada tahun ajaran

2009/2010, dan aktif dalam berbagai kegiatan kepanitiaan, yaitu panitia seminar

“Herbal Medicine” tahun 2008, divisi perlengkapan dalam kegiatan bakti sosial

“Pengobatan Gratis” tahun 2008, peserta Kampanye Informasi Obat tahun 2008,

panitia dalam acara Pengambilan Sumpah/ Janji Apoteker Angkatan XVIII pada

tahun 2010, Wakil Ketua Pelaksana Kejuaraan Beladiri Kempo Antar Dojo

(KejurDo) Tingkat Provinsi Yogyakarta pada tahun 2011 dan hingga saat ini

penulis masih menjabat sebagai Ketua Unit Kegiatan Mahasiswa (UKM) Beladiri

Shorinji Kempo Universitas Sanata Dharma masa bakti 2011-2012.

Penulis merupakan salah satu Mahasiswa Berprestasi Bidang Minat dan Bakat

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun 2011 dan pada Malam

Puncak Dies Natalis Universitas Sanata Dharma ke-56, penulis mendapatkan

penghargaan dari Universitas Sanata Dharma sebagai salah satu mahasiswa

berprestasi di bidang olah raga tahun 2011. Beberapa prestasi dalam bidang olah

raga, khususnya beladiri Kempo, telah diraih oleh penulis, antara lain Juara I

Embu (kerapihan teknik) Berpasangan Kyu II Dewasa dan Juara II Randori


86

(pertarungan bebas terbatas) Putri kelas >51 Kg dalam Kejuaraan Provinsi

(KejurProv) Bantul 2010; Juara I Embu Berpasangan Putri Kyu II/ Kyu I, Juara I

Embu Beregu Campuran dan Juara II Randori Putri kelas > 57 Kg dalam KejurDo

Tingkat Provinsi Yogyakarta tahun 2011; Juara I Randori Putri kelas >54 Kg,

Juara II Embu Berpasangan Kyu III-Kyu I, dan Juara III Embu Beregu dalam

Kejuaraan Kempo KONI Cup Kabupaten Sleman tahun 2012; Juara III Embu

Berpasangan Putri dalam Kejuaraan Antar Mahasiswa Beladiri Kempo Se-

D.I.Yogyakarta dan Jawa Tengah tahun 2012.


potensi antibakteri ekstrak etanol teh hijau … filei potensi antibakteri ekstrak etanol teh hijau...

Documents