pontificia universidad javeriana facultad de...
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
EFECTO DE USOS DE SUELO EN LA ECORREGIÓN
CAFETERA SOBRE LA DENSIDAD DE BACTERIAS
NITRIFICANTES Y DESNITRIFICANTES
MARIA MAGDALENA GÓMEZ CORONELL
TRABAJO DE TESIS DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar el titulo de Magíster en Ciencias
Biológicas
Bogotá, D.C., 2008
ii
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
iii
EFECTO DE USOS DE SUELO EN LA ECORREGIÓN
CAFETERA SOBRE LA DENSIDAD DE BACTERIAS
NITRIFICANTES Y DESNITRIFICANTES
MARIA MAGDALENA GÓMEZ CORONELL
APROBADO
----------------------------- ------------------------------ Fabio Roldán, Ph. D Amanda Varela, Ph. D
Director Jurado
------------------------------- ---------------------------- Joaquín Benavides, MSc Victoria Vallejo, MSc
Jurado Jurado
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EFECTO DE USOS DE SUELO EN LA ECORREGIÓN
CAFETERA SOBRE LA DENSIDAD DE BACTERIAS
NITRIFICANTES Y DESNITRIFICANTES
MARIA MAGDALENA GÓMEZ CORONELL
------------------------------- ---------------------------------- Carlos Corredor, Ph. D Ingrid Schuler, Ph. D Director de postgrado Decana académica Facultad de Ciencias
v
Agradezco a Dios y dedico este trabajo a mi
familia y en especial a Eduardo y mis hijos
Eduardo Luís, Andrea y Luigi a quienes amo.
vi
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Investigación en Biodiversidad y Recursos Genéticos (CIEBREG)-COLCIENCIAS y a la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) por el apoyo logístico para el desarrollo de este proyecto.
A COLCIENCIAS y a la Vicerrectoría Académica por la financiación para la realización de este estudio. Al profesor Fabio Roldán por darme la oportunidad de realizar este trabajo bajo su dirección, además por su paciencia, enseñanza y colaboración.
A la profesora Sandra Baena por su apoyo en facilitar el laboratorio de anaerobios para completar el trabajo de investigación.
A Mónica Verdugo, Erika García y Victoria Vallejo por su colaboración en la revisión del documento.
A Gina López y Carolina Díaz por su buena voluntad y enseñanza en el laboratorio de anaerobios.
A Habib Yanine por su amabilidad y aporte en la parte estadística.
A Martha Orozco, Aidé Sofía Muñoz, Gloria Acosta, Yamile Díaz y Marcela Gómez por su amistad y apoyo constante.
A Ana María Cubillos, Carolina Rubiano, Luisa Fernanda Bernal, Raiza Gómez, Patricia Ahumada, Javier Gómez, Ricardo Amaya, Sra Miriam Peña y a todas las personas que integran la USBA por su colaboración y afecto mil gracias.
vii
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS………………………………………………………………....xi
LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………….xii
LISTA DE ANEXOS.......................................................................................xiv
RESUMEN…………………………………………………………………………xvii
ABSTRACT………………………………………………………………………...xix
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….......1
2. REVISIÓN LITERARIA…………………………………………………………..4
2.1. El suelo……………………………………………..………………………..4
2.1.1. Características físicas del suelo……………………………………….4
2.1.2. Características químicas del suelo……………………………………7
2.2. Microorganismos del suelo………………………………………………...8
2.2.1. Microorganismos como indicadores de la calidad del suelo............9
2.3. Ecorregión Cafetera de Colombia……………………………………….11
2.3.1. Localización geográfica………………………………………………..11
2.3.2. Suelos de la Ecorregión Cafetera…………………………………….11
2.4. Sistemas productivos……………………………………………………..12
2.4.1. Coberturas vegetales…………………………………………………..13
2.5. EL nitrógeno………………………………………………………………..17
2.5.1. Ciclo del nitrógeno……………………………………………………...18
2.5.2. Características fisiológicas y metabólicas de las bacterias…………..
nitrificantes………………………………………………………………21
2.5.3. Factores que afectan la nitrificación………………………………….24
2.5.4. Características fisiológicas y metabólicas de las bacterias…………..
desnitrificantes………………………………………………………….25
2.5.5. Factores que afectan la desnitrificación……………………………..26
2.5.6. Problemas asociados a la nitrificación y desnitrificación…………..27
2.6. Uso de agroquímicos……………………………………………………...29
viii
2.7. Métodos dependientes de cultivo para el estudio de la abundancia…….
microbiana………………………………………………….......................30
3. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………..32
4. OBJETIVOS……………………………………………………………………..35
4.1. Objetivo general……………………………………………………………35
4.2. Objetivos específicos……………………………………………………...35
5. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………..36
5.1. Selección de las condiciones óptimas para el cultivo de bacterias……..
nitrificantes…………………………………………………………………36
5.2. Selección de las condiciones óptimas para el cultivo de bacterias……..
desnitrificantes …………………………………………………………….37
5.3. Determinación de la densidad de bacterias nitrificantes.………………...
y desnitrificantes en las coberturas seleccionadas…………………….39
5.3.1. Área de estudio…………………………………………………………39
5.3.2. Toma de muestra del suelo……………………………………………41
5.3.2.1. Toma de muestra para bacterias nitrificantes…………………….41
5.3.2.2. Toma de muestra para bacterias desnitrificantes………………..42
5.4. Evento de muestreo………………………………………………………42
5.5. Diseño experimental……………………………………………………...42
5.6. Evaluación de los parámetros in situ……………………………………43
5.6.1. Temperatura del suelo…………………………………………………43
5.7. Análisis en laboratorio…………………………………………………....43
5.7.1. Análisis microbiológico del suelo……………………………………..43
5.7.1.1. Extracción de los microorganismos del suelo…………………....43
5.7.1.2. Determinación de la densidad de bacterias nitrificantes………..44
5.7.1.3. Evaluación del crecimiento de bacterias nitrificantes……………44
5.7.1.4. Aislamiento de las bacterias nitrificantes………………………….46
5.7.1.5. Determinación de la densidad de bacterias desnitrificantes…....47
5.7.1.6. Evaluación del crecimiento de bacterias desnitrificantes……….48
ix
5.7.1.7. Aislamiento de las bacterias desnitrificantes……………………...48
5.7.2. Análisis físico químico del suelo………………………………………49
5.7.2.1. pH……………………………………………………………………..49
5.7.2.2. Porcentaje de humedad y peso seco……………………………..49
5.7.2.3. Nitrógeno como nitrato……………………………………………...50
5.8. Análisis estadístico……………………………......................................51
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………….............................................53
6.1. Selección de las condiciones óptimas para el crecimiento y……………
cuantificación de bacterias nitrificantes…………………………………53
6.1.1. Fuente de carbono……………………………………………………..53
6.1.2. Fuente de energía………………………………………………………56
6.1.3. Volumen de medio de cultivo………………………………………….57
6.1.4. Temperatura y humedad durante la incubación…………………….57
6.2. Selección de las condiciones óptimas para el crecimiento y…………....
cuantificación de bacterias desnitrificantes……………………………..58
6.2.1. Fuente de carbono………………………………………………..........58
6.2.2. Temperatura durante la incubación…………………………………..59
6.3. Determinación de la densidad de bacterias nitrificantes y……………….
desnitrificantes en las coberturas seleccionadas de la Ecorregión……..
Cafetera (EC) de Colombia………………………………………………59
6.3.1. Comparación de la densidad de BOA en las coberturas de la………
ventana La Vieja……………………………………………………….61
6.3.2. Comparación de la densidad de BON en las coberturas de la………. ventana La Vieja………………………………………………………..61
6.3.3. Comparación de la densidad de BOA en las coberturas de la………. ventana Otún……………………………………………………………63
6.3.4. Comparación de la densidad de BON en las coberturas de la……….
ventana Otún…………………………………………………………...63
6.3.5. Discusión de los resultados de bacterias nitrificantes……………...64
x
6.3.6. Comparación de la densidad de bacterias desnitrificantes en.……… las coberturas de la ventana La Vieja……………………………….70
6.3.7. Comparación de la densidad de bacterias desnitrificantes en las…...
coberturas de la ventana Otún……………………………………….71
6.3.8. Discusión de los resultados de bacterias desnitrificantes…………71
6.4. Comparación de los parámetros físico-químicos en las coberturas de...
a ventana La Vieja………………………………………………………..74
6.5. Comparación de los parámetros físico-químicos en las coberturas de...
.la ventana Otún …………………………………………………………..77
6.6. Efecto de la cobertura vegetal sobre la densidad de bacterias…………
nitrificantes y desnitrificantes…………………………………………….80
6.7. Aislamiento de bacterias nitrificantes……………………………………83
6.8. Aislamiento de bacterias desnitrificantes……………………………….84
7. CONCLUSIONES.......................................................................................88
8. RECOMENDACIONES………………………………………………………...89
9. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………….90
ANEXOS.......................................................................................................100
xi
LISTA DE TABLAS
Tabla. 1. Partículas minerales del suelo y su tamaño…………………………6
Tabla. 2. Estado de oxidación de compuestos nitrogenados……………….18
Tabla. 3. Enzimas y reacciones que la catalizan……………………………..26
Tabla. 4. Medios de cultivo reportados en la literatura para el crecimiento…..
de bacterias nitrificantes……………………………………………...37
Tabla. 5. Medios de cultivo reportados en la literatura para el crecimiento…..
de bacterias desnitrificantes………………………………………...38
Tabla. 6. Coberturas y fincas seleccionadas en las cuencas de los ríos La….
Vieja y Otún…………………………………………………………...40
Tabla. 7. Comparación de la densidad de bacterias nitrificantes utilizando….
CaCO3 y NaHCO3 como fuente de carbono……………………….54
Tabla. 8. Densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en las………..
coberturas de la ventana La Vieja y Otún………………………….60
Tabla. 9. Características fenotípicas de las cepas aisladas de BOA...........84
Tabla. 10. Características fenotípicas de las cepas de bacterias………………
desnitrificantes aisladas en Junio………………………………......85
Tabla. 11. Características fenotípicas de las cepas de bacterias……………….
desnitrificantes aisladas en Octubre………………………………..86
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura. 1. Ciclo del nitrógeno…………………………………………………...19
Figura. 2. Toma de muestra para bacterias nitrificantes…………………….41
Figura. 3. Toma de muestra para bacterias desnitrificantes………………...42
Figura. 4. NMP para bacterias oxidadoras ras de amonio y nitrito………....45
Figura. 5. Preparación de soluciones para el NMP de bacterias……………...
desnitrificantes.............................................................................47
Figura. 6. NMP para bacterias desnitrificantes……………………………….48
Figura. 7. Metodología empleada para evaluar el efecto de coberturas……...
vegetales presentes en la ecorregión cafetera sobre la densidad…
de bacterias nitrificantes y desnitrificantes………………………...52
Figura. 8. Comparación de la densidad de BOA y BON utilizando CaCO3 ….
y NaHCO3 como fuente de carbono……………………………….55
Figura. 9. Comparación de la fuente de carbono con base en el crecimiento.
de BOA por el NMP………………………………………………….56
Figura. 10. Comparación de la fuente de carbono con base en el crecimiento.
de BON por el NMP…………………………………………………56
Figura. 11. Comparación de la fuente de carbono con base en el crecimiento.
de bacterias desnitrificantes………………………………………...59
Figura. 12. Densidad de BOA en las coberturas de la ventana La Vieja……....
durante los eventos de muestreo en Junio y Octubre…………....61
Figura. 13. Densidad de BON en las coberturas de la ventana La Vieja……....
durante los eventos de muestreo en Junio y Octubre……………62
Figura. 14. Densidad de BOA en las coberturas de la ventana Otún durante…
los eventos de muestreo en Junio y Octubre……………………..63
Figura. 15. Densidad de BON en las coberturas de la ventana Otún durante...
los eventos de muestreo en Junio y Octubre……………………..64
xiii
Figura. 16. Densidad de bacterias desnitrificantes en las coberturas de la……
ventana La Vieja durante los eventos de muestreo en Junio y……..
Octubre………………………………………………………………..70
Figura. 17. Densidad de bacterias desnitrificantes en las coberturas de la……
ventana Otún durante los eventos de muestreo en Junio y………..
Octubre………………………………………………………………..71
Figura. 18. pH en las coberturas de la ventana La Vieja durante el estudio.74
Figura. 19. Temperatura en las coberturas de la ventana La Vieja durante el..
estudio………………………………………………………………...75
Figura. 20. Humedad en las coberturas de la ventana La Vieja durante el……
estudio………………………………………………………………...76
Figura. 21. Concentración de nitratos en las coberturas de la ventana………..
La Vieja durante el estudio…………………………………………77
Figura. 22. pH en las coberturas de la ventana Otún durante el estudio……78
Figura. 23. Temperatura en las coberturas de la ventana Otún durante el……
estudio………………………………………………………………...78
Figura. 24. Humedad en las coberturas de la ventana Otún durante el ……….
estudio………………………………………………………………..79
Figura. 25. Concentración de nitratos en las coberturas de la ventana Otún….
durante el estudio……………………………………………………80
Figura. 26. Vista microscópica de la cepa 18 en el mes de Junio……………87
Figura. 27. Vista microscópica de la cepa 17 en el mes de Octubre………...87
xiv
LISTA DE ANEXOS
Anexo. 1. Medio de cultivo para bacterias oxidadoras de amonio
Anexo. 2. Medio de cultivo para bacterias oxidadoras de nitritos
Anexo. 3. Medio de cultivo para bacterias heterótrofas
Anexo. 4. Medio de cultivo para bacterias desnitrificantes
Anexo. 5. Técnica del tubo rodado para el aislamiento de bacterias
desnitrificantes
Anexo. 6. Comparación de CaCO3 y NaHCO3 como fuente de carbono
utilizando las densidades de BOA y BON
Anexo. 7. Densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en las
coberturas de la ventana La Vieja en el mes de Junio
Anexo. 8. Densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en las
coberturas de la ventana La Vieja en el mes de Octubre
Anexo. 9. Densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en las
coberturas de la ventana Otún en el mes de Junio
Anexo.10. Densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en las
coberturas de la ventana Otún en el mes de Octubre
Anexo.11. Análisis de varianza del Log10 NMP de BOA en las coberturas de
la ventana La Vieja en el mes de Junio
Anexo 12. Análisis de varianza del Log10 NMP de BOA en las coberturas de.
la ventana La Vieja en el mes de Octubre
Anexo.13. Análisis de varianza del Log10 NMP de BON en las coberturas de.
la ventana La Vieja en el mes de Junio
Anexo.14. Análisis de varianza del Log10 NMP de BON en las coberturas de
la ventana La Vieja en el mes de Octubre
Anexo.15. Análisis de varianza del Log10 NMP de BOA en las coberturas de
la ventana Otún en el mes de Junio
xv
Anexo.16. Análisis de varianza del Log10 NMP de BOA en las coberturas de
la ventana Otún en el mes de 0ctubre
Anexo.17. Análisis de varianza del Log10 NMP de BON en las coberturas de
la ventana Otún en el mes de Junio
Anexo.18. Análisis de varianza del Log10 NMP de BON en las coberturas de
la ventana Otún en el mes de Octubre
Anexo.19. Análisis de varianza del Log10 NMP de bacterias desnitrificantes
en las coberturas de la ventana La Vieja en el mes de Junio
Anexo.20. Análisis de varianza del Log10 NMP de bacterias desnitrificantes
en las coberturas de la ventana La Vieja en el mes de Octubre
Anexo.21. Análisis de varianza del Log10 NMP de bacterias desnitrificantes
en las coberturas de la ventana Otún en el mes de Junio
Anexo.22. Análisis de varianza del Log10 NMP de bacterias desnitrificantes
en las coberturas de la ventana Otún en el mes de Octubre
Anexo.23. Comparación del Log10 NMP de BOA en la ventana La Vieja en
Junio y Octubre
Anexo.24. Comparación del Log10 NMP de BON en la ventana La Vieja en
Junio y Octubre
Anexo.25. Comparación del Log10 NMP de bacterias desnitrificantes en la
ventana La Vieja en Junio y Octubre
Anexo.26. Comparación del Log10 NMP de BOA en la ventana Otún en Junio
y Octubre
Anexo.27. Comparación del Log10 NMP de BON en la ventana Otún en Junio
y Octubre
Anexo.28. Comparación del Log10 NMP de bacterias desnitrifcantes en la
ventana Otún en Junio y Octubre
xvi
Anexo.29. Parámetros físico-químicos evaluados en la ventana La Vieja
durante los meses de Junio y Octubre
Anexo.30. Parámetros físico-químicos evaluados en la ventana Otún durante
los meses de Junio y Octubre
Anexo.31. Distribución media mensual de la lluvia (mm) en la Ecorregión
Cafetera
xvii
RESUMEN
Durante el presente estudio se evaluó el efecto de usos de suelo en las
cuencas de los ríos La Vieja y Otún en la Ecorregión Cafetera de Colombia
sobre la densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes. Inicialmente, se
estandarizaron las condiciones para el crecimiento y su cuantificación por la
técnica del número más probable (NMP). Se utilizó sulfato de amonio
(NH4)2SO4 (0.5 g/l) como fuente de energía para las bacterias oxidadoras de
amonio (BOA) y nitrito de sodio NaNO2 (0.035 g/l) para las oxidadoras de
nitrito (BON). Se utilizó bicarbonato de sodio NaHC03 (0.125g/l) y una mezcla
de acetato de sodio y etanol como fuente de carbono para las bacterias
nitrificantes y desnitrificantes, respectivamente. Se realizaron 2 eventos de
muestreo (10-24 de junio y 14-21 de octubre, 2006). En cada cuenca se
seleccionaron las cuatro coberturas más representativas y en cada una de
ellas, se escogieron dos fincas donde se tomaron tres muestras compuestas,
para un total de 96 muestras. Se analizaron características fisicoquímicas de
los suelos (temperatura, pH, porcentaje de humedad y concentración de
nitratos) y microbiológicas (densidad de BOA, BON y bacterias
desnitrificantes).
Se observaron las mayores densidades de bacterias nitrificantes y
desnitrificantes, en pastizal y cafetal sin sombrío en la ventana La Vieja, y en
cebolla en la ventana Otún. Estas coberturas son caracterizadas por una alta
intervención antropogénica, en prácticas como la agricultura y la ganadería
en donde el agregado de materia orgánica y de nitrógeno natural por parte de
los árboles es reemplazado por el uso de fertilizantes químicos y plaguicidas
generando un ambiente favorable para las bacterias nitrificantes. El uso del
amonio como fuente de energía y el consumo de O2 como aceptor final de
xviii
electrones origina microambientes anaerobios que benefician a las bacterias
desnitrificantes. De igual forma se observó que coberturas menos
intervenidas por el hombre como los bosques y plantaciones forestales
presentaron las densidades más bajas para estos grupos funcionales, lo cual
pudo ser causado por factores como la materia orgánica y la poca
biodisponibilidad de nutrientes que limitaron el crecimiento de estas
bacterias. Finalmente, variables fisicoquímicas como pH, humedad,
temperatura y contenido de nitratos tuvieron un efecto significativo sobre las
densidades microbianas evaluadas.
Palabras claves: Coberturas, desnitrificantes, fertilizantes, nitrificantes
número más probable (NMP).
xix
ABSTRACT
During the present study the effect of the soil use in La Vieja and Otún river
basins presents the Colombian coffee-growing eco-region, on the nitrifying
and denitrifying bacteria density was evaluated. Initially, the conditions for the
bacteria growth and quantification were standardized by using the most
probable number technique (MPN). Ammonium sulfate (NH4)SO4 (0.5 g/l) was
used as energy source for ammonia oxidizing bacteria (AOB) while sodium
nitrate NaNO2 (0.035 g/l) was used for nitrite oxidizing bacteria (NOB).
Sodium bicarbonate NaHCO3 (0.125 g/l) and a mixture of sodium acetate and
ethanol were used as a source of carbon for nitrifying and denitrifying
bacteria, respectively. Two sampling events were conducted (on June and
October, 2006). Selecting four representative vegetal coverage in each river
basin. For each vegetal coverage two different representative locations were
selected where three different sampling points were selected, for an overall of
96 composite soil samples. A physical-chemical (temperature, pH, humidity
percentage and nitrates) and microbial parameters (BOA, BON and
denitrifying density) was conducted.
Areas with nitrifying and denitrifying higher densities were pasture and coffee
plantations without shade in La Vieja, and onion plantations in the Otún. The
coverts were characterized by a high human intervention, in practices such as
agriculture and livestock in which the natural addition of organic material and
nitrogen were replaced by the use of chemical fertilizers and pesticide offering
a favorable environment to the nitrifying bacteria. The presence of ammonia
as an energy source creates anaerobic environments, where oxygen is
consumed; this process is beneficial to denitrifying bacteria growth. In addition
least human intervened areas such as forest and forest plantations showed
xx
lower nitrifying and denitrifying bacteria density. This might be caused by facts
like, a high dissolved organic matter in the soil and low nutrients availability
could limit the bacteria growth under these conditions. Finally the soil
physical-chemical properties such as pH, humidity, temperature and nitrates
had an effect on the bacteria.
Keywords: Bacteria, denitrifying, fertilizer, most probable number, nitrifying.
1
1. INTRODUCCIÓN
La intensificación de las prácticas agrícolas ha generado alteraciones
en los ecosistemas afectando la calidad del suelo, y ocasionando
acidificación, salinización, erosión, compactación, alteración de la estructura
y pérdida de la biodiversidad. Los suelos sanos son esenciales para la
integridad de los ecosistemas terrestres y su protección es necesaria
porque pueden sustentar prácticas de manejo que optimicen su
productividad.
Los ciclos biogeoquímicos y en especial el ciclo del nitrógeno cumplen un
papel importante en esta productividad, debido a que es fundamental en el
mantenimiento de la fertilidad del suelo necesaria en los cultivos extensivos.
Este ciclo consiste en una serie de reacciones de oxidación y reducción
sucesivas que conducen a la transformación del nitrógeno a formas
asimilables para los organismos, permitiendo la circulación e intercambio del
nitrógeno de la atmósfera en ambientes acuáticos y terrestres. Los
microorganismos cumplen un papel fundamental durante el proceso de
transformación del nitrógeno, ya que son capaces de tomarlo de la
atmósfera (N2) y convertirlo en compuestos inorgánicos (p.e., NH4+, NO3
-), o
viceversa. Estos compuestos pueden ser utilizados por los microorganismos
para la formación de biomasa o como donadores y aceptores de electrones.
El ciclo biogeoquímico del nitrógeno es llevado a cabo por bacterias
fijadoras de nitrógeno (vida libre y simbiótica), microorganismos aerobios
que utilizan compuestos nitrogenados como fuente energía (nitrificantes),
formación de biomasa (heterótrofos) y por organismos que lo utilizan como
aceptor de electrones (desnitrificantes).
Las bacterias nitrificantes son las encargadas de oxidar el amoniaco
y los iones de amonio hasta nitrato, el cual será utilizado por las plantas
para su nutrición o por bacterias como las desnitrificantes que lo requieren
2
para su respiración convirtiéndolo en nitrógeno. Aunque el nitrato es
fácilmente asimilado por las plantas, puede al mismo tiempo ser arrastrado
del suelo por lixiviación hasta las aguas subterráneas, ocasionando riesgos
para la salud. El retorno del nitrógeno a la atmósfera mediante el proceso de
desnitrificación genera una pérdida de este elemento en ambientes
naturales y puede causar la formación de compuestos de nitrógeno gaseoso
como el óxido nitroso (N2O), considerado un gas de efecto invernadero,
siendo perjudicial para la agricultura y el medio ambiente.
Generalmente, los suelos agrícolas reciben elevadas
concentraciones de abonos nitrogenados, como ha sucedido a lo largo de
los últimos años en la Ecorregión Cafetera (EC). Esta intervención se ha
basado en el empleo de prácticas intensivas de producción agrícola tales
como las asociadas a los cultivos de café, caña de azúcar y cebolla.
Además muchas áreas boscosas han sido transformadas en pastizales y
otros sistemas de producción, por lo que se hace necesaria la utilización de
abonos ricos en nitrógeno como urea y fertilizantes orgánicos, para obtener
un aumento en la productividad de los suelos. Estas prácticas agrícolas
pueden contribuir a que se presenten alteraciones en los procesos naturales
de nitrificación y desnitrificación, causando el deterioro progresivo de los
suelos y el medio ambiente.
Se requiere por lo tanto identificar bioindicadores, que
proporcionen información sobre la salud y el efecto de las diferentes
condiciones de manejo del suelo. La identificación de grupos funcionales
asociados al ciclo del nitrógeno como posibles indicadores permitirá
evidenciar señales tempranas de alteraciones en las funciones del suelo.
Los microorganismos poseen la habilidad de dar una medida de la
calidad del suelo, debido a que responden rápidamente a las
condiciones ambientales, se adaptan a cambios en los ecosistemas y
3
participan en los diferentes ciclos biogeoquímicos. Por lo tanto cambios
en la actividad y en las poblaciones microbianas podrían evidenciar
alteraciones físicas y químicas en la calidad del suelo.
El objetivo principal de este estudio fue evaluar el efecto del uso del
suelo en la EC, sobre la densidad de las bacterias nitrificantes y
desnitrificantes. Para lograr este objetivo se estandarizaron las condiciones
óptimas para el crecimiento de bacterias nitrificantes y desnitrificantes y su
cuantificación por la técnica del número más probable (NMP). Se analizaron
características fisicoquímicas de los suelos como: temperatura, pH,
porcentaje de humedad y concentración de nitratos, para determinar si
presentaban algún efecto sobre la densidad de las bacterias en estudio.
Además se realizó aislamiento por métodos tradicionales de cultivo, que
incluyeron sus características fenotípicas (descripción macro y
microscópicas y su actividad metabólica mediante la utilización de
compuestos inorgánicos de nitrógeno como fuente de energía y aceptor final
de electrones por las bacterias nitrificantes y desnitrificantes
respectivamente).
4
2. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1. El suelo El suelo es una estructura dinámica formada por material orgánico y
mineral que se encuentra cubriendo la corteza terrestre, y que sirve de
soporte a las plantas y microorganismos, proporcionando los elementos
necesarios para su crecimiento y desarrollo (Rodríguez et al., 2004). Los
componentes del suelo como los fosfatos, carbonatos, silicatos, raíces de
plantas, microorganismos y materia orgánica se encuentran básicamente en
estado sólido, gaseoso y coloidal.
De acuerdo con Atlas y Bartha (2002) el suelo cumple un papel muy
importante para el sustento de la vida, por ser
• Fuente de nutrientes para la producción de biomasa.
• Actuar como medio amortiguador.
• Ser el escenario donde ocurren parte de los ciclos biogeoquímicos
como los del carbono y nitrógeno.
• Ser el medio donde se realizan la mayoría de las actividades
humanas como la agricultura y las actividades forestales.
El suelo además posee gran diversidad de microorganismos, que
realizan funciones determinantes en la transformación de los componentes
orgánicos e inorgánicos que se le incorporan. Estas funciones permiten
comprender la importancia de los microorganismos en la nutrición de las
plantas, pues ayudan en la fertilidad y producción de alimentos,
proporcionando sustancias necesarias que pueden ser asimiladas por las
raíces de las plantas (Rodríguez et al., 2004).
2.1.1. Características físicas del suelo
Las características físicas de los suelos se relacionan con los
procesos químicos y biológicos que ocurren constantemente en estos
5
sistemas (Fuentes, 2004). Entre los procesos que ocurren en el suelo
encontramos la nutrición de las plantas, en la cual se hace necesaria la
disponibilidad de agua y condiciones de aireación. Adicionalmente para el
desarrollo de los microorganismos y las actividades enzimáticas es
importante la temperatura que tenga el suelo (Fuentes, 2004). Por lo tanto
las características físicas que tenga un suelo le ayudan en su capacidad de
drenaje y almacenamiento de agua, a determinar su rigidez y fuerza de
sostenimiento, la facilidad para la penetración de las raíces, la aireación y
retención de nutrientes (Rodríguez et al., 2004). Entre las propiedades
físicas del suelo se encuentran:
Estructura: Es la forma en que las partículas del suelo se reúnen para
formar agregados, de acuerdo a esta característica se distinguen suelos de
estructura esferoidal (agregados redondeados), laminar (agregados en
láminas), prismática (en forma de prisma) y granular (en granos) (Sylvia et
al., 2005).
Textura: La textura general de un suelo depende de la proporción de
partículas inorgánicas de distinto tamaño que lo constituyen. Las partículas
del suelo se clasifican como grava, arena, limo y arcilla, e indican la
capacidad de retención de agua y productividad de un suelo (Tabla 1). Los
suelos con un porcentaje elevado de arena, suelen ser incapaces de
almacenar agua suficiente, para permitir el buen crecimiento de las plantas
(Sylvia et al., 2005). Estos suelos pierden grandes cantidades de minerales
y nutrientes por lavado del agua hacia el subsuelo, durante los procesos de
escorrentía. Los suelos que contienen una proporción mayor de partículas
pequeñas, (p.e., arcillas y los limos), son depósitos excelentes de agua y
encierran minerales que pueden ser utilizados con facilidad (Fuentes, 2004).
Consistencia: Se refiere a la resistencia para la deformación o ruptura,
según la resistencia el suelo puede ser suelto, suave, duro o muy duro.
6
Tabla 1. Partículas minerales del suelo y su tamaño
Partícula mineral Tamaño (µm)
Grava > 2000
Arena 50-2000
Limo 2-5
Arcilla < 2
Tomado de: Sylvia et al., 2005.
Densidad: En el suelo, como en cualquier otro cuerpo físico, la densidad se
define como la masa por unidad de volumen y esta muy relacionada con la
porosidad, la cual se refiere al volumen de espacios vacío del suelo. De esta
forma un suelo poroso será menos denso (Sylvia et al., 2005).
Aireación: Es el intercambio de oxígeno, anhídrido carbónico y otros gases
entre la atmósfera, el suelo y las raíces de las plantas. Es importante la
aireación para el abastecimiento de oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono
en el suelo. La aireación es crítica en los suelos anegados ya que el
oxígeno atmosférico no puede penetrar en el suelo y la tasa de respiración
aeróbica disminuye. La aireación se mejora con la labranza, la rotación de
cultivos, el drenaje y la incorporación de materia orgánica (Sylvia et al.,
2005).
Temperatura: Es un factor que influye en los procesos químicos, físicos y
biológicos, en el suelo se produce un intercambio de calor entre él y la
atmósfera. Los principales parámetros que definen el comportamiento
térmico de un suelo son su calor específico y su conductividad térmica, pero
para que se produzca un calentamiento de los diversos horizontes edáficos,
es necesario que la radiación solar llegue hasta la superficie y penetre en
ella (Fuentes, 2004).
7
Color: Los suelos en general tienen color oscuro, el cual se aclara a medida
que se profundiza y puede variar con el contenido de humedad. Las
principales sustancias que confieren al suelo su color son: el humus y
compuestos minerales como los óxidos, sulfuros y carbonatos. Los suelos
de color oscuro, generalmente son ricos en materia orgánica (Fuentes,
2004).
2.1.2. Características químicas del suelo
Las características químicas del suelo permiten reconocer
alteraciones del suelo cuando se provocan cambios en su composición y se
relacionan fundamentalmente a los contenidos de diferentes elementos
requeridos como nutrientes (p.e., N, P, Ca, Mg, K, S), en concentración y
formas químicas muy variables. Estos elementos son vitales para la
actividad metabólica de las plantas y microorganismos ya que participan en
la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas (Pacheco et al., 2002).
Básicamente estos elementos favorecen la formación de las raíces, ayudan
en la maduración de los frutos, la formación de semillas y en la protección
de enfermedades. Su deficiencia provoca reducciones severas en el
crecimiento de cultivos vegetales y microorganismos (Harrison, 1999).
El pH es un indicativo de la alcalinidad o acidez del suelo y mide la
concentración de hidrogeniones (H�). El pH del suelo es muy importante
porque los microorganismos y plantas responden marcadamente a
cambios de pH en su medio ambiente. Los suelos ácidos son prevalentes
en sitios con frecuentes precipitaciones debido a la lixiviación de las
formas básicas y los suelos alcalinos se encuentran en regiones áridas y
semiáridas (Harrison, 1999). El rango optimo del pH del suelo para el
crecimiento de los microorganismos y de la mayor parte de las plantas es
cercano a la neutralidad (6.0 a 7.0), debido a que la mayor parte de las
8
sustancias nutritivas están disponibles en este intervalo (Sylvia et al.,
2005).
Algunas capas del suelo contienen oxígeno, en tanto que otras son
anoxicas, determinando en parte los tipos de metabolismo que puedan
tener lugar y las transformaciones químicas que puedan llevar a cabo los
microorganismos nativos (Atlas y Bartha, 2002).
Los restos de plantas, animales y microorganismos forman la
materia orgánica del suelo, la cual esta compuesta principalmente por
carbono, oxígeno, nitrógeno, fósforo, hidrogeno y azufre, unidos en
diferentes compuestos químicos como carbohidratos, proteínas y grasas
(Harrison, 1999). La materia orgánica se convierte en una fuente
indispensable de nutrientes a través de su descomposición, en la que
participan bacterias y hongos, generándose una gran variedad de
productos de mineralización que influyen en la fertilidad del suelo y el
ciclaje de nutrientes (Atlas y Bartha, 2002). Adicionalmente se forman otros
productos recalcitrantes que permanecen en los suelos por períodos
prolongados, estos productos contienen cantidades variables de proteínas
y ciertos ácidos urónicos combinados con ligninas y sus derivados
denominado humus (Fuentes, 2004). El humus es muy importante porque
interviene en la agregación, estructura y retención hídrica de los suelos.
2.2. Microorganismos del suelo
El componente microbiano del suelo es primordial para la salud de
los ecosistemas, pero las prácticas agrícolas, así como el manejo de los
recursos vegetales inciden sobre este componente afectando tanto su
biodiversidad como la densidad (Aciego et al., 1991; Nielsen y Winding,
2002). La biota del suelo está compuesta por bacterias, hongos, algas,
protozoarios y virus, los cuales cumplen funciones como la de suministrar
9
directamente nutrientes mediante el proceso de fijación del nitrógeno,
convertir compuestos orgánicos a formas inorgánicas para ser asimiladas,
solubilización de compuestos orgánicos para facilitar su absorción por las
plantas, cambios químicos en compuestos inorgánicos debido a procesos
de oxidación y reducción, aumento del desarrollo radicular en la planta que
mejora la asimilación de nutrientes, reacciones antagónicas y control de
fitopatógenos (Acuña et al., 2002). La importancia de los microorganismos
en ambientes naturales radica en la cantidad, diversidad y en especial su
actividad metabólica, que produce sustancias que inciden en el desarrollo y
nutrición vegetal y en la salud del suelo (Astier et al., 2002).
2.2.1. Microorganismos como indicadores de la calidad del suelo
Un indicador biológico o bioindicador es un organismo o una
comunidad de organismos utilizados para lograr información sobre la
calidad de un ecosistema (p.e., suelo) (Acuña et al., 2006). Esta calidad
puede definirse como la capacidad que tiene el suelo para funcionar como
un sistema vital dentro del ecosistema, manteniendo en forma eficaz las
propiedades del aire, agua y el ambiente, para sostener la productividad
biológica y conservar la salud de las plantas, animales y el hombre (Astier
et al., 2002). Además de los parámetros físico-químicos utilizados para
determinar la calidad del suelo, en la actualidad se cuenta con parámetros
biológicos con potencial indicador como son: la biomasa microbiana,
respiración basal, nitrógeno mineralizable, actividad enzimática, grupos
funcionales, diversidad y abundancia microbiana (Schloter et al., 2003).
La función que realizan los microorganismos en el suelo y en
especial la de algunos grupos específicos que participan en los ciclos
biogeoquímicos pueden mediante sus actividades microbianas,
bioquímicas y enzimáticas jugar un papel fundamental como indicadores
10
de calidad de los suelos, cubriendo un conjunto diverso de mediciones
microbianas (Carrasco, 2003; Acuña et al., 2006). Sin embargo para llevar
a cabo un programa de vigilancia de la calidad de los suelos, estos
indicadores microbianos deberán ser seleccionados con base en la
facilidad de las mediciones, reproducibilidad y sensibilidad hacia el control
de las variables que son claves de la salud de los suelos y ser lo
suficientemente amplios para dar políticas de la situación del medio
ambiente (Astier et al., 2002; Schloter et al., 2003).
Dentro de los indicadores microbianos se incluyen a las bacterias,
hongos y protozoos, puesto que se ha encontrado que estos
microorganismos tienen la habilidad de responder rápidamente a cambios
ambientales, se adaptan con facilidad a las nuevas condiciones del medio
ambiente, presentan cambios en las poblaciones, así como en la actividad
y función que desempeñan. Estas propiedades de los microorganismos se
encuentran relacionadas con alteraciones en las características físicas y
químicas de los suelos, consiguiendo por lo tanto ser utilizados como
excelentes indicadores de cambio en la salud y calidad de los suelos
(Nielsen y Winding, 2002). Los indicadores microbianos se agrupan de
acuerdo a los diferentes parámetros de la salud de los suelos (p.e., la
lixiviación de pesticidas y nitratos a las aguas subterráneas debe estar
compuesta por indicadores microbianos que participan en el ciclo del
nitrógeno), y para la salud general de los suelos se requieren de varios
parámetros como son la biomasa microbiana, actividad y diversidad
(Nielsen y Winding, 2002).
Algunas áreas de investigación ofrecen expectativas para el uso de
las bacterias oxidadoras de amonio (BOA) como organismos indicadores
de procesos en el ciclo el nitrógeno, debido a numerosos estudios han
demostrando relación entre las distintas poblaciones de estas bacterias y
11
las condiciones específicas ambientales (Bruns et al., 1999; Phillips et al
2000; Mintie et al., 2003; Chu et al., 2006). Todas las BOA cambian en la
composición y estructura de sus especies y en su densidad cuando se
presentan alteraciones en su medio ambiente, siendo por lo tanto
postuladas como indicadores biológicos de contaminación y grado de
valoración para la recuperación de tierras de perturbaciones agrícolas
(Kowalchuk y Stephen, 2001). Sin embargo para el desarrollo de la
información sobre los indicadores microbianos seleccionados se debe
incluir investigación referente a variaciones temporales, espaciales y
caracterización de los sitios de muestreo por sus propiedades físicas y
químicas (Nielsen y Winding, 2002).
2.3. Ecorregión Cafetera (EC) de Colombia 2.3.1. Localización geográfica
La Ecorregión Cafetera esta localizada en el centro del país, entre la
vertiente oriental de la cordillera occidental y el valle del río Magdalena. Esta
conformada por 92 municipios, que cubren la totalidad de los departamentos
de Caldas, Risaralda y Quindío, y que incluye una parte de los
departamentos del Valle del Cauca y Tolima. Comprende un área de 28.653
Km² y su población es de 4.1 millones de habitantes (Ministerio del Medio
Ambiente, 2002).
2.3.2. Suelos de la Ecorregión Cafetera
En general, los suelos de la EC presentan características físicas y
químicas que permiten clasificar su fertilidad de moderada a alta (Ministerio
del Medio Ambiente, 2002). Los suelos son provenientes de cenizas
volcánicas, que resultan del movimiento explosivo natural de los volcanes
ubicados en el eje de la cordillera central, entre los departamentos de
12
Tolima, Risaralda y Quindío (Ruiz, 2001). Por esta razón se generan
condiciones ideales para la producción agrícola, presentando los suelos alto
contenido de materia orgánica que garantiza una buena estructura y niveles
importantes de nitrógeno orgánico, favoreciendo el crecimiento y desarrollo
de plantas y microorganismos. La estructura de sus gránulos beneficia el
proceso de aireación y ayuda a retener humedad, teniendo buena
disponibilidad de agua, aun en los periodos de menor precipitación (López,
2001).
Los suelos de la EC especialmente en áreas de los departamentos
de Quindío y Risaralda han experimentado grandes cambios ocasionados
por la disminución de los precios del grano de café y la incidencia de la
broca (Balcazar et el., 1998). Con precios del café por debajo de los costos
de producción, muchos productores diversificaron sus fincas y zonas donde
se tenían grandes extensiones cultivadas de café bajo sombra, han sido
remplazados por monocultivos sin sombra de rendimiento extremo (Toro,
2005). Adicionalmente se han establecido otros cultivos como plátano,
cebolla, cítricos y diversos sistemas productivos, que podrían generar a
futuro la homogenización del paisaje y el cambio climático, afectando a
largo plazo los ecosistemas altoandinos (Nieto y Orozco, 2003).
2.4. Sistemas productivos
Los productores rurales de la EC han establecido sistemas
productivos mixtos (p.e., plátano, cebolla y cítricos) como respuesta a la
crisis en los precios del café (Gonzáles y Escobar, 2005). Otro sistema
productivo encontrado en esta región es la ganadería intensiva de carne y
leche, la cual se realiza en algunos casos a través de sistemas
silvopastoriles, dando origen a esfuerzos decididos para obtener valor
agregado mediante la agroindustria. Con el desarrollo de estos sistemas
13
productivos altamente intervenidos por el hombre se presenta una tendencia
a la perdida de hábitat naturales (Murgueitio, 2003).
El impacto ambiental que ocasionan los sistemas productivos
establecidos en la EC fluctúa entre el deterioro irreversible de los suelos,
hasta la restauración parcial de ecosistemas degradados (Rivera, 2002). Se
presentan alteraciones ambientales como la erosión, compactación del
suelo, uniformidad genética por la utilización de monocultivo y eliminación
de la sucesión vegetal, debido a la implantación de procesos físicos como la
labranza excesiva y químicos utilizando plaguicidas y fertilización con
productos nitrogenados (Rivera, 2002).
2.4.1. Coberturas vegetales
Dentro de los sistemas productivos se han establecido coberturas
vegetales, las cuales pueden ser definidas como la capa de vegetación
natural que cubre la superficie terrestre. Las coberturas presentan diferentes
características ambientales que van desde pastizales hasta las áreas
cubiertas por bosques naturales, incluyendo las coberturas inducidas por la
acción humana, como serian las áreas de cultivo (Alperín et al., 2002). En
las coberturas vegetales se llevan a cabo interacciones entre los factores
bióticos y abióticos que la constituyen, es decir que una cobertura vegetal
es el resultado de la asociación espacio-temporal de elementos biológicos
vegetales característicos, los cuales conforman unidades estructurales y
funcionales (Alperín et al., 2002). Entre las coberturas más representativas
en la EC encontramos:
Pastizal�� Son comunidades vegetales formadas por especies herbáceas
con poca intervención de plantas leñosas bajas, constituyendo el ambiente
natural donde vive una parte considerable de ganado vacuno (Quiceno y
14
Medina, 2006). En Colombia la producción ganadera vacuna
tradicionalmente ha sido una de las principales actividades productivas del
sector agrícola, lo cual obedece en gran parte a las grandes extensiones de
sabanas y bosques con que se cuenta (Murgueitio, 2003). Sin embargo, se
han originado transformaciones de los ecosistemas naturales para obtener
un mayor beneficio en cuanto a su producción, existiendo una conexión
directa e indirecta entre la ganadería y la tala y quema de bosques,
presentando a la ganadería como una gran amenaza ecológica del bosque
tropical (Siavosh et al., 2000).
Las áreas cubierta por pastizales naturales del país, se encuentran
en distintos grados de degradación y pueden considerarse en términos
generales el pisoteo, la defoliación, el retorno de nutrientes por los
animales, la uniformidad genética debido la implantación de monocultivo de
gramíneas, la desecación de humedales y la emisión de gases como los
principales efectos causados en el ecosistema de pastizal por el pastoreo
(Mahecha et al., 2002). En cuanto al reciclaje de nutrientes se refiere, son
evidentes los efectos en la transferencia de nutrientes vegetales en los
potreros debido a los productos excretados por los animales, trayendo como
consecuencia que la mayor parte de estos nutrientes se retorne al pastizal
en forma de heces y orina (Siavosh et al., 2000).
Cafetal sin sombrío: (CFSS). El café es un producto de exportación que
tiene una posición clave en el comercio exterior y por lo tanto una función
central en el desarrollo económico y social del país (Rivera, 2002). Sin
embargo, durante los años setenta, la baja en los precios del café y la
modernización de la agricultura condujo al desarrollo de variedades de café
de alto rendimiento, cultivado a pleno sol y utilizando productos químicos,
con las consecuencias de una biodiversidad decreciente, deforestación
tropical y aumento de la erosión del suelo (Toro, 2005). La ausencia de los
15
árboles de sombra elimina el agregado de material orgánico y de nitrógeno
natural, exigiendo por lo tanto el uso creciente de fertilizantes y pesticidas
en los cultivos sin sombra, presentándose contaminación de los suelos,
aguas y peligro de intoxicación para los seres humanos (Gonzáles y
Escobar, 2005). Además los bosques de montaña que cumplen un papel
fundamental para la conservación de los depósitos de agua en las zonas
poblacionales, están siendo reemplazados por plantaciones de
monocultivos de café (Rivera, 2002).
Bosque: Los bosques son áreas naturales que presentan elementos
arbóreos en un espacio entre el 30% y 100% de la cobertura vegetal, juegan
un importante papel ecológico al proteger el medio ambiente, la calidad del
agua y las especies silvestres (De Alburquerque et al., 2000). Los bosques
se caracterizan por la presencia de varios estratos, que van desde uno
inferior de plántulas, plantas de bajo porte y herbáceas, hasta un estrato
formado por árboles de gran altura (Yara y Roa, 2002). Sus principales
funciones corresponden a la protección, producción y regulación de
procesos climáticos en los ecosistemas.
En Colombia tienden a decrecer las áreas de bosques naturales
debido a la falta de inversión y en algunos casos, a la ausencia total de
acercamiento entre comunidades dueñas de estos recursos y el sector
productivo (Yara y Roa, 2002), considerando el bosque como una fuente de
madera, despreciado los procesos que él alberga y la gran variedad de
alternativas de vida que ofrece: equilibrio biológico, alimento, medicinas y
recreación (Daily et al., 1997; Yara y Roa, 2002).
Guadual: La guadua es un bambú leñoso que pertenece a la familia de las
gramíneas, se encuentra distribuida en América Latina, siendo muy común
en la EC. Se han identificando dos variedades: La Guadua angustifolia
16
bicolor y Guadua angustifolia Nigra (Colorado, 2002). Esta cobertura esta
localizada como relictos en zonas protegidas, porque evita la movilización
de tierra y conserva efectivamente los suelos. Su siembra es ideal en sitios
expuestos a deslizamientos, erosión y derrumbes (Held y Manzano, 2004).
La guadua es utilizada como materia prima en el sector de la
construcción y se emplea en la fabricación de muebles, artesanías, pisos y
molduras (Held y Manzano, 2004). Se trata de un recurso sostenible y
renovable porque no necesita de semilla para reproducirse, tiene además
alta velocidad de crecimiento, en sólo 6 meses puede obtener su altura total
de ~30 m, hecho muy importante si se tiene en cuenta que uno de los
problemas para la siembra de especies maderables y reforestación, es el
tiempo extremadamente largo que se requiere para la obtención de
resultados (Colorado, 2002). Sin embargo en los últimos años, la tala
indiscriminada y la destrucción de los bosques ha tocado también a los
guaduales y su extensión se ha visto críticamente disminuida (Held y
Manzano, 2004).
Forestales: Comprende los bosques naturales o áreas dominadas por
árboles y plantaciones. La cobertura forestal esta formada de superficies
cubiertas con una sola especie de árbol o arbusto (autóctono o exótico) de
ciclo corto y edad uniforme, los cuales protegen al suelo de fenómenos de
perdida de sus horizontes (Herruzo, 2000). La cobertura forestal
proporciona diversos bienes siendo un componente esencial del paisaje
natural y de áreas de recreo. A nivel global juegan un papel importante en la
fijación del CO2 y su importancia actual desde el punto de vista económico,
radica fundamentalmente en la oferta del recursos maderables y en el
mantenimiento de la diversidad (Yara y Roa, 2002).
17
Colombia cuenta con una extensión continental de 1,140,000 Km2, de
los cuales 640,000 Km2 están cubiertas por bosques naturales, siendo los
departamentos de Caldas, Risaralda y Quindío, zonas de gran actividad
forestal (Espinal et al., 2005). Sin embargo, acciones como la colonización,
la ampliación de la frontera agrícola, la siembra de cultivos ilícitos y el
consumo de leña para usos energéticos han generado una amenaza ante el
patrimonio forestal del país (Espinal et al., 2005).
Cebolla: La cebolla larga (Allium fistulosum) o Junca, como se le conoce;
está definida como un cultivo agrícola de gran importancia en la EC,
especialmente en el departamento de Risaralda (Castellanos, 1990). En la
actualidad, dado el buen precio de venta, los productores han recuperado
áreas que habían dejado de producir, ampliando la frontera agrícola,
sembrando en suelos que se tenían para conservación o para la explotación
de otros cultivos (Castellanos, 1990). La cebolla larga es catalogada como
un monocultivo que demanda un suministro constante de agua y, aunque es
resistente a las sequías, la carencia de ella altera su normal desarrollo. La
base de la fertilización del cultivo se fundamenta en la aplicación de abono
orgánico de origen animal y fertilizantes químicos de compuestos
nitrogenados (Castellanos, 1990).
2.5. El nitrógeno
El nitrógeno es un elemento muy abundante en la naturaleza,
constituye el 78% del aire de la atmósfera y se encuentra en estado
gaseoso (Atlas y Bartha, 2002). El nitrógeno es indispensable para todos
los organismos ya que es un componente esencial de los aminoácidos, los
ácidos nucleicos, aminoazucares y proteínas (Pacheco et al., 2002), existe
en forma orgánica e inorgánica y en diferentes estados de oxidación
(Tabla 2).
18
Los animales, las plantas y todos los microorganismos necesitan
formas de nitrógeno para incorporarlo a su biomasa. Sin embargo, el
nitrógeno molecular (N2) es inaccesible para la mayor parte de los
organismos y no puede ser usado como fuente de nitrógeno, siendo
necesario una gran cantidad de energía para romper su triple enlace
(Pacheco et al., 2002). Esta ruptura puede hacerse por dos mecanismos:
Las descargas eléctricas y la fijación biológica. Las descargas eléctricas
son un mecanismo natural que produce la ruptura del triple enlace de la
molécula nitrógeno, y la fijación biológica es un proceso llevado a cabo
por microorganismos, particularmente bacterias de vida libre y géneros de
bacterias que forman asociaciones mutualistas con las plantas (Ferrari y
Wall, 2004).
Tabla 2. Estados de oxidación de compuestos nitrogenados
Nombre Compuesto Estado de oxidación
Nitrógeno orgánico (R-NH2) -3
Amoniaco (NH3) -3
Nitrógeno gaseoso (N2) 0
Oxido nitroso (N2O) +1
Oxido nítrico (NO) +2
Nitrito (NO2-) +3
Nitrato (NO3-) +5
Tomado de: Pacheco et al., 2002
2.5.1. Ciclo del nitrógeno
El movimiento del nitrógeno a través de los distintos ecosistemas
es controlado en gran medida por la actividad de los microorganismos,
debido a su ubicuidad, capacidad metabólica diversa y tener altas tasa de
19
actividad enzimática, afectando la distribución de compuestos
nitrogenados en el medio ambiente (Atlas y Bartha, 2002).
Las diversas transformaciones del nitrógeno están descritas en su
ciclo, el cual permite el movimiento del nitrógeno a través de los
ambientes acuáticos, terrestres, aerobios y anaerobios determinando la
productividad ecológica. Las etapas principales que componen el ciclo del
nitrógeno son: fijación, asimilación, mineralización, nitrificación y
desnitrificación (Figura 1).
Figura 1. Ciclo del nitrógeno. Tomado de: Paredes et al., 2007.
Fijación: Proceso en el cual el N2 es reducido en amonio, siendo la única
manera como los organismos pueden asimilarlo en forma de aminoácidos
NO3 -
NO2 -
NH4+
N2
Fijación N2
Desnitrificación
Nitrógeno orgánico
Mineralización
Reducción asimilatoria del nitrato
Nitrificación Nitrosomona Nitrosococcus
Nitrificación Nitrobacter Nitrococcus
Azotobacter Rhizobium Industrial
Pseudomonas paracoccus denitrificans
+ N2O
Anammox
Amonificación del nitrato
20
y formar proteínas (Ferrari y Wall, 2004). En los hábitat terrestres la
fijación del nitrógeno es llevada a cabo por bacterias de vida libre
asociadas a la rizosfera y por género de bacterias que fijan el nitrógeno a
través de procesos metabólicos, creando una relación de simbiosis y
viviendo en los nódulos de las plantas, especialmente las leguminosas
(Atlas y Bartha, 2002). Esta fijación simbiótica de nitrógeno es llevada a
cabo principalmente por bacterias del género Rhizobium, representando
la mayor contribución de nitrógeno combinado (Ferrari y Wall, 2004). En
el proceso de fijación del nitrógeno interviene el complejo enzimático
nitrogenasa, que consta de dos proteínas, una que contiene hierro y
molibdeno y otra que solamente contiene hierro (Madigan et al., 2004).
Asimilación: El amonio usualmente es asimilado por numerosas plantas y
microorganismos que lo incorporan rápidamente en su biomasa en forma de
aminoácidos, ácidos nucleicos y otros compuestos orgánicos (Atlas y
Bartha, 2002).
Mineralización: Proceso donde se origina descomposición de la materia
orgánica. El nitrógeno de las proteínas y otros compuestos presentes en la
materia orgánica son convertidos en amonio o amoniaco, siendo esta forma
asimilable por las plantas y microorganismos (Pacheco et al., 2002). Tanto
organismos aerobios como anaerobios llevan a cabo el proceso de
mineralización utilizando la energía derivada del carbono contenido en la
materia orgánica descompuesta (Lucas, 1998). Generalmente el material
que se descompone con mayor rapidez es la materia orgánica soluble con
estructuras moleculares simples, las plantas leguminosas jóvenes y los
residuos con alto contenido de nitrógeno. Es muy importante la
mineralización orgánica del nitrógeno para que los ecosistemas se
mantengan en constante producción (Lucas, 1998).
21
Nitrificación: Es el principal proceso aerobio en el ciclo del nitrógeno,
consiste en la oxidación del amoniaco y sus iones a nitratos (Balows et al.,
2001). La nitrificación es llevada a cabo en dos etapas y catalizada por
dos grupos de bacterias filogenéticamente distintas. Las bacterias
oxidadoras de amonio (BOA), realizan la oxidación del amoniaco a nitrito,
en la primera etapa del proceso (Mota et al., 2005) y las bacterias
oxidadoras de nitritos (BON), oxidan el nitrito a nitrato, en la segunda
etapa del proceso (Sinha y Annachhatre, 2007). Recientes estudios
metagenómicos han demostrado la existencia de un grupo de Archeas
distribuidas en sedimentos, suelo y ecosistemas acuáticos, capaces de
llevar a cabo también la oxidación de amonio hasta nitrito. Presentando
genes homólogos para aquellos que codifican a la enzima amoniaco
monooxigenasa de las BOA, enzima funcional necesaria para llevar a
cabo la primera etapa de la nitrificación (Chen et al., 2008; Tourna et al.,
2008).
Desnitrificación: Proceso en el cual las bacterias heterótrofas
facultativas reducen formas oxidadas de nitrógeno como nitrato (NO3-) y
nitrito (NO2-) en nitrógeno (N2) y en menor medida en gas óxido nítrico
(NO)2 y óxido nitroso (N2O). Las bacterias, que intervienen en el proceso
utilizan el nitrato como aceptor final de electrones para su respiración
(Paredes et al., 2007).
2.5.2. Características fisiológicas y metabólicas de las bacterias
nitrificantes
Gracias a los estudios realizados por el microbiólogo Sergei
Winogradsky utilizando medios de cultivos enriquecidos para el
aislamiento de bacterias del suelo se conoce la fisiología celular de las
bacterias nitrificantes (Madigan et al., 2004). Estas bacterias son Gram
22
negativas, quimiolito-autótrofas, aerobias obligadas, aunque algunas
especies pueden tolerar bajas concentraciones de oxígeno (Horst et al.,
2004). Este grupo bacteriano es capaz de fijar autotroficamente el CO2,
acoplado a la oxidación de un compuesto inorgánico (Balows et al., 2001).
La nitrificación en la naturaleza es llevada a cabo en dos etapas, en la
primera participan las BOA, las cuales tienen la habilidad de utilizar el
amonio, como única fuente de energía y oxidarlo hasta nitrito, también
necesitan dióxido de carbono (CO2), como fuente de carbono y oxigeno
como aceptor final de electrones (Balows et al., 2001). Estas bacterias se
encuentran en ambientes aerobios donde esta disponible el amoniaco a
través de la mineralización de la materia orgánica, o por fuentes
antropogénicas como los fertilizantes (Sinha y Annachhatre, 2007).
Las BOA requieren de oxígeno molecular para llevar a cabo la
oxidación quimiolitotrofica del amoniaco, y necesitan la intervención de
dos enzimas: La amoniaco monooxigenasa, que es una proteína de
membrana que usa NADH como donador de electrones (Mota et al.,
2005). El primer producto en la oxidación del amoniaco es la hidroxilamina
(Ecuación 1). En esta fase no se genera energía. Posteriormente la
hidroxilamina es oxidada hasta nitrito, por acción de la enzima
hidroxilamina oxidoreductasa, proteína periplasmica (Ecuación 2). En esta
etapa se produce ATP (Sinha y Annachhatre, 2007).
NH3 + O2 + 2H+ + 2e- amoníaco monooxigenasa NH2OH + H2O (Ec 1) NH2OH + H2O hydroxylamina oxidoreductasa HNO2 + 4H+ +4e- + ATP (Ec 2) Utilizando la secuenciación del gen rRNA 16S se conoce que todas las BOA
aisladas se restringen a dos linajes evolutivos distintos de la clase
proteobacteria (Kowalchuk y Stephen, 2001). Además material genético
23
aislado de suelo y agua dulce, pertenecen a un solo grupo evolutivo
(monofiletico) dentro de la subclase � proteobacteria, proporcionando
evidencia de un único ancestro quimiolitoautotrofico oxidador de amonio
(Carney et al., 2004; Chu et al., 2006). Dentro de este linaje se conocen los
géneros: Nitrosomonas con Nitrosococcus mobilis, Nitrosospira,
Nitrosolobus y Nitrosovibrio, reclasificándose estos tres últimos géneros en
el género Nitrosospira (Kowalchuk y Stephen, 2001; Calvo, 2005). Las
únicas bacterias oxidadoras de amonio que no hacen parte de la clase �
proteobacterias son Nitrosococcus oceani y Nitrosococcus halophilus que
pertenecen a la clase � proteobacterias (Sinha y Annachhatre, 2007).
Recientemente se conoce una nueva vía de oxidación del amonio, llamada
anammox. En esta vía las bacterias utilizan el nitrito como aceptor final de
electrones y anaeróbicamente es convertido el amonio y el nitrito en
nitrógeno gaseoso, utilizando el CO2 como fuente de carbono. Bacterias del
genero Planctomycetes realizan este proceso teniendo a Brocadia
anammoxidans como especie importante (Paredes et al., 2007).
La segunda etapa de la nitrificación es llevada a cabo por las BON,
las cuales pueden definirse como un grupo de microorganismos que se
caracterizan por su habilidad de utilizar el nitrito como fuente de energía, y
el CO2, como fuente de carbono, alternativamente son litoautotróficos
facultativos ya que pueden crecer en medios mixotropicos (Balows et al.,
2001). La oxidación de nitrito a nitrato, requiere una única etapa y es
llevada a cabo por el sistema nitrito oxidoreductasa (Ecuación 3), en la
que los electrones son transportados hacia el oxígeno, a través de los
citocromos, generándose ATP (Balows et al., 2001).
NO2 - + H2O Nitrito oxidoreductasa NO3
- + 2H+ + 2e- (Ec 3)
24
Especies del genero Nitrobacter pertenecen a la subdivisión � de la
clase proteobacterias. En la naturaleza se encuentran junto a las BOA, y
se refieren como bacterias nitrificantes de la familia nitrobacteriaceae,
pero filogenéticamente no se encuentran relacionadas (Sinha y
Annachhatre, 2007).
2.5.3. Factores que afectan la nitrificación
La tasa de nitrificación en los suelos es dependiente de la
temperatura, contenido de agua, concentración de oxigeno, pH,
disponibilidad de amonio y materia orgánica (Sinha y Annachhatre, 2007).
El proceso de nitrificación requiere la presencia del oxígeno, por
consiguiente sucede solamente en ambientes aerobios, como las aguas
que circulan o en las capas de la superficie de los suelos y sedimentos.
La supervivencia de las bacterias nitrificantes en ambientes donde hay
concentraciones bajas de oxígeno dependerá de su capacidad para
competir con las raíces de las plantas y con organismos heterótrofos
(Lata et al., 2004).
Las bacterias nitrificantes se mantienen activas aun en condiciones
secas, pero pasan a ser inactivas en suelos saturados con agua, debido
a que estos sitios no contienen suficiente oxígeno disuelto (Cabrera,
2007). En cuanto al pH, la nitrificación se presenta en un rango
comprendido entre 4.5 y 9.0. Sin embargo, las condiciones óptimas para
el proceso de nitrificación ocurren alrededor de pH 7.6-8.0 (Balows et al.,
2001). El pH afecta la actividad enzimática de las bacterias nitrificantes,
lo que provoca pérdidas en la actividad de las células (Yuan et al., 2005).
Por lo general la tasa de nitrificación es baja en suelos ácidos,
posiblemente por encontrarse niveles elevados de aluminio, o por
concentraciones altas de óxido nitroso (Cabrera, 2007).
25
El crecimiento de las bacterias nitrificantes varía con la
temperatura, cuyo valor óptimo se sitúa en el rango de 20-30oC. La
nitrificación ocurre lentamente a temperaturas bajas, y se incrementa a
medida que la temperatura aumenta en el suelo, por encima de 30°C se
presenta inhibición del proceso (Pacheco et al., 2002). La disponibilidad
de amonio, también es un regulador importante en el proceso de
nitrificación, y se señala como factor limitante de la nitrificación junto con
la velocidad de mineralización (Lucas, 1998; Sinha y Annachhatre, 2007).
2.5.4. Características fisiológicas y metabólicas las bacterias
desnitrificantes
La desnitrificación es llevada a cabo por bacterias aerobias
facultativas y heterótrofas, muchas de las cuales pueden alternar la
respiración utilizando O2 o NO3- como aceptores de electrones. Son un
grupo común de proteobacterias Gram negativas como las Pseudomonas,
Paracocus y Thiobacillus, se incluyen algunas bacterias Gram positivas,
como los Bacillus (Groffman et al 1992; Heylen et al., 2005).
El nitrato es el aceptor común en la respiración anaerobia, y las
bacterias desnitrificantes lo utilizan para su respiración, produciendo
nitrógeno gaseoso, y en menor medida gas óxido nitroso. Este mecanismo
también es conocido como reducción desasimilatoria del nitrato (Atlas y
Bartha, 2002). Se conocen dos tipos de reducción desasimilatoria del
nitrato, diversas bacterias anaeróbias facultativas (p.e., Aeromonas,
Nocardias, Alcaligenes) reducen el nitrato a nitrito en condiciones
anoxicas y lo excretan. Por otro lado el NO3- puede ser reducido hasta
amonio por la vía de la hidroxilamina (amonificación del nitrato) sin
producción de nitrógeno gaseoso (Atlas y Bartha, 2002).
26
En la desnitrificación la ruta de reducción del nitrato es más
compleja y les permite a los organismos obtener energía convirtiendo este
compuesto a nitrógeno molecular. La enzima responsable del primer paso
en la reducción del nitrato, es la nitrato reductasa, enzima que contiene
molibdeno como cofactor y se encuentra unida a membrana (Enwall et al.,
2005). El primer producto de la reducción del nitrato es el nitrito,
posteriormente el nitrito se reduce secuencialmente a óxido nítrico (NO)2,
óxido nitroso (N2O) y gas (N2) (Campell, 1999; Balows et al., 2001) (Tabla
3).
Tabla 3. Enzimas y reacciones que la catalizan
NO3- +2e- + 2H+ Nitrato reductasa NO2
-
NO2-+ e- + 2H+ Nitrito reductasa NO + H2O
2NO + e- + 2H+ Oxido nítrico reductasa N2O + H2O
N2O +2e- + 2H+ Oxido nitroso reductasa N2 (g) + H2O
Tomado de: Atlas y Bartha, 2002
2.5.5. Factores que afectan la desnitrificación
La desnitrificación es un proceso de respiración anaerobia, donde
las enzimas que intervienen son afectadas de forma diferencial por la
presencia del oxígeno (Bergsma et al., 2002). La nitrito reductasa es la
más sensible a la presencia del oxígeno de todas las enzimas implicadas
en el proceso (Paredes et al., 2007).
27
La desnitrificación ocurre generalmente en suelos con alto
contenido de materia orgánica, buena disponibilidad de nitratos y en
condiciones de encharcamiento, y se acentúa a medida que aumenta la
temperatura (White y Reddy, 2002). Este proceso es sensible a pH acido,
teniendo un rango optimo entre 7.0 y 8.2, que coincide con la máxima
actividad bacteriana (Pacheco et al., 2002).
2.5.6. Problemas asociados a la nitrificación y desnitrificación
La necesidad de alimentos para la creciente población humana
significa una presión sobre el uso del suelo, por tal motivo abonos ricos en
nitrógeno, se aplican extensivamente para obtener un aumento de la
productividad de los cultivos. Sin embargo, la utilización adecuada de
dichos abonos debe tener en cuenta ciertos aspectos como la solubilidad
del fertilizante, la lixiviación de la forma química aplicada y la tasa de
actividad microbiana en el ciclo biogeoquímico del nitrógeno (Frioni, 1999;
Pacheco et al., 2002).
A pesar de que la nitrificación es un proceso que ocurre en forma
natural, puede tener consecuencias negativas en muchos ecosistemas
que han sido expuestos a altas concentraciones de compuestos
nitrogenados. Esto se debe a que la transformación de iones de amonio a
nitritos y nitratos provoca un cambio en la carga de la molécula, que de
positiva pasa a ser negativa (Atlas y Bartha, 2002). Los iones de amonio
cargados positivamente se unen a partículas orgánicas del suelo que tiene
carga negativa, esta adhesión previene que el nitrógeno en forma de
amonio sea lixiviado del suelo por las lluvias. Por otro lado, el ión de
nitrato (NO3-) con carga negativa no se mantiene en las partículas del
suelo y puede ser barrido a través de sus horizontes, esto lleva a una
28
disminución de su fertilidad y a un enriquecimiento de nitrato de las aguas
corrientes de la superficie y del subsuelo (Kowalchuk y Stephen, 2001).
En las aguas superficiales, el nitrógeno añadido provoca
enriquecimiento excesivo de nutrientes, particularmente en las aguas
costeras que reciben afluencia de los ríos contaminados. A este
enriquecimiento excesivo de nutrientes, se le conoce como eutroficación y
puede ser causante del aumento en la frecuencia de peces muertos en la
costa, del florecimiento de algas y de cambios en las especies dentro del
ecosistema de la costa. El nitrógeno reactivo (NO3- y NH4
+) que se
encuentra en suelos superficiales, puede ingresar en la atmósfera como el
componente del contaminante óxido nítrico y el gas de invernadero óxido
nitroso (Panek et al., 2000). A la emisión de óxido nitroso se le
responsabiliza parcialmente de inducir el calentamiento global de la tierra,
provocar disminución de la capa de ozono y ser un gas de permanencia
prolongada en la atmósfera (Holtgrieve et al., 2005).
La presencia de altas concentraciones de nitrito y nitrato en las
aguas subterráneas ocasiona un serio problema de salud pública. El nitrito
puede ser tóxico para los humanos, dado que se combina con la
hemoglobina bloqueando el intercambio normal de gases con oxígeno, y
el nitrato puede originar metahemoglobinemia, siendo la población infantil
la mas afectada ya que poseen un sistema enzimático deficiente,
pudiendo ocasionar enfermedades como el síndrome del bebé azul
(Pacheco et al., 2002). Los nitritos además pueden reaccionar con
compuestos aminados y formar nitrosaminas que tienen propiedades
cancerigenas (kolwachuk et al., 2001).
29
2.6. Uso de agroquímicos
Los servicios de los ecosistemas están siendo alterados debido a una
gran variedad de actividades humanas, entre las que se destaca el uso
inadecuado de agroquímicos (Gonzáles y Escobar, 2005). Los agroquímicos
son productos complejos de síntesis química, utilizados en el sector
agropecuario, los cuales se clasifican de acuerdo con su uso en dos
grandes tipos: Los fertilizantes que proporcionan macro y micro elementos
para la nutrición vegetal y los plaguicidas, usados para combatir insectos,
enfermedades producidas por hongos, bacterias y la proliferación de plantas
arvenses (Nivia, 2005).
Los fertilizantes al ser elaborados específicamente como nutrientes
pueden no ser totalmente absorbidos por las plantas y ser removidos del
suelo cuando llueve o se riega el terreno. Estos fertilizantes son llevados
hacia el agua subterránea mediante la lixiviación, o transportados por la
escorrentía hacia los cuerpos de agua como quebradas, ríos o lagos
(Gonzáles y Escobar, 2005).
Los plaguicidas generan contaminación que pueden afectar a los
ecosistemas, causando disminución de la biodiversidad y fertilidad de los
suelos. Entre los plaguicidas sintéticos están los hidrocarburos clorados
como el DDT, dieldrín, aldrín, heptacloro, clordano y el lindano (Nivia, 2005).
El problema de la contaminación por plaguicidas es cada vez más grave,
tanto por la cantidad, diversidad y persistencia de algunos plaguicidas en el
medio ambiente, como por la resistencia a ellos que adquieren algunas
especies, lo que ocasiona que se requiera cada vez mayor cantidad del
plaguicida para obtener el efecto deseado en las plagas (Farrera, 2004).
Cuando ambos tipos de agroquímicos son adicionados en forma
30
inadecuada pueden afectar directamente la salud de los agricultores y los
pobladores rurales, así como la calidad del suelo y del agua (Farrera, 2004).
2.7. Métodos dependientes de cultivo para el estudio de la
abundancia microbiana
Los microorganismos del suelo tienen gran importancia para
mantener la vida en nuestro planeta, y el estudio de su abundancia y
diversidad son primordiales para comprender su función en los distintos
ecosistemas. Por lo tanto métodos para detectar, identificar y cuantificar
estos microorganismos son necesarios para el análisis de comunidades
microbianas en muestras ambientales (Acuña et al., 2006
Tradicionalmente los estudios para determinar abundancia y
diversidad bacteriana en diferentes ambientes se han basado en técnicas
dependientes de cultivo que permiten recuperar la mayor parte de los
microorganismos de una muestra. Sin embargo, únicamente entre el 0.1 y el
10% de las bacterias del ambiente son cultivables, debido muchas veces a
que se desconocen los requerimientos nutricionales y las condiciones
fisicoquímicas para el desarrollo de grupos microbianos en su ambiente
natural (Nogales, 2005). A pesar de esto, las técnicas dependientes de
cultivo se siguen utilizando y son de gran ayuda para el conocimiento de las
características fisiológicas y fenotípicas de las bacterias, constituyendo un
importante paso en la identificación y estudio de la abundancia de los
microorganismos, ofreciendo un buen indicador para una activa población
bacteriana en los suelo (Acuña et al., 2006).
Entre los métodos tradicionales de cultivo se encuentra la
identificación microscópica de las células bacterianas sobre la base de
criterios morfológicos, y para la cuantificación son realizadas diluciones de
una muestra y sembradas en medio sólido para posteriormente contar las
31
unidades formadoras de colonias (UFC). Alternativamente la técnica del
número más probable (NMP) es muy utilizada para estimar densidad
bacteriana de muestras ambientales, y consiste en la determinación de la
presencia o ausencia de microorganismos en alícuotas individuales de cada
una de varias diluciones consecutivas del suelo, dada la capacidad que
tienen los microorganismos de producir transformaciones en el medio de
cultivo (Nielsen y Winding, 2002). En la actualidad los métodos
dependientes de cultivo se favorecen con el conocimiento recolectado sobre
la ecología de los microorganismos, permitiendo diseños mas adecuados
para las condiciones de cultivo (Nogales, 2005).
32
3. JUSTIFICACIÓN
En la Ecorregión Cafetera se ha propiciado el máximo crecimiento
económico del país, al concentrar el mayor desarrollo industrial y urbano
debido a la productividad de sus suelos, abundancia de recursos hídricos y
a su variedad de climas. Sin embargo, este crecimiento económico ha
generado procesos de degradación del ambiente causando perdidas en la
biodiversidad y alteraciones en el suelo, originando su contaminación y
deterioro progresivo. La producción agrícola, ofrece beneficios económicos
al país, pero genera impactos adicionales sobre el suelo en prácticas tales
como el monocultivo y los de escasa rotación. El monocultivo en grandes
extensiones, causa erosión del suelo, remplaza los ecosistemas diversos y
beneficia la aparición de plagas, favoreciendo la presencia de determinados
organismos. Mientras que la ausencia de rotación de cultivos ocasiona una
mayor demanda de nutrientes, que es controlada mediante el uso intensivo
de agroquímicos.
Teniendo en cuenta que las prácticas agrícolas tradicionales y
modernas se basan en la utilización de compuestos nitrogenados, abonos
ricos en este elemento son aplicados en forma extensiva en los suelos de la
EC para aumentar la productividad de los cultivos, pero pueden llevar
asociado graves problemas ambientales, deterioro del suelo y riesgos para
la salud.
Las bacterias nitrificantes del suelo transforman el amonio de los
abonos en nitritos y nitratos produciendo rápidamente acidificación de los
suelos. Estos aniones son lixiviados hasta las aguas subterráneas,
representando una pérdida importante de nitrógeno del suelo, donde es
necesario para el crecimiento y desarrollo de microorganismos y plantas
superiores. Adicionalmente la presencia de altas concentraciones de nitritos
33
y nitratos en los suministros de agua potable es preocupante ya que los
nitritos reaccionan químicamente con grupos aminos, formando
nitrosaminas, compuesto con propiedades altamente cancerígenas. Los
nitratos originan problemas respiratorios especialmente en los niños
causando el síndrome del bebe azul. Finalmente el retorno del nitrógeno a
la atmósfera mediante el proceso de desnitrificación puede ocasionar una
pérdida de este elemento, por lo que resulta ser un proceso perjudicial para
la actividad agrícola y el medio ambiente, si se presenta en forma extensiva
en la naturaleza.
Por tales razones en los últimos años la identificación de estos
problemas ha hecho necesario la realización de varios proyectos de
investigación y conservación del ambiente con el fin de mejorar la calidad
de vida de las poblaciones que habitan en la EC y permitir el uso racional
de los recursos naturales y los servicios ambientales. Uno de estos
proyectos es desarrollado por el Centro de Excelencia de Investigaciones
y Estudios en Biodiversidad y Recursos genéticos (CIEBREG), con el
apoyo del Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la
Tecnología (COLCIENCIAS). El programa que está desarrollando el
CIEBREG es la valoración de bienes y servicios ambientales de la
biodiversidad para el desarrollo sostenible de paisajes rurales
Colombianos, Complejo Ecorregional Andes del Norte (CEAN), y dentro
de sus objetivos específicos está el de caracterizar, evaluar y monitorear
la biodiversidad de paisajes naturales asociada a sistemas productivos
para el mantenimiento de la funcionalidad ecológica.
Son parte de este Centro de Excelencia la Unidad de Saneamiento y
Biotecnología Ambiental (USBA) y la Unidad de Ecología y Sistemática
(UNESIS) de la Pontificia Universidad Javeriana, los cuales para llevar a
cabo parte de este proyecto de investigación necesitan de indicadores
que permitan evaluar la salud del suelo. Por tal razón las bacterias
34
nitrificantes y desnitrificantes fueron seleccionadas como posibles
bioindicadores, para monitorear el efecto de usos de suelo en diferentes
coberturas vegetales en la EC sobre la densidad de estas bacterias. La
selección se realizó debido a que las bacterias nitrificantes y
desnitrificantes se caracterizan por estar presentes en diversos
ecosistemas como suelo y aguas, ser fundamentales en el ciclo del
nitrógeno y que su actividad enzimática es sensible y puede alterarse por
cambios ambientales.
A pesar que el aislamiento, crecimiento y mantenimiento de cultivos
puros de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en el laboratorio es difícil
y requieren largos periodos de tiempo, es importante realizar estudios
sobre su fisiología, función, estructura y abundancia. Estos aspectos
pueden ser alterados cuando se presentan cambios en las funciones
normales del ecosistema y por lo tanto ser utilizados, como posibles
indicadores de perturbaciones ambientales y antropogénicas.
35
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Evaluar el efecto de usos de suelo en la Ecorregión Cafetera de Colombia
sobre la densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes
4.2. Objetivos específicos
Establecer las condiciones óptimas de cultivo para el crecimiento de
bacterias nitrificantes y desnitrificantes.
Determinar y comparar la densidad de bacterias nitrificantes y
desnitrificantes presentes en las coberturas de la Ecorregión Cafetera
Evaluar el efecto de algunos parámetros fisicoquímicos del suelo sobre la
densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes.
36
5. MATERIALES Y MÉTODOS
En el presente estudio se evaluó el efecto de usos de suelo en la
Ecorregión Cafetera de Colombia, sobre la densidad de bacterias
nitrificantes y desnitrificantes.
Para estimar la densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes
del suelo, se utilizó la técnica del número más probable (NMP). Esta técnica
es la más reportada en la literatura para este tipo de bacterias por la
dificultad de realizar conteos en placa estimando las unidades formadoras
de colonia y por su lento crecimiento. De igual forma se evaluó el efecto de
algunos parámetros físico-químicos del suelo: pH, porcentaje de humedad,
temperatura y concentración de nitratos sobre la densidad de estas
bacterias. Las muestras del suelo fueron procesadas en el laboratorio de la
Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) de la Pontificia
Universidad Javeriana (PUJ).
5.1. Selección de las condiciones óptimas para el crecimiento y
cuantificación de bacterias nitrificantes.
Inicialmente, se seleccionó el medio de cultivo más apropiado para el
crecimiento BOA y BON, identificando las condiciones adecuadas y
teniendo en cuenta los parámetros reportados por algunos autores en la
literatura científica (Tabla 4). Para la selección de las condiciones de cultivo
se evaluaron dos fuentes de carbono: bicarbonato de sodio NaHCO3 (0.125
g/l) y carbonato de calcio CaCO3 (5.0 y 1.0 g/l), y concentraciones de sulfato
de amonio (NH4)2SO4 (0.5 y 0.13 g/l) y nitrito de sodio NaNO2 (2.0 y 0.035
g/l), como fuente de energía. De igual forma, se evaluaron el volumen del
medio de cultivo mineral en el NMP, las condiciones de temperatura, tiempo
y humedad durante la incubación para favorecer el crecimiento y evitar
37
evaporación de las muestras por el tiempo prolongado de incubación. Para
la evaluación de los diferentes parámetros se utilizaron los suelos de las
coberturas vegetales del primer evento de muestreo en la ventana La Vieja.
Tabla 4. Medios de cultivo reportados en la literatura para el crecimiento
de bacterias nitrificantes.
Bacterias Nitrificantes Condiciones para el
crecimiento Bacterias Oxidadoras de Amonio (BOA)
Bacterias Oxidadoras de Nitritos (BON)
CaCO3 5.0 0.003 1.0 Fuente de carbono
(g/l) NaHCO3 0.125 0.125 0.125
(NH4)2SO4 0.5 0.13 0.5 Fuente de energía
(g/l) NaNO2 2.0 0.035 0.035
K2HPO4 0.087 0.2 Fosfatos (g/l) KH2PO4 0.2 0.2 0.15 0.1 0.1
CaCL2*2H2O 0.0205 0.02 0.0134 0.02 0.02
MgSO4*7H2O 0.04 0.2 0.04 0.05 0.04 0.04 Sales
minerales (g/l)
NaCl2 0.5 0.5 0.5
Indicador (g/l) Rojo de fenol 0.0001 0.0001 0.0001
Autores
Aakra et al., 1999
Calvo, 2005
Ballows et al., 2001
Rajapasksha,1997
Ballows et al., 2001
Stienstra et al., 1993
Verhagen y
Laanbroek 1991
5.2. Selección de las condiciones óptimas para el crecimiento y
cuantificación de las bacterias desnitrificantes.
Para la selección de las condiciones óptimas en el cultivo de
bacterias desnitrificantes se tuvo en cuenta lo reportado por algunos
autores en la literatura científica (Tabla 5). Durante el proceso de
respiración de las bacterias desnitrificantes es muy importante la fuente de
38
carbono a utilizar en la preparación del medio de cultivo, con el fin de evitar
acumulación de productos intermediarios como nitritos que ocasionan
inhibición del crecimiento bacteriano (Heylen et al., 2005). Por esta razón
se evaluaron: etanol (1.0 g/l) acido glutámico (1.7g/l) y acetato de sodio (1
g/l), como fuentes de carbono. Se adicionó al medio de cultivo KNO3 (2.0
g/l) como aceptor final de electrones (Marazioti et al., 2002; Casasus et al.,
2005).
Tabla 5. Medios de cultivo reportados en la literatura para el crecimiento
de bacterias desnitrificantes.
Condiciones para el
crecimiento
Bacterias Desnitrificantes
Acetato de Na 1.0 1.0 1.0
Etanol 1.0 Fuente de carbono
(g/l) Acido
glutámico 1.7 1.7
(NH4)2SO4 1.0 Fuente de nitrógeno
(g/l) (NH4)CL 1.0 1.0 1.0
CaCL2*2H2O 0.026 0.02 0.026 0.05
MgSO4*7H2O 0.2 0.2 0.2 0.025 Sales
minerales (g/l)
NaCl2 1.0 1.0 1.0 1.0
K2HPO4 5.0 5.0 1.0 Fosfatos (g/l) KH2PO4 1.5 1.5
Elementos trazas (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0
Aceptor de electrones
(g/l) KNO3 2.0 2.0 1.8 1.0
Autores Casasus et al., 2005
Heylen et al., 2005
Mariazioti et al., 2002
Firth y Edwards,
1999
39
5.3. Determinación de la densidad de bacterias nitrificantes y
desnitrificantes en las coberturas seleccionadas de la EC
5.3.1. Área de estudio.
El sitio de estudio se localizó en las cuencas hidrográficas de los ríos
La Vieja y Otún, específicamente en los departamentos de Quindío, Valle
del Cauca y Risaralda. Se seleccionaron dos ventanas en las cuencas, las
cuales fueron escogidas por el centro de excelencia CIEBREG como las
unidades macro del muestreo (Camargo, 2006). Esta selección se realizó
con base en la heterogeneidad espacial, gradiente altitudinal, estructuras
del paisaje, presencia de diferentes sistemas productivos y condiciones de
manejo del suelo (CIEBREG, 2006).
Una vez determinadas las ventanas, se seleccionaron los sistemas
productivos más representativos: ganadería extensiva para producción de
carne, ganadería semiextensiva para producción de leche, cultivos mixtos,
áreas protegidas y cultivos forestales, que reflejaban un tipo particular de
producción y uso de la tierra. En los sistemas productivos se seleccionaron
las coberturas más representativas, y finalmente en estas coberturas se
escogieron las fincas como las unidades más pequeñas de muestreo (Tabla
6).
La cuenca hidrográfica del río La Vieja se encuentra localizada en el
centro occidente del país, entre los departamentos de Quindío, Risaralda y
Valle del Cauca y cuenta con un área de 2,925 km2 (Martínez y Giraldo,
2005). Esta cuenca tiene un clima caracterizado por precipitaciones anuales
(2,000 mm) en las alturas superiores a los 1,400 msnm y con una
temperatura promedio de 20°C (Martínez y Giraldo, 2005). La actividad
económica de la población de esta cuenca se basa en la agricultura,
turismo, minería, pesca y ganadería. Durante el desarrollo de estas
actividades se presentan alteraciones de los recursos naturales, con una
40
alta intervención sobre suelo y agua, afectando las poblaciones humanas
que se abastecen del río La Vieja (Nieto y Orozco, 2003).
Tabla 6. Coberturas y fincas seleccionadas en las cuencas de los ríos La
Vieja y Otún.
Ventana Cobertura Finca
La Ilusión Bosque Bremen
La Ramada Guadual La Comarca
El Bolsillo CFSS La Alegría
La Ramada
La Vieja
Pastizal Villa Ximena
Santa Helena Bosque Pastora
Mandalay Guadual Playa
Macarena Cebolla Buena vista
Lisbrán
El Otún
Forestales Playa Rica
La cuenca hidrográfica del río Otún esta ubicada en el departamento
de Risaralda. El río Otún nace en el nevado de Santa Isabel, en la laguna
que lleva su mismo nombre, situada en el parque Nacional Natural de los
Nevados. La cuenca tiene una longitud total de 67 Km, siguiendo una
trayectoria en sentido Oriente-Occidente hasta confluir con el río Cauca
(Ruiz, 2000). El río Otún es la fuente básica del recurso hídrico de la ciudad
41
de Pereira, debido a que abastece el acueducto municipal (Trejo et al.,
2003). Las actividades económicas predominantes en esta área son el
cultivo de aromáticas, plantaciones forestales, café y cebolla.
Conjuntamente se ha establecido un importante número de granjas avícolas
y porcícolas (Trejo et al., 2003).
5.3.2. Toma de muestras del suelo
En cada una de las coberturas se seleccionaron dos fincas y en las
fincas se escogieron aleatoriamente tres cuadrantes de 2,5 x 2,5 m, al
menos 30 m del borde, para evitar el efecto borde. Se tomaron muestras en
los vértices y en el centro de cada cuadrante y se homogenizaron para
obtener una muestra compuesta de ~ 500 g. Las muestras fueron
almacenadas en oscuridad y refrigeración (4-6oC) hasta su procesamiento
en el laboratorio.
5.3.2.1. Toma de muestras para bacterias nitrificantes
Para las bacterias nitrificantes las muestras fueron tomadas utilizando
un barreno de 20 x 5 cm de diámetro (Figura 2). Las muestras compuestas
fueron almacenadas en bolsas de plástico resellables con cierre hermético y
debidamente rotuladas (fecha, hora, tipo de cobertura, nombre de la finca y
número de cuadrante).
(A) (B)
Figura 2. Toma de muestra para bacterias nitrificantes. A) barreno
utilizado y B) preparación de la muestra compuesta
42
5.3.2.2. Toma de muestras para bacterias desnitrificantes
Para las bacterias desnitrificantes la toma de muestra se realizó
utilizando un barreno de golpe hasta una profundidad de 15 cm. Las
muestras se almacenaron en cilindros cerrados para garantizar condiciones
bajas de oxígeno (Figura 3).
(A) (B)
Figura 3. Toma de muestra para bacterias desnitrificantes. A) barreno
de golpe utilizado y B) núcleo con la muestra.
5.4. Evento de muestreo
Se llevaron a cabo dos eventos de muestreo (10 al 24 de junio, 2006)
y (14 al 21 de octubre, 2006).
5.5. Diseño experimental
En cada una de las ventanas se seleccionaron las cuatro coberturas
más representativas. Para cada cobertura se seleccionaron dos fincas y en
cada finca se tomaron tres muestras compuestas para un total de 48
muestras por evento de muestreo para el estudio de las bacterias
nitrificantes. Para el estudio de las bacterias desnitrifcantes se tomaron dos
muestras puntuales en cada finca para un total de 32 muestras por evento
de muestreo. Este número de muestras fue condicionado por la cantidad de
núcleos disponibles para el almacenamiento de las muestras de suelo,
43
garantizando condiciones bajas de oxígeno Adicionalmente, para la
realización del NMP de estas bacterias fue necesario establecer
condiciones estrictas de anaerobiosis como: atmósfera de nitrógeno, cambio
de fase N2:CO2, y tubos hungate, siendo el trabajo más dispendioso y
requiriendo material especializado.
5.6. Evaluación de los parámetros in situ 5.6.1. Temperatura del suelo
La medición de la temperatura del suelo fue realizado in situ y se
tomó con un termómetro de campo a 20 cm de profundidad.
5.7. Análisis en laboratorio 5.7.1. Análisis microbiológico del suelo. 5.7.1.1. Extracción de los microorganismos del suelo Para la extracción de las bacterias nitrificantes del suelo se utilizó el
método estandarizado por La Torre (2007). Se mezclaron 5 g de suelo en
45 ml de solución salina estéril 0.85% p/v (J.T.Baker) para obtener la
dilución 10-1. La mezcla se agitó por 15 min a 160 rpm (Innova 2100) para
extraer los microorganismos de la matriz del suelo y se dejo decantar por 5
min. A partir de esta dilución inicial se prepararon diluciones seriadas con
base 10.
El proceso de extracción de las bacterias desnitrificantes del suelo se
realizó en frascos (200 ml), los cuales fueron colocados durante 30 min en
agitación orbital a 160 rpm (innova, 2100).
44
5.7.1.2. Determinación de la densidad de bacterias nitrificantes
Para determinar la densidad de las bacterias nitrificantes se empleó
la técnica del número más probable (NMP) en placas de 96 pozos (Rowe et
al., 1976). Las placas fueron previamente esterilizadas con luz UV durante 1
h. En cada uno de los pozos se colocaron 100 µl de los medios
seleccionados para BOA y BON (Anexo 1 y 2). Posteriormente se colocaron
50 µl de cada una de las diluciones de las muestras (10-2 a 10-7) en los
pozos, y se realizaron 5 repeticiones por dilución. La temperatura de
incubación fue de 24±2oC durante cuatro semanas en oscuridad (Bigelow et
al., 2002).
Para evitar evaporación del medio de cultivo y la contaminación, las
placas se cubrieron con papel Glad Press'n Seal®. Porque el crecimiento de
estas bacterias es lento y el desarrollo de turbidez no es visible incluso
después del proceso prolongado de nitrificación, la mejor forma para
comprobar su crecimiento es determinar la producción de nitrito para las
BOA, y la desaparición de nitrito para las BON con los indicadores
difenilamina y reactivo de Gries Llovais, respectivamente (Rowe et al., 1976;
Eighmy y Bishop, 1989; Phillips et al., 2000).
5.7.1.3. Evaluación del crecimiento de bacterias nitrificantes
Para visualizar el crecimiento de BOA se debe tener en cuenta el
cambio de color (rosado a amarillo) del medio de cultivo, debido a la
acidificación producida por la formación de nitritos. La presencia de estos
nitritos se evidenció con la adición de 50 µl del indicador difenilamina cristal
(0.2 % p/v en H2SO4) (J.T Baker) a cada uno de los pozos. (Phillips et al.,
2000). Se consideraron positivos, los pozos que presentaron un color azul,
porque esto indicaba que las bacterias habían oxidado el amonio presente
en el medio de cultivo para la obtención de energía y lo habían
transformado en nitrito (Rowe et al., 1976).
45
Para visualizar el crecimiento de BON, se tuvo en cuenta el consumo
de nitrito, el cual se evidenció con la adición de 50 µl del reactivo Gries
Llovais (Merck) a cada uno de los pozos (Eighmy y Bishop, 1989). El nitrito
reacciona con la sulfanilamida presente en el reactivo y produce un
diazocompuesto, que posteriormente reacciona con una amina aromática
(Cloruro de N-etilendiamonio), formando un compuesto de color rojo. Se
consideraron positivos los pozos con ausencia de color rojo. Porque esto
indicaba que las BON habían oxidado el nitrito presente en el medio de
cultivo para la obtención de energía y lo habían transformado en nitrato
(Balows et al., 2001) (Figura 4).
(A) (B)
Figura 4. NMP para bacterias A) oxidadoras de amonio (BOA), el color azul indica crecimiento y B) oxidadoras de nitrito (BON), ausencia de color indica crecimiento. Se muestra CM: control del medio, C-: control negativo con Acinetobacter y C+: cepa control.
La combinación de pozos positivos/negativos de acuerdo a cada
indicador utilizado en las 6 diluciones realizadas (10-2 a 10-7) se analizaron
en el programa Most Probable Number calculador (versión 4.04) y fueron
expresados como NMP de microorganismos por g de peso seco (gps).
En cada una de las placas se realizaron tres controles a) control del
medio (CM) el cual es utilizado para evaluar ausencia de microorganismos
contaminantes, para lo cual se utilizó el medio mineral estéril b) un control
-2 -3 -4 -5 -6 -7 -2 -3 -4 -5 -6 -7
C+ C-
CM
-2 -3 -4 -5 -6 -7 -2 -3 -4 -5 -6 -7
C+ C-
46
negativo (C-) en el cual se utilizó una cepa de referencia (Acinetobacter sp,
PUJ-M-Bio-USBA-92.) sin capacidad nitrificante reportada y c) un control
positivo (C+) con una cepa BOA y BON, con actividad nitrificante específica,
las cuales habían sido previamente evaluadas en el laboratorio de USBA.
5.7.1.4 Aislamiento de las bacterias nitrificantes
Para el aislamiento de las bacterias se utilizó la técnica de extinción
por dilución (Aakra et al., 1999; Balows et al., 2001). Se tomaron 100 µl de
los pozos de las diluciones positivas más altas del NMP y se sembraron en
5 ml de medio mineral. Se realizaron diluciones seriadas con base 10, las
cuales fueron incubadas por cuatro semanas en oscuridad a 24±2 oC. A
partir de las diluciones positivas más altas de los tubos, se realizaron
nuevamente diluciones seriadas con base 10 utilizando el medio de cultivo
específico para BOA y BON y se realizó además siembra en medio sólido.
Este medio sólido contenía los mismos elementos del medio de cultivo
líquido, pero solidificado con agar bacteriológico (1% p/v) (Oxoid). Se
colocaron los cultivos en incubación por cuatro semanas en oscuridad a
24±2oC (Aakra et al., 1999; Balows et al., 2001).
Finalizada las cuatro semanas de incubación, se evaluó la presencia
de bacterias heterótrofas, ya que son contaminantes habituales encontrados
en los cultivos de bacterias nitrificantes (Aakra et al., 1999). Para ello se
tomó una alícuota de las diluciones más altas positivas de los tubos y una
colonia del medio sólido y se sembraron en agar nutritivo (Anexo 3), que
favorece el crecimiento de bacterias heterótrofas (Balows et al., 2001). Si
hay presencia de bacterias heterótrofas en los medios de cultivos
evaluados, se sigue el procedimiento de extinción de dilución hasta que
desaparezcan por completo las bacterias contaminantes (Aakra et al.,
1999). Adicionalmente se realizó la descripción macroscópica de las
colonias aisladas. (forma, tamaño, color y consistencia) y microscópicas
47
(tinción de Gram). Finalmente para evitar la presencia de materia orgánica
que pueda inhibir a las bacterias nitrificantes es necesario realizar lavado y
enjuague exhaustivo del material de vidrio.
5.7.1.5. Determinación de la densidad de bacterias desnitrificantes
Para evaluar la densidad de las bacterias desnitrificantes se empleó
la técnica del NMP, siguiendo la metodología anaerobia de hungate (Millar y
Wolin 1973; Chung y Bryan, 1997). Para el desarrollo de la técnica es
importante tener en cuenta que todas las soluciones utilizadas durante la
extracción y el recuento de bacterias desnitrificantes fueron libres de
oxígeno. Para lo cual fue necesario llevarlas a ebullición y realizar un
intercambio de atmósfera con nitrógeno grado 5o y seguido de un cambio de
fases N2:CO2 (80:20) (Pachon y Posada, 2003) (Figura 5).
A continuación se tomó con jeringa estéril 1 ml de las diluciones del
suelo (10-2 - 10-6)), el cual fue colocado en tubos hungate con 9 ml del medio
mineral (Anexo 4). Se realizaron 5 repeticiones por cada dilución, y los
tubos se incubaron por 15 d a 28±2oC.
(A) (B)
Figura. 5. Preparación de soluciones para el NMP de bacterias desnitrificantes. A) Intercambio de atmósfera con nitrógeno B) cambio de fase con N2:CO2.
48
5.7.1.6. Evaluación del crecimiento de bacterias desnitrificantes
El crecimiento de las bacterias desnitrificantes fue relacionado con la
presencia de turbidez en el medio de cultivo y por el consumo de nitrito y
nitrato (Figura 6). El consumo de nitrito y nitrato fue evidenciado por medio
de la adición de 2 gotas del indicador difenilamina a 0.1 ml de cada una de
las diluciones del NMP. Se consideraron positivos los tubos que
presentaron ausencia de color azul, indicando la utilización del nitrato
presente en el medio de cultivo como aceptor final de electrones para su
respiración en condiciones limitadas de oxígeno (Martín et al., 1988).
(A) (B)
Figura 6. NMP para bacterias desnitrificantes. A) Se muestra turbidez del medio de cultivo con crecimiento bacteriano B) El color azul indica tubo negativo y ausencia de color azul indica crecimiento de bacterias desnitrificantes. 5.7.1.7. Aislamiento de bacterias desnitrificantes
Se tomó 1 ml de las diluciones más altas positivas del NMP y se
sembraron en 9 ml de medio líquido mineral, se incubaron a 28±2oC por 15
d. Se confirmó nuevamente el crecimiento bacteriano con el indicador
difenilamina. Finalmente se hizo siembra en medio líquido y en medio sólido
usando la técnica del tubo rodado (Pachon y Posada, 2003) (Anexo 5).
49
Las cepas aisladas se purificaron utilizando en forma repetida la
técnica del tubo rodado hasta obtener cultivos axénicos. Para verificar la
pureza de la cepa se hizo siembra en medio mineral enriquecido con
glucosa (10 Mm) y peptona (2% p/v) y se realizó un seguimiento
microscópico, observando la morfología característica de cada cultivo.
Finalmente se realizó la descripción macro (forma, tamaño, color y
consistencia de las colonias) y microscópica (tinción de Gram).
5.7.2. Análisis físico químico del suelo. 5.7.2.1. pH
Para la determinación de pH se utilizó el método 9045C de la EPA
(1995). Se preparó una mezcla 1:1 de suelo y agua desionizada (10 g: 10
ml). La cual se agitó por 5 min a 160 rpm y se dejó sedimentar por 10 min.
Posteriormente se midió el pH en el sobrenadante utilizando un
potenciómetro (744 Metrohm).
5.7.2.2. Porcentaje de humedad y peso seco
Para la determinación del porcentaje de humedad y peso seco se
utilizó el método del IGAC (1994). Se pesaron ~10.0 g de suelo en una
bandeja de aluminio y se colocaron en el horno (UMMEMMERT-300) a
105oC, por 24 h. Transcurrido este tiempo se dejo enfriar el suelo en un
desecador y nuevamente se pesó la muestra para determinar la fracción de
peso seco (ps) y el porcentaje de humedad (Ecuación 4). Esta fracción fue
utilizada para corregir los datos microbiológicos y fisicoquímicos a peso
seco.
PmhPms
Fps = (Ecuación. 4)
Fps = fracción peso seco
Pms = peso muestra seca
Pmh = peso muestra húmeda
50
5.7.2.3. Nitrógeno como nitrato
Para los análisis el suelo fue secado a 60oC por 12 h en el horno
(UMMEMMERT-300) y tamizado a través de una malla de 20 mm para
obtener un tamaño de partícula uniforme. Previamente se realizó el proceso
de extracción acuosa (HACH 1994), donde se tomaron 4,2 g de suelo
empleando una cuchara graduada, los cuales se colocaron en una botella
de vidrio de 50 ml y se adicionaron 25 ml de agua desionizada. A esta
mezcla se le añadieron 0.02 g de polvo de extracción para nitratos. Se agitó
por 30 s y se dejo sedimentar hasta obtener un extracto acuoso claro.
Para la determinación de N-NO3- se utilizó el método 366 (HACH,
1994). 1 ml del extracto acuoso, se aforó hasta 25 ml con agua desionizada
y se agregó un sobre de NitraVer 6. Este reactivo contiene cadmio, el cual
reduce los iones NO-3 a NO2�. Se agitó por 3 min y el sobrenadante se
transfirió a una celda de 25 ml, a continuación se adicionó un sobre de
NitraVer 3 que contiene sulfamidas, las cuales reaccionan con los iones
NO2� formando un compuesto de color rojo. Se mezcló por 30 s y se realizó
la lectura a los 10 min, a una longitud de onda de 500 nm. La intensidad del
color rojo indicó la concentración de NO3- en mg/Kgps. Para el control de
calidad se utilizaron blancos de laboratorio con agua desionizada para
detectar cualquier interferencia con los reactivos o el material de vidrio
empleado. El valor obtenido del BL en AU, se sustrajo al valor en AU de las
muestras evaluadas.
Para los análisis se verificaron pruebas de precisión y exactitud
utilizando estándares comerciales (HACH, 1998) a una concentración de 10
mg/l de N-NO3-, este valor fue transformado a ~ 52 mg N-NO3
-/Kgps
determinando el factor de conversión (HACH, 1998). Para la determinación
de la precisión del método se preparó una solución estándar de 10 mg/l y se
analizo 5 veces (n=5) siguiendo el mismo protocolo para una muestra
51
normal. La desviación estándar (DS) obtenida se comparó con una DS de
2.3 mg N-NO3-/Kgps, reportado por el método (HACH, 1994). Para la
evaluación de la exactitud se empleó el estándar comercial de (HACH 1994)
de 10 mg/l de N-NO3- y se preparó un estándar en el laboratorio de 41 mg
N-NO3-/Kgps. Los estándares leídos por esta técnica deberían tener una
concentración de 44 mg N-NO3-/Kgps (HACH, 1994).
5.8. Análisis estadístico
Inicialmente se evaluó si los datos que se obtuvieron en el estudio
seguían una distribución normal mediante el test de Shapiro Wilk, utilizando
el programa JMP IN Versión 4.40. Las variables que no siguieron una
distribución normal (p�0.05) se normalizaron con logaritmo base 10. A los
datos normalizados se les realizó una prueba de Bartlett para saber si había
homogeneidad de varianzas (Martínez y Martínez, 1997).
Para evaluar si las coberturas de bosque, guadual, cafetal sin
sombrío, pastizal, cultivos de cebolla y cultivos forestales, tuvieron algún
efecto sobre la densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes se
realizó un análisis de varianza y una prueba de Tukey-Kramer con un nivel
de significancia del 95% (Waine, 1999).
Para probar si los factores físico-químicos del suelo en las coberturas
antes mencionadas influyeron en la densidad de bacterias nitrificantes y
desnitrificantes, se aplicó el modelo estadístico de regresión y correlación
de Pearson para los datos que siguieron una distribución normal y una
correlación de Sperman para los datos que no siguieron una distribución
normal (Martínez y Martínez, 1997; Waine, 1999).
52
Resumen de la metodología que se siguió para el logro de los objetivos
(Figura 7).
P
Cuenca hidrográfica Río la Vieja Cuenca hidrográfica Río Otún
Área de estudio
Parámetros físico-Químicos Analisis microbiologico
pH % de humedad Temperatura
Determinación de la densidad Nitrato
Bosque, Guadual, Cafetal sin sombrío y pastizal
Bosque, Guadual, Cultivos de Cebolla y forestales
Coberturas
Análisis de las muestras de suelo
NMP
Métodos tradicionales Cultivo
Aislamiento
Análisis estadísticos de los datos
Figura. 7. Metodología empleada para evaluar el efecto de coberturas vegetales presentes en la Ecorregión Cafetera sobre la densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes.
53
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En esta sección se presentan y discuten los recuentos de bacterias
nitrificantes y desnitrificantes obtenidos en las coberturas seleccionadas de
las cuencas de los ríos la Vieja y Otún en la Ecorregión Cafetera de
Colombia. Para poder estimar la densidad de estas bacterias del suelo se
estandarizaron las condiciones óptimas de cultivo y su recuento por el NMP.
Finalmente, se evaluó el efecto de las coberturas vegetales sobre los
recuentos de estas bacterias.
6.1 Selección de las condiciones óptimas para el crecimiento y
cuantificación de bacterias nitrificantes
Debido al gran número de parámetros que pueden afectar el
crecimiento de las bacterias nitrificantes, fue necesario obtener un medio de
cultivo óptimo donde se presentaran las condiciones ambientales
adecuadas para su crecimiento y cuantificación en el laboratorio. Dentro de
las variables más influyentes en el crecimiento de las bacterias nitrificantes
se seleccionaron y evaluaron la fuente de carbono, fuente de energía,
volumen de medio de cultivo y de cada una de las diluciones utilizadas en el
NMP, condiciones de temperatura y humedad.
6.1.1. Fuente de carbono
El CO2 es la fuente de carbono utilizada por las bacterias nitrificantes,
para la formación de biomasa, siendo reducido y convertido en diferentes
compuestos de carbono (Kowalchuk y Stephen, 2001). Para obtener el
mayor crecimiento y mayor densidad de bacterias nitrificantes para su
evaluación por el NMP se compararon inicialmente 2 fuentes de carbono:
NaHCO3 y CaCO3, las cuales han sido reportadas en la literatura (Aakra et
al., 1999, Balows et al., 2001 y Calvo, 2005). Se observaron mayores
54
densidades de BOA y BON utilizando NaHCO3 (0.125 g/l) como fuente de
carbono, sin alteraciones visibles en el medio de cultivo, a diferencia de
cuando se utilizó CaCO3, puesto que el medio de cultivo se tornó turbio y los
pozos presentaron una mayor tendencia a la desecación (Tabla 7).
Tabla 7. Comparación de las densidades de bacterias nitrificantes utilizando
CaCO3 y NaHCO3 como fuente de carbono.
aCFSS = cafetal sin sombrío. Porcentaje del coeficiente de variación (%CV). Se
presenta el promedio y porcentaje del coeficiente de variación (%CV) (n=24)
gps= Gramos de peso seco.
Al analizar los resultados obtenidos con NaHCO3 y CaCO3, se
observaron densidades significativamente superiores y a su vez una mayor
precisión con NaHCO3 en la mayoría de las coberturas (Anova: p < 0.05;
n=24) (Tabla 7, Figuras 8-10, Anexo 6). Por lo tanto, el NaHCO3 se
seleccionó como fuente de carbono en el medio de cultivo para la
cuantificación de BOA y BON durante el estudio.
Log10 NMP/gps % coeficiente de variación
BOA BON BOA BON Cobertura
CaCO3 NaHCO3 CaCO3 NaHCO3 CaCO3 NaHCO3 CaCO3 NaHCO3
Bosque
2.29
2.85
3.08
4.81
1.5
11.71
0.73
2.33
Guadual
2.43
3.02
3.52
5.19
4.1
7.28
14.6
2.79
CFSSa
2.71
3.32
3.21
5.34
16.8
7.14
5.53
3.24
Pastizal
2.76
3.45
3.72
5.22
16.8
8.68
27.5
0.88
55
A
0
1
2
3
4
5
6
Bosque Guadual CFSS Pastizal
Log 1
0 N
MP
/gp
s
B
0
1
2
3
4
5
6
Bosque Guadual CFSS Pastizal
Log 1
0 N
MP
/gp
s
Figura. 8. Comparación de las densidades de A) BOA y B) BON utilizando CaCO3 y NaHCO3 como fuente de carbono. Se presenta el promedio (n= 6). ± 1 desviación estándar
CaCO3
NaHCO3
CaCO3
NaHCO3
56
(A) (B)
Figura 9. Comparación de la fuente de carbono con base en el crecimiento de BOA por NMP. A) NaHCO3 y B) CaCO3. El color azul indica crecimiento. Se muestra CM: control del medio C-: control con Acinetobacter y C+: control positivo.
(A) (B)
Figura 10. Comparación de la fuente de carbono con base en el crecimiento de BON por NMP A) NaHCO3 y B) CaCO3. Ausencia de color indica crecimiento. Se muestra CM: control del medio C-: control con Acinetobacter y C+: control positivo.
6.1.2. Fuente de energía:
Como las BOA necesitan amonio como fuente de energía se
evaluaron dos concentraciones de (NH4)SO4 (0.13 y 0.5 g/l). Al no obtener
crecimiento con 0.13 g/l, se eligió la concentración de 0.5 g/l, la cual ha sido
-2 -3 -5 -6 -7 -2 -5 -6 -7 -4 -2 -3 -4 -5 -6 -2 -3 -4 -6 -7
C-
-5 -7
-6 -3 -4 -5 -6 -7
C+
C-
CM
-2 -4 -5 -2 -7 -3 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -2 -3 -4 -5 -6 -7
CM C- C+
Crecimiento
Crecimiento
-
Crecimiento
Crecimiento
CM C-
C+
C+ CM
-4 -3
57
reportada en la literatura por favorecer el crecimiento de este tipo de
bacterias (Aakra et al., 1999; Bruns et al., 1999 y Calvo, 2005). Mientras que
para las BON se ensayaron dos concentraciones de NaNO2 (0.035 g/l y 2
g/l) (Stienstra et al., 1993 y Balows et al., 2001). La concentración de 0.035
g/l se seleccionó para el estudio puesto que favoreció el crecimiento de las
BON, mientras que con la concentración de 2 g/l no se obtuvo crecimiento.
Este resultado esta de acuerdo a un estudio previo reportado por
Stienstra y col. (1993) en el recuento de BON a partir de las raíces de
plantas de prado, en el cual compararon las concentraciones 0.035g/l y 0.35
g/L de NaNO2 y determinaron un mayor recuento de BON al adicionar
concentraciones más bajas (0.035g/l), debido a que estas bacterias
presentan poca tolerancia al nitrito cuando se aislan de hábitats naturales.
6.1.3. Volumen de medio de cultivo
La técnica del NMP se llevó a cabo en placas de 96 pozos con un
volumen de 200 µl. Por esta razón en el estudio se seleccionó el volumen de
100 µl de medio de cultivo y 50 µl para cada una de las diluciones del suelo,
para un volumen total de 150 µl, siguiendo el protocolo de Bigelow y col.
(2002). Este criterio se escogió teniendo en cuenta el volumen que
presentaron los pozos y la evaporación debida al tiempo prolongado de
incubación.
6.1.4. Temperatura y humedad durante la incubación:
Por ser las bacterias nitrificantes mesófilas, la temperatura de
incubación a la cual se llevó a cabo la técnica del NMP fue 24±2OC, en
oscuridad por cuatro semanas, la temperatura se registró con un
termómetro ambiental de máximos y mínimos (Eighmy y Bishop, 1989;
Bigelow et al., 2002). Se evitó la evaporación del medio de cultivo durante la
58
incubación colocando papel filtro húmedo bajo las placas y un vaso con
agua destilada estéril en la incubadora.
6.2. Selección de las condiciones óptimas para el crecimiento y
cuantificación de bacterias desnitrificantes
6.2.1. Fuente de carbono
Para evaluar la fuente de carbono para el crecimiento y cuantificación
de las bacterias desnitrificantes por el NMP se utilizaron las muestras de
suelo de las coberturas del primer evento de muestreo (10-24 junio 2006)
con 3 fuentes diferentes: Etanol (1.0 g/l), acido glutámico (1.7 g/l) y acetato
de sodio (1.0 g/l), según estudios realizados por Marazioti et al., 2002;
Casasus et al., 2005 y Heylen et al., 2005. ). Se observó que en los medios
de cultivo donde se adicionó como fuente de carbono etanol y acetato de
sodio, mostraron turbidez, indicando posible crecimiento bacteriano y
adicionalmente se presentó consumo de nitrato y nitrito a los 15 d de
incubación, probado con el indicador difenilamina. Cuando se utilizó acido
glutámico como fuente de carbono no se evidenció en ninguna de las
muestras crecimiento y desnitrificación, lo cual se demostró por la presencia
de nitritos o nitratos en los medios de cultivo después de 15 d de incubación
(Figura 11).
Resultados similares fueron reportados por Heylen y col. (2005),
donde determinaron que el etanol era una buena fuente de carbono al
incrementar la actividad de la enzima nitrito reductasa, la cual actúa sobre el
nitrito transformándolo en óxido nítrico, evitando su acumulación y por tanto
su toxicidad. En este mismo estudio también establecieron la activación del
proceso de desnitrificación cuando utilizaron acetato como fuente de
carbono. Por lo que en el presente estudio se escogió una mezcla de
59
acetato y etanol como fuente de carbono en la elaboración del medio de
cultivo para la cuantificación de bacterias desnitrificantes.
Figura 11. Comparación de la fuente de carbono con base en el crecimiento de bacterias desnitrificantes A) etanol, B) acido glutámico y C) acetato de sodio. Ausencia de color indica desaparición de nitratos y nitritos, y el color azul indica presencia de nitratos o nitritos.
6.2.2 Temperatura durante la incubación:
Por ser todas las bacterias desnitrificantes mesófilas, y crecer en
rangos comprendidos entre 20 y 37 OC, la temperatura de incubación a la
cual se llevó a cabo la técnica del NMP fue 28±2OC, en oscuridad por 15 d.
(Bigelow et al., 2002, Marazioti et al., 2002 y Heylen et al., 2005).
Adicionalmente, se seleccionó esta temperatura ya que las muestras de
suelo generalmente son cultivadas en esta temperatura.
6.3. Determinación de la densidad de bacterias nitrificantes y
desnitrificantes en las coberturas seleccionadas de la EC
En esta sección se presentan inicialmente los resultados de las
densidades de BOA, BON y bacterias desnitrificantes en las ventanas de La
Vieja y Otún y seguidas de su respectiva discusión. (Tabla 8) (Anexo 7-10).
A B C
60
Tabla 8. Densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en las
coberturas de la ventana La Vieja y Otún
Log 10 NMP/gps Ventana
Cobertura BOA BON Desnitrificantes
Bosque
2.85 ±0.33
4.81±0.11
0.54±0.060
Guadual
3.02± 0.22
5.19±0.14
0.56±0.007
CFSSb
3.32±0.23
5.34±0.17
0.67±0.085
La Vieja Junio, 2006
Pastizal
3.45±0.29
5.22±0.046
0.73±0.030
Bosque
2.39±0.04
4.24±0.33
0.53±0.04
Guadual
2.99±0.035
4.29±0.56
0.56±0.03
CFSSb
2.86±0.07
4.18±0.33
0.53±0.07
La Vieja Octubre, 2006
Pastizal
3.47±0.06
4.35±0.42
0.66±0.06
Bosque
2.80±0.44
4.35±0.72
0.51±0.043
Guadual
3.54±0.45
4.74±0.21
0.55±0.039
Cebolla
4.27±0.19
5.01±0.26
0.60±0.035
Otún Junio, 2006
Forestales
3.09±0.45
4.78±0.046
0.55±0.004
Bosque
2.26±0.10
4.31±0.40
0.37±0.08
Guadual
3.51±0.57
4.81±0.08
0.45±0.02
Cebolla
4.36±0.19
4.98±0.27
0.48±0.01
Otún Octubre, 2006
Forestales
2.84±0.45
4.68±0.33
0.38±0.02
Primer muestreo: 10-24 junio-2006. Segundo muestreo: 14- 21 de octubre-2006 aCFSS = cafetal sin sombrío. Se presenta el promedio del log10 NMP/gps.± 1
desviación estándar (n =6).
61
6.3.1. Comparación de la densidad de BOA en las coberturas de la
Ventana La Vieja
En el estudio, pastizal presentó densidades significativamente
mayores de BOA, mientras que bosque presentó las densidades mas bajas.
Las densidades en guadual, CFSS y pastizal no presentaron diferencias
significativas. Durante el mes de octubre se observó una disminución de los
recuentos en la mayoría de las coberturas, siendo CFSS y bosque las que
presentaron la mayor disminución, aunque estas no fueron significativas
(Anova: p < 0.05; n=24) (Figura 12) (Anexo 11-12).
0
1
2
3
4
5
Bosque Guadual CFSS Pastizal
Coberturas
Rec
uent
oLo
g 10
NM
P/g
ps
Junio Octubre
Figura 12. Densidad de BOA en las coberturas de la ventana La Vieja, durante los eventos de muestreo en Junio y Octubre. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar.
6.3.2. Comparación de la densidad de BON en las coberturas de la
ventana La Vieja
En el mes de Junio, se observaron densidades significativamente
mayores de BON en CFSS, mientras las densidades más bajas fueron en
62
bosque. Las densidades en guadual, CFSS, y pastizal no presentaron
diferencias significativas. Durante el mes de Octubre pastizal presentó las
densidades mayores, seguida de guadual, bosque y CFSS y en ninguna de
las coberturas se obtuvo diferencias significativas. Se observó una
disminución de las densidades en todas las coberturas en Octubre, siendo
CFSS la que presentó menores densidades con diferencias significativas
(Anova: p < 0.05; n=24) (Figura 13) (Anexo 13-14).
0
1
2
3
4
5
6
Bosque Guadual CFSS Pastizal
Coberturas
Rec
uent
oLo
g 10
NM
P/g
ps
Junio Octubre
Figura 13. Densidad de BON en las coberturas de la ventana La Vieja, durante los eventos de muestreo en Junio y Octubre. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar.
En términos generales en la ventana La Vieja, las mayores densidades
de BOA y BON estuvieron presentes en pastizal y CFSS, mientras que
bosque presentó las densidades menores. De igual forma se observaron
menores densidades en el mes de Octubre en la gran mayoría de las
coberturas (Tabla 8).
63
6.3.3. Comparación de la densidad de BOA en las coberturas de la
ventana Otún.
En los meses de Junio y Octubre cebolla presentó las densidades
significativamente mayores de BOA, mientras en bosque se observaron las
densidades más bajas. Las densidades en guadual y forestal no fueron
significativamente diferentes, pero fueron significativamente mayores que
bosque y significativamente menores que cebolla (Anova: p < 0.05; n=24)
(Figura 14) (Anexo 15-16).
0
1
2
3
4
5
Bosque Guadual Cebolla Forestal
Coberturas
Rec
uent
oLo
g 10
NM
P/g
ps
Junio Octubre
Figura 14. Densidad de BOA en las coberturas de la ventana Otún, durante los eventos de muestreo: Junio y Octubre. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar.
6.3.4. Comparación de la densidad de BON en las coberturas de la
......... ventana Otún.
En los meses de Junio y Octubre cebolla presentó las
densidades mayores de BON, al igual que de BOA, mientras que
bosque las densidades más bajas, con diferencias significativas
64
únicamente para el mes de Octubre. Las densidades de guadual,
forestal y cebolla no presentaron diferencias significativas (Anova: p <
0.05; n=24) (Figura 15) (Anexo 17-18).
0
1
2
3
4
5
6
Bosque Guadual Cebolla Forestal
Coberturas
Rec
uent
oLo
g 10
NM
P/g
ps
Junio Octubre
Figura 15. Densidad de BON en las coberturas de la ventana Otún, durante los eventos de muestreo en Junio y Octubre. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar.
6.3.5. Discusión de los resultados de bacterias nitrificantes
Se obtuvieron las mayores densidades de BOA y BON, en pastizal y
CFSS en la ventana La Vieja y en cebolla en la ventana Otún. Todas estas
coberturas son caracterizadas por una alta intervención antropogénica, en
prácticas tales como la agricultura y la ganadería (Balcazar et al., 1998;
Murgueitio, 2003). Se ha reportado deterioro en el suelo cuando se emplean
monocultivos sin sombra como en CFSS, en los cuales el agregado de
materiales orgánicos y de nitrógeno natural por parte de los árboles es
reemplazado por el uso de plaguicidas, fertilizantes químicos tipo NPK 20-30-
10 (mg) y urea (Balcazar et al., 1998). En los pastizales también se emplean
monocultivos para una producción masiva de alimento para ganado, siendo
65
necesario el uso de fertilizantes químicos NPK y fertilizantes orgánicos como
la pollinaza en combinación con la labranza (Murgueitio, 2003). Básicamente
la fertilización para el cultivo de cebolla se fundamenta en la aplicación de
abono orgánico de origen animal, siendo la gallinaza el producto que más se
utiliza, y la urea como fertilizante inorgánico (Castellanos, 1999).
Los fertilizantes nitrogenados al ser adicionados en los suelos,
aceleran la transformación de C durante la oxidación de la materia orgánica
en dióxido de carbono (CO2) y contribuyen en el aumento de la
mineralización del nitrógeno orgánico en nitrógeno mineral (NH4+) por parte
de los microorganismos, ofreciendo un ambiente favorable para el
crecimiento de bacterias nitrificantes (Bruns et al 1999). Las bacterias
nitrificantes necesitan CO2 como fuente de carbono y amonio (NH4+) como
fuente de energía para su crecimiento y desarrollo (Pacheco et al., 2002;
Azam et al., 2002). Este efecto observado en las coberturas de pastizal,
CFSS y cebolla, fue reportado por Bruns y col. (1999) quienes encontraron
densidades significativamente superiores de BOA en suelos de reserva
ecológica situados en el sur oeste de Michigan que habían sido tratados con
fertilizantes nitrogenados (2.43 Log10 NMP/gps) al compararlo con suelos no
tratados (1.66 Log10 NMP/gps).
En otros estudios realizados por Chu y col. (2006), determinaron una
mayor acumulación de NO3-- N, nitrógeno mineral y un aumento en el
potencial de nitrificación y tamaño de las poblaciones nitrificantes al adicionar
fertilizantes nitrogenados a los suelos de Fengqiu Ecological Experimental
Station en China, mostrando que a largo plazo estos fertilizantes podrían
promover en gran medida las comunidades nitrificantes y estimular su
función. El aumento en el potencial de nitrificación y tamaño de las
poblaciones fue atribuido principalmente al nitrógeno mineral derivado de la
fertilización con compuestos nitrogenados.
66
Igualmente en estudios realizados por Azam y col. (1995),
demostraron que en suelos tratados con NH4+ se presentó una mayor tasa de
mineralización del nitrógeno orgánico al compararlo con suelos no tratados,
cuando la nitrificación era inhibida. Con esta inhibición se elevaban los
niveles de NH4+ y por tanto se promovía el crecimiento y la actividad de las
poblaciones bacterianas ocasionando una mayor tasa de mineralización.
Adicionalmente, en la cobertura pastizal los productos metabólicos de
la orina y heces del ganado vacuno favorecen el crecimiento de las bacterias
nitrificantes, puesto que la orina emitida por estos animales contiene urea, la
cual es hidrolizada hasta carbonato de amonio y las heces contienen grandes
cantidades de materia proteinica, las cuales son convertidas hasta NH4+ por
las bacterias saprofitas bajo condiciones aerobias o anaerobias (Murgueitio,
2003). Este NH4+ es necesario para el crecimiento de las bacterias
nitrificantes pues es utilizado como fuente de energía (Pacheco et al., 2002).
Estudios realizados por Dalby y col. (2004) determinaron que
pastizales a los cuales se habían adicionado fertilizantes con NH4+ eran sitios
que proporcionaban condiciones óptimas para el crecimiento de las bacterias
nitrificantes, así como de su actividad nitrificante, además encontraron
niveles altos de nitrato al compararlo con suelos de pastura de reserva no
fertilizados, donde la actividad nitrificante y los niveles de nitrato fueron bajos.
En el presente estudio pastizal, mostró correlación positiva (p<0,05) entre las
densidades de BOA y BON (R2= 0.942 y R2= 0.907) respectivamente y la
concentración de nitratos debido a que este compuesto es el producto final
del proceso de nitrificación, indicando que las bacterias nitrificantes están
presentes y realizando el proceso de nitrificación. Las densidades de BOA
fueron más altas en pastizal (3.47 Log10 NMP/gps) al compararlas con los
suelos de las coberturas de bosque, guadual y CFSS respectivamente (2.39,
2.99 y 286 Log10 NMP/gps).
67
Los resultados obtenidos en los estudios encontrados en la literatura
guardan relación con los obtenidos en las coberturas de la ventana La Vieja y
Otún de la EC, donde suelos tratados con fertilizantes nitrogenados como
pastizal, CFSS y cebolla presentaron las mayores densidades de bacterias
nitrificantes.
Adicionalmente, al comparar las densidades de BOA y BON en las
coberturas seleccionadas en la ventana La Vieja y Otún se logró determinar
que bosque presentó las densidades más bajas, lo cual pudo ser causado
porque estos sitios se caracterizan por presentar mayor cantidad de materia
orgánica, lo cual puedo inhibir de forma indirecta a las bacterias nitrificantes
(Bruns et al., 1999). Estas bacterias nitrificantes se inhiben por ser
quimiolitoautótrofas, las cuales tienen una alta especificidad por la fuente de
carbono y energía inorgánica disponible. Según estudios de Brower y col.
(2006) en bosques frondosos de Falmouth, Massachussets, observaron en
estos sitios menores tasas de nitrificación al compararlo con suelos
agrícolas, debido posiblemente a una alta concentración de carbono en la
hojarasca y de lignina en el material leñoso, siendo la lignina
estructuralmente resistente a la descomposición y permitiendo a su vez que
en los suelos de bosque no varié el contenido de carbono.
A su vez, Verhagen y col. (1995), al realizar estudios de competición
por amonio entre bacterias heterótrofas y nitrificantes en raíces de plantas
en presencia de altas concentraciones de carbono orgánico, encontraron
que los competidores mas débiles por amonio eran las bacterias nitrificantes
y por tales razones su densidad fue la más baja, concluyendo que las
bacterias heterótrofas eran mejores competidoras por presentar mayores
tasas de crecimiento.
En otros estudios, Julca y col. (2006) encontraron que la
mineralización de la materia orgánica era llevada a cabo específicamente
68
por organismos heterótrofos que sobrecrecían a los autótrofos nitrificantes,
lo cual era debido a una menor tasa de crecimiento y a limitaciones en
sintetizar ATP por parte de las bacterias nitrificantes, cuando se establecía
una competencia por el oxígeno disuelto con las bacterias heterótrofas.
Durante el presente estudio, también se evidenciaron en bosque los
valores de pH (5.0±1.06 y 5.3±0.4), temperatura (19.7±2.19 y 19.2±1.84)
más bajos y los valores de porcentaje de humedad (36.6±10.3 y 32.1±12.0)
más altos en los dos eventos de muestreo al comparar las coberturas en
estudio (Anexo 29 y 30). Estos parámetros son característicos en los
bosques y limitantes para el crecimiento de BOA y BON, debido a que la
mineralización del nitrógeno suele ser lenta cuando se presentan bajas en la
temperatura y el pH del suelo. Igualmente estos valores bajos pueden inhibir
las bacterias nitrificantes ya que su crecimiento se favorece en rangos de
pH cercanos a la neutralidad y a temperaturas comprendidas entre 20 y 30 OC. Además en condiciones de humedad se disminuye la difusión del
oxígeno lo cual limita el crecimiento de bacterias aerobias como las
nitrificantes.
Los bajos recuentos de bacterias nitrificantes que se presentaron en
bosques pueden también ser causados por el proceso de alelopatía
característico de este ecosistema, en el cual se liberan compuestos como
los taninos que influyen en el desarrollo forestal, y evitan la pérdida de
nitrato del ecosistema (Verhagen y Laanbroek, 1991; Blanco, 2007).
Estudios por Lata y col. (2004), sugirieron que se presentaba una relación
directa entre la liberación de compuestos alelopáticos y la inhibición del
crecimiento de bacterias nitrificantes en los bosques. En otros estudios
realizados por Lodhi y Killingbeck. (1980) demostraron que al incubar
bacterias nitrificantes con suelos que poseían sustancias alelopáticas,
causaba reducción del crecimiento en un 68-93%.
69
Adicionalmente, durante Junio y Octubre en todas las coberturas en
estudio se observaron las densidades de BON mayores a las densidades de
BOA (Tabla 8). Resultados similares fueron obtenidos por Bigelow y col.
(2002) en la caracterización de comunidades bacterianas en la raíz de
grama de golf, durante los primeros 6 meses del estudio. BOA: (0.6, 3,9 y
4.4 Log UFC g-1PS) y BON (1.1, 4.4 y 4.8 Log UFC g-1
PS) en Octubre,
Diciembre y Marzo respectivamente. Igualmente Abeliovich. (2006) al
enumerar BON en muestras de suelo por la técnica del NMP a menudo
observa alto número de células a bajas concentraciones de nitrito, cuando
se compara con el número de BOA.
En el mes de octubre, se obtuvo la mayor disminución de las
densidades de BOA y BON en CFSS para la ventana La Vieja. Estas bajas
densidades pudieron presentarse, porque días antes de realizarse el
muestreo hubo una fuerte precipitación con presencia de granizo afectando
la zona de estudio (Anexo 7). Posiblemente estos suelos fueron perturbados
alterando su temperatura, humedad y la difusión del O2, ocasionando
ambientes desfavorables para las bacterias nitrificantes. Adicionalmente
CFSS presentó para Octubre una correlación negativa (p<0,05) entre las
BOA y la humedad (R2= 0.981), indicando que posiblemente la humedad
presente en los suelos pudo inhibir las BOA que son las encargadas de
realizar la primera etapa de nitrificación en presencia de oxígeno. Estos
resultados pueden correlacionarse con los realizados por White y Reddy.
(2002), en los que midieron tasas de nitrificación en suelos de humedales,
determinando la disponibilidad de oxígeno en los suelos, como el mayor
factor limitante en el desarrollo de las bacterias nitrificantes.
70
6.3.6. Comparación de la densidad de bacterias desnitrificantes en las
. coberturas de la ventana La Vieja
En el mes de Junio, se observaron las densidades
significativamente mayores de bacterias desnitrificantes en pastizal,
mientras que las densidades más bajas estuvieron presentes en bosque,
seguido por guadual y CFSS. En el mes de Octubre, pastizal también
presentó las densidades de bacterias desnitrificantes mayores, seguido por
las densidades de guadual, bosque y CFSS. Al igual a lo observado en las
bacterias nitrificantes para el mes de Octubre, se observó una disminución
no significativa en las densidades de bacterias desnitrificantes en la
mayoría de las coberturas, siendo más evidente en CFSS (Anova: p <
0.05; n=16) (Figura 16) (Anexo 19-20).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Bosque Guadual CFSS PastizalCoberturas
Rec
uent
oLo
g 10
NM
P /g
ps
Junio Octubre
Figura 16. Densidad de bacterias desnitrificantes en las coberturas de la ventana La Vieja, durante los eventos de muestreo en Junio y Octubre. Se presenta el promedio (n= 4) ± 1 desviación estándar.
71
6.3.7. Comparación de la densidad de bacterias desnitrificantes en las
coberturas de la ventana Otún
En el mes de Junio, cebolla presentó las densidades significativamente
mayores de bacterias desnitrificantes, mientras las densidades más bajas
estuvieron presentes en bosque, seguidas por forestal y guadual. Durante el
mes de Octubre, cebolla también presentó las mayores densidades y bosque
las menores densidades, seguido por forestal y guadual, sin presentar
diferencias significativas (Anova: p < 0.05; n=16) (Figura 17) (Anexo 21-22).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Bosque Guadual Cebolla Forestal
Coberturas
Rec
uent
o Lo
g 10
NM
P/g
ps
Junio Octubre
Figura 17. Densidad de bacterias desnitrificantes en las coberturas de la ventana Otún, durante los eventos de muestreo en Junio y Octubre. Se presenta el promedio (n= 4) ± 1 desviación estándar.
6.3.8. Discusión de los resultados de bacterias desnitrificantes
Durante el presente estudio se observaron las mayores densidades de
bacterias desnitrificantes en pastizal y en cebolla en las ventanas de La Vieja
y Otún respectivamente. Estas coberturas son áreas intervenidas por el
hombre en prácticas tales como la agricultura y la ganadería (Siavosh et al.,
2000). Esta intervención se realiza a través de la implementación de
72
monocultivos, y para lograr un mayor rendimiento en los suelos, es necesario
el uso de fertilizantes químicos como el amonio y fertilizantes orgánicos como
la gallinaza, en combinación con la labranza (Castellanos, 1999; Murgueitio,
2003). Las bacterias desnitrificantes se benefician con la adición de estos
fertilizantes que contienen nitrógeno orgánico e inorgánico mineralizable
disponible, el cual puede ser transformado en nitrato por los microorganismos
del suelo, principalmente por las bacterias nitrificantes (Mora et al., 2007). La
transformación hasta nitrato la realizan gracias al aumento de la actividad
microbiana como respuesta a las adiciones de amonio (Ellis et al., 1996).
Particularmente las bacterias nitrificantes, utilizan el amonio como
fuente de energía, originando microambientes anaerobios por el consumo de
oxígeno y la producción de nitrato (Ellis et al., 1996). En el presente estudio
las coberturas de pastizal y cebolla mostraron correlación positiva (p<0,05)
entre la densidad de BOA y bacterias desnitrificantes (R2= 0.900 y R2= 0.925)
respectivamente y la densidad de BON y bacterias desnitrificantes (R2= 0.845
y R2= 0.979) respectivamente. Indicando que las mayores densidades de
bacterias desnitrificantes presentadas en estas coberturas se relacionaron
con las altas densidades de BOA y BON, encargadas de suministrar nitratos
a los suelos por el proceso de nitrificación.
Este efecto también fue observado por Azam y col. (2002), quienes
encontraron densidades mayores de bacterias nitrificantes y desnitrificantes y
altas tasas de nitrificación y desnitrificación en suelos de Weilburger-Grenze,
Gieben, Alemania que habían recibido tratamiento con fertilizantes
nitrogenados. Además determinaron que al agregar inhibidores específicos
de la nitrificación conjuntamente ocurría inhibición del proceso de
desnitrificación, debido posiblemente a la falta de nitratos en los suelos.
Adicionalmente pastizal presentó correlación positiva (p<0,05) entre la
densidad de bacterias desnitrificantes y la concentración de nitratos (R2=
73
0.981) indicando que las mayores densidades presentadas en esta cobertura
fueron posiblemente estimuladas por el nitrato presente en los suelos.
Las densidades más bajas de bacterias desnitrificantes fueron
observadas en bosque independiente del mes de muestreo. Estos resultados
posiblemente se presentaron porque a pesar de que los bosques poseen
suficiente cantidad de materia orgánica, la cual es requerida por las bacterias
desnitrificantes como fuente de energía para realizar el proceso de
desnitrificación, necesitan una calidad adecuada de carbono orgánico. Lo
cual fue confirmado en estudios realizados por Hill y Cardaci (2004) quienes
encontraron bajos niveles de desnitrificación en suelos de bosque a pesar de
haber suficiente materia orgánica disponible y lograron su incremento cuando
incubaron con glucosa estos mismos suelos, debido a que la calidad de la
materia orgánica en los bosques se relaciona con la presencia de
compuestos recalcitrantes de difícil degradación como el acido húmico y la
lignina encontrada en el material leñoso. Las bacterias desnitrificantes al
mismo tiempo que necesitan compuestos orgánicos en cantidad y calidad
adecuada, requieren una concentración proporcionada de nitratos para que
puedan llevar a cabo el proceso de desnitrificación. Los nitratos son
suministrados principalmente a los suelos por las bacterias nitrificantes en el
proceso de nitrificación, por lo tanto posiblemente los recuentos bajos de
bacterias desnitrificantes obtenidos en la cobertura de bosque están en
relación con los bajos recuentos de bacterias nitrificantes presentes en este
estudio. Densidad de BOA (2.85 ±0.33 y 2.39 ±0.04 Log10 NMP/gps), en Junio
y Octubre respectivamente. Resultados similares fueron encontrados por
Rich y col. (2003), al estudiar procesos de desnitrificación en suelos de
bosque y pradera, obteniendo los menores índices de desnitrificación en
suelo de bosque y asociaron estos resultados con recuentos disminuidos de
bacterias nitrificantes y bajas tasas de nitrificación. Igualmente para el mes
de Octubre, en la ventana La Vieja, CFSS presentó la mayor disminución en
74
las densidades de bacterias desnitrificantes. Esta disminución mostró
relación con las bajas densidades de BOA y BON observadas en esta
cobertura, y que pudieron tener un efecto sobre la densidad de bacterias
desnitrificantes. Las densidades de BOA fueron (3.32 ±0.23 y 2.86 ±0.07
Log10 NMP/gps), y para BON (5.34 ±0.17 y 4.18 ±0.33 Log10 NMP/gps), en
Junio y Octubre respectivamente.
6.4. Comparación de los parámetros físico químicos en las coberturas
de la ventana La Vieja.
Los parámetros físico-químicos determinados para la ventana La Vieja
fueron: pH, temperatura, humedad, y concentración de nitrato.
Durante Junio y Octubre los mayores valores de pH fueron observados
en guadual mientras que bosque presentó los valores de pH más bajos,
seguidos por pastizal y CFSS (Anova: p < 0.05; n=24) (Figura 18) (Anexo 29).
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
Bosque Guadual CFSS Pastizal
Coberturas
pH
Junio Octubre
Figura 18. pH en las coberturas de la ventana La Vieja durante el estudio. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar
75
En los meses de Junio y Octubre se observó la temperatura en
pastizal significativamente mayor que bosque, mientras que CFSS, guadual y
pastizal no presentaron diferencias significativas (Anova: p < 0.05; n=24)
(Figura 19). En bosque se observaron bajas temperaturas debido
posiblemente a que el follaje reduce la radiación solar que llega al suelo y la
alta densidad de la vegetación disminuye la velocidad de los vientos, ambos
factores contribuyen en la disminución de la temperatura y la evaporación.
Caso contrario sucede en la cobertura de pastizal donde se observaron las
mayores temperaturas, puesto que los rayos solares pueden penetrar al
suelo a pesar de haber cobertura de pasto, debido a que se presenta
defoliación en las gramíneas por los animales y ausencia de árboles (Yara y
Roa, 2002; Murgueitio, 2003).
0
5
10
15
20
25
30
Bosque Guadual CFSS Pastizal
Coberturas
Tem
pera
tura
o C
Junio Octubre
Figura 19. Temperatura en las coberturas de la ventana La Vieja durante el estudio. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar
En el mes de Junio guadual presentó los valores de humedad
mayores, mientras que pastizal presentó los valores más bajos, seguido por
CFSS y bosque. Para el mes de Octubre bosque presentó los valores de
humedad mayores, mientras que pastizal siguió presentando los valores más
76
bajos (Anova: p < 0.05; n=24) (Figura 20). Los mayores valores de humedad
en guadual y bosque es causada posiblemente porque en los guaduales los
tallos y el sistema radicular almacenan agua para liberarla luego en la medida
que el suelo lo requiera, y en los bosques, la densidad de la vegetación
disminuye la velocidad de los vientos y el agua al evaporarse en las hojas de
los árboles contribuyen a los niveles de humedad en el área (Held y
Manzano, 2004).
0
10
20
30
40
50
Bosque Guadual CFSS Pastizal
Coberturas
Hum
edad
(%
)
Junio Octubre
Figura 20. Humedad en las coberturas de la ventana La Vieja, durante el estudio. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar
En el mes de Junio, la mayor concentración de nitratos fue observada
en guadual mientras bosque presentó las concentraciones más bajas,
seguida por pastizal y CFSS, sin observarse diferencias significativas en las
coberturas. En Octubre se presentó una disminución significativa en la
concentración de nitratos en la mayoría de las coberturas. Sin embargo,
CFSS presentó las concentraciones más altas, mientras pastizal presentó
las concentraciones más bajas, sin haber diferencias significativas entre
ellas (Anova: p < 0.05; n=24) (Figura 21).
77
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Bosque Guadual CFSS Pastizal
Coberturas
N-N
O3- m
g/m
l
Junio Octubre
Figura 21. Concentración de nitratos en las coberturas de la ventana La Vieja, durante el estudio. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar. 6.5. Comparación de los parámetros físico químicos para las
coberturas de la ventana Otún.
Al igual que en la ventana La Vieja los parámetros fisicoquímicos
determinados para la ventana Otún fueron: pH, Temperatura, % de
humedad, y concentración de nitratos.
Durante los meses de Junio y Octubre, cebolla presentó los valores
de pH significativamente mayores, mientras que forestal presentó los
valores de pH más bajo, seguidos por bosque y guadual (Anova: p < 0.05;
n=24) (Figura 22). Durante Octubre se presentó aumento significativo en los
valores de pH en la mayoría de las coberturas.
78
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
Bosque Guadual Cebolla Forestal
Coberturas
pH
Junio Octubre
Figura 22. pH en las coberturas de la ventana Otún, durante el estudio. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar.
Durante Junio y Octubre cebolla presentó los valores de temperatura
significativamente mayores, mientras que bosque presentó los valores más
bajos, seguido por guadual y forestal (Anova: p < 0.05; n=24) (Figura 23).
0
5
10
15
20
25
30
Bosque Guadual Cebolla Forestal
Coberturas
Tem
pera
tura
o C
Junio Octubre
Figura 23. Temperatura en las coberturas de la ventana Otún, durante el estudio. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar.
79
Para Junio, bosque presentó el valor significativamente mayor de
humedad, mientras que cebolla presentó el valor más bajo, seguido de
forestal y guadual. Para el mes de Octubre forestal presentó el valor de
porcentaje de humedad mayor, mientras que cebolla siguió presentando el
valor más bajo, seguido por bosque y guadual. En Octubre se observó una
disminución significativa en los valores de humedad en todas las coberturas
(Anova: p < 0.05; n=24) (Figura 24).
0
10
20
30
40
50
Bosque Guadual Cebolla Forestal
Coberturas
Hum
edad
(%
)
Junio Octubre
Figura 24. Humedad en las coberturas de la ventana Otún durante el estudio. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar.
En Junio bosque presentó la concentración de nitratos
significativamente mayores, mientras que en cebolla se observó la
concentración más baja, seguida por forestal y guadual. Durante Octubre
cebolla presentó las concentraciones de nitratos significativamente
mayores, mientras bosque presentó las concentraciones más bajas, seguido
de forestal y guadual (Anova: p < 0.05; n=24) (Figura 25). En Octubre se
observó una disminución significativa en la concentración de nitratos en la
gran mayoría de las coberturas.
80
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Bosque Guadual Cebolla Forestal
Coberturas
N-N
O3- m
g/m
l
Junio Octubre
Figura 25. Concentración de nitratos en las coberturas de la ventana Otún, durante el estudio. Se presenta el promedio (n= 6) ± 1 desviación estándar.
6.6. Efecto de la cobertura vegetal sobre la densidad de bacterias
nitrificantes y desnitrificantes.
En términos generales en las cuencas La Vieja y Otún, las
densidades de BOA, BON y bacterias desnitrificantes presentaron una
disminución para Octubre en la gran mayoría de las coberturas (Tabla 8).
En el análisis de los parámetros físico químicos se observó que el pH
aumentó en la gran mayoría de las coberturas para Octubre (Anexo 29 y
30), sin embargo, en general los suelos en estudio se caracterizaron por ser
ácidos. Esta acidificación prolongada en los suelos posiblemente se dio ya
que los procesos de nitrificación ocasionan liberación de iones hidrógeno, al
transformar el amonio en nitratos, ayudando en la lixiviación de iones como
calcio y aumento de iones tóxicos como aluminio (Dalby et al 2004), lo que
probablemente contribuyó a la disminución en las densidades de las
bacterias nitrificantes y desnitrificantes para Octubre. Este efecto fue
81
observado por Kemmitt y col. (2005) al investigar la regulación del pH en la
dinámica del carbono y nitrógeno, encontrando que la acidez prolongada
aumentaba los niveles de aluminio y molibdeno, causando reducción en la
disponibilidad de sustratos e induciendo toxicidad en el suelo. Asimismo, la
acidificación prolongada puede conducir a una reducción en la fijación del
nitrógeno y en la acumulación de materia orgánica por descenso en la tasa
de mineralización por disminución en la actividad microbiana, afectando en
forma negativa las densidades de bacterias nitrificantes y desnitrificantes.
Adicionalmente la utilización de fertilizantes que contienen amonio o
producen amonio puede incrementar la acidez en los suelos si las plantas
no absorben este amonio directamente o si es añadido en exceso (Dalby et
al 2004; Brouwer et al., 2006).
Además durante el mes de Octubre se observó que todas las
coberturas en estudio en las ventanas La Vieja y Otún presentaron una
disminución en los valores del porcentaje de humedad, a pesar de ser época
de lluvia. Pero con base en los datos ambientales mensuales
(precipitaciones) (ANEXO 31), los meses de Junio y Octubre corresponden
es a períodos transicionales entre temporada húmeda y seca para Junio y de
seca a húmeda para Octubre (Federación Nacional de Cafeteros de
Colombia, 2007) guardando relación con los datos de porcentaje de humedad
obtenidos para este estudio.
En el presente estudio también se evidenciaron para Junio y Octubre
en la cobertura de bosque los valores de pH (5.0±1.06 y 5.3±0.41, 5.3±0.58 y
5.7 ±0.18) temperatura (19.7±2.19 y 19.2±1.84, 18.3±0.10 y 13.9±2.88) más
bajos en la ventana La Vieja y Otún respectivamente al compararlos con las
coberturas en estudio (Anexo 29 y 30), siendo valores característicos en los
suelos de bosques y limitantes para el crecimiento de BOA y BON. Esto es
debido a que la mineralización del nitrógeno para la producción de amonio,
82
suele ser lenta cuando se presentan bajas en la temperatura y el pH del
suelo. Adicionalmente en esta cobertura se presentó una correlación negativa
(p<0,05) entre el porcentaje de humedad y el pH (R2= 0.925). Esta humedad
posiblemente favorece la lixiviación de las formas básicas del suelo como
iones de Ca+ y Mg+ ayudando en la acidez del suelo (Harrison, 1999). Los
suelos ácidos, posiblemente pudieron causar disminución de la densidad de
las bacterias nitrificantes en los bosques, y a la vez afectar la densidad de
bacterias desnitrificantes.
Contrariamente a lo que sucedió durante los meses de Junio y
Octubre en la cobertura de pastizal donde se presentaron valores de
temperatura (24.6±2.5 y 23.3±2.83) más altos y valores de humedad
(32.7±5.0 y 21.2±6.85) más bajos al compararlos con las coberturas en
estudio en la ventana La Vieja (Anexo 29). Además la cobertura de cebolla
presentó los valores de pH (6.1±0.25 y 5.8±0.17), temperatura (23.0±0.97 y
21.1±2.10) más altos y valores de humedad (30.3±3.99 y 25.3±6.39) más
bajos al compararlos con las coberturas en estudio en la ventana Otún. Estos
factores físico-químicos posiblemente pudieron también influir en las mayores
densidades de bacterias nitrificantes y desnitrificantes obtenidas en estas
coberturas en el presente estudio.
Tanto las bacterias nitrificantes como desnitrificantes necesitan para
su crecimiento rangos de pH cercanos a la neutralidad, temperaturas
comprendidas entre 20 y 30oC y además las bacterias nitrificantes crecen en
suelos con poca humedad. Los rangos de humedad observados en pastizal y
cebolla fueron entre (20-30%) favoreciendo la circulación del oxígeno y
ayudando a que se presentaran densidades altas de bacterias nitrificantes, lo
que contribuyó a su vez a las mayores densidades de bacterias
desnitrificantes. Esta contribución es estimulada porque las bacterias
nitrificantes al utilizar el amonio como fuente de energía causan
83
microambientes anaerobios por el agotamiento de oxígeno y la formación de
nitratos. La poca humedad en cebolla es debida a la manera como se lleva a
cabo el manejo de este cultivo en la EC, el cual se caracteriza por la
presencia de pendientes que evitan la acumulación de agua cuando llueve o
se utiliza sistema de regadío (Castellanos, 1999). Conjuntamente la poca
humedad en pastizal es debida a la compactación resultante del tránsito de
los animales que afectan en forma negativa el flujo del agua a través de los
horizontes del suelo (Murgueitio, 2003).
En este estudio se pudo observar el efecto de usos de suelo sobre la
densidad de BOA, BON y bacterias desnitrificantes ya que en las coberturas
más intervenidas por el hombre en prácticas como la agricultura y la
ganadería se obtuvieron las mayores densidades (pastizal, CFSS y cebolla),
presentando diferencias significativas con coberturas menos intervenidas
como los bosques. Las adiciones de fertilizantes preparados con base en
compuestos nitrogenados contribuyeron en las mayores densidades de
bacterias nitrificantes y desnitrificantes. Además los parámetros físico
químicos que se determinaron en estas coberturas fueron factores influyentes
en las densidades de las bacterias en estudio.
6.7. Aislamiento de bacterias nitrificantes
Durante el estudio se aislaron 13 cepas de BOA y 9 cepas de BON
de los NMP. La descripción morfológica de estas cepas se realizó mediante
la observación de su crecimiento en medio sólido y la descripción
microscópica de las células mediante la coloración de Gram al microscopio.
Para las BOA, la morfología microscópica guardó relación en las cepas
aisladas presentando forma de bacilo muy pequeño, cocoide o coco bacilar
Gram (-) y la morfología macroscópica se relacionó con la descripción
reportada en la literatura científica (Tabla 9).
84
Tabla 9. Características fenotípicas de las cepas aisladas de BOA
Cepa Morfología macroscópica Morfología microscópica
1 Colonia puntiforme, abultada traslucida Bacilo muy pequeño Gram (-)
2 Colonia puntiforme, abultada traslucida con un halo Cocobacilo Gram (-)
3 Colonia puntiforme abultada borde entero cocobacilo Gram(-)
4 Colonia pequeña con halo, abultada, borde entero Bacilo pequeño Gram (-)
5 Colonia puntiforme, abultada borde entero Coco bacilo Gram (-)
6 Colonia pequeña, abultada traslucida, Bacilo pequeño Gram(-)
7 Colonia puntiforme, redonda, abultada Coco bacilo Gram(-)
8 Colonia pequeña, abultada redonda Coco pequeño Gram (-)
9 Colonia pequeña, abultada borde entero Cocobacilo Gram (-)
10 Colonia puntiforme, redonda, abultada Coco bacilo Gram (-)
11 Colonia pequeña, abultada, traslucida Coco bacilo Gram(-)
12 Colonia pequeña, abultada borde entero con halo Bacilo muy pequeño Gram (-)
13 Colonia puntiforme con halo abultada borde entero Coco bacilo Gram (-)
Para las BON la morfología microscopia y macroscópica fue muy
similar en todas las cepas aisladas, presentando forma de bacilo corto con
los extremos muy delgados Gram (-) y la morfología macroscópica se
caracterizó por presentar colonias puntiformes, abultadas con borde entero
y traslucidas.
6.8. Aislamiento de bacterias desnitrificantes
Durante el estudio se aislaron 42 cepas. La descripción
morfológica de cada una de estas cepas se realizó con base en la
descripción macroscópica de las colonias aisladas y la descripción
microscópica de las células mediante la coloración de Gram al
microscopio Tabla (10 y 11).
85
Tabla 10. Características fenotípicas de las cepas desnitrificantes
aisladas en Junio
Cepa Morfología macroscópica Morfología microscópica
1 Colonia pequeña, café abultada borde irregular
Bacilo delgado, mediano, móvil esporulado Gram (-)
2 Colonia pequeña, café redonda Bacilo delgado, corto, móvil, esporulado Gram (-)
3 Colonia grande, café abultada Bacilo delgado, corto esporulado Gram(-)
4 Colonia pequeña, café. Abultada borde entero
Bacilo delgado, mediano móvil, esporulado Gram (-)
5 Colonia grande, crema abultada borde irregular Bacilo delgado, móvil Gram (-)
6 Colonia grande, café claro, redonda abultada
Bacilo móvil, grueso esporulado Gram(+)
7 Colonia grande, café, abultada borde irregular Bacilo largo, esporulado móvil Gram(-)
8 Colonia grande, crema abultada borde irregular Bacilo corto, grueso móvil Gram (+)
9 Colonia grande, café, abultada borde entero
Bacilo corto, grueso, móvil esporulado Gram (-)
10 Colonia grande, crema abultada Bacilo largo, grueso, móvil Gram(+)
11 Colonia grande, abultada, borde irregular Bacilo delgado, mediano Gram (-)
12 Colonia pequeña, traslucida, abultada, borde entero Bacilo delgado, mediano Gram (-)
13 Colonia grande, crema redonda, borde irregular Bacilo corto, grueso Gram (+)
14 Colonia grande, café claro, borde irregular
Bacilo corto, grueso, esporulado Gram (-)
15 Colonia pequeña, crema, borde irregular, redonda
Bacilo corto, delgado móvil esporulado Gram(-)
16 Colonia grande, café, abultada, borde irregular
Bacilo delgado, móvil, esporulado Gram(-)
17 Colonia pequeña, traslucida, redonda
Bacilo delgado, móvil, esporulado Gram(-)
18 Colonia mediana, café abultada, borde entero Bacilo corto, móvil Gram (+)
19 Colonia mediana café intenso, abultada, borde irregular Bacilo largo, mediano, móvil, Gram(-)
20 Colonia café, abultada, borde entero Bacilo largo, grueso, móvil Gram(+)
21 Colonia café, grande, borde entero Bacilo largo, grueso, móvil Gram(+)
22 Colonia grande, crema redonda, borde irregular Bacilo corto, grueso, móvil Gram(+)
86
Tabla 11. Características fenotípicas de las cepas desnitrificantes
aisladas en Octubre
Cepa Morfología macroscópica Morfología microscópica
1 Colonia pequeña, café abultada borde irregular Bacilo corto, móvil Gram (-)
2 Colonia pequeña, café redonda Bacilo grueso, corto, móvil, esporulado Gram (+)
3 Colonia grande, crema, abultada, borde irregular
Bacilo delgado, corto esporulado Gram(-)
4 Colonia grande, café. Abultada borde irregular
Bacilo grueso, mediano móvil, esporulado Gram (+)
5 Colonia pequeña, café, abultada borde irregular Bacilo delgado, móvil Gram (-)
6 Colonia grande, café claro, redonda abultada
Bacilo delgado, móvil, esporulado Gram(-)
7 Colonia grande, café, abultada borde irregular
Bacilo mediano, esporulado móvil Gram(-)
8 Colonia grande, crema abultada borde irregular
Bacilo corto, grueso, esporulado, móvil, Gram (+)
9 Colonia grande, café, abultada borde entero
Bacilo mediano, delgado, móvil Gram (-)
10 Colonia grande, crema abultada Bacilo corto, grueso, móvil esporulado, Gram(+)
11 Colonia grande, café, abultada, borde irregular
Bacilo largo, delgado, móvil Gram (-)
12 Colonia pequeña, café, abultada, borde entero Bacilo delgado, mediano Gram (-)
13 Colonia grande, crema redonda, borde irregular
Bacilo corto, grueso esporulado Gram (+)
14 Colonia pequeña, café claro, borde irregular Bacilo corto, delgado, Gram (-)
15 Colonia pequeña, crema, borde irregular, redonda
Bacilo corto, delgado móvil esporulado Gram(+)
16 Colonia grande, café, abultada, borde irregular
Bacilo mediano, delgado, móvil, esporulado Gram(-)
17 Colonia mediana, café, redonda abultada
Bacilo largo, grueso, móvil, esporulado Gram(+)
18 Colonia mediana, café abultada, borde entero
Bacilo corto, grueso, móvil Gram (+)
19 Colonia mediana, crema, abultada, borde irregular
Bacilo corto, grueso, móvil, Gram(+)
20 Colonia café, abultada, borde entero
Bacilo corto, grueso, móvil Gram(+)
87
Los aislamientos de bacterias nitrificantes y desnitrificantes obtenidos
durante el estudio serán identificados por medio de técnicas moleculares
(amplificación del gen 16 rDNA y posterior secuenciación), y utilizadas como
controles positivos en posteriores investigaciones.
.
Figura 26. Vista microscópica de la cepa 18 en el mes de Junio.
Figura 27. Vista microscópica de la cepa 17 en el mes de Octubre.
88
7. CONCLUSIONES Los parámetros seleccionados para el cultivo de bacterias nitrificantes y
desnitrificantes permitieron el crecimiento y cuantificación por la técnica de
NMP, logrando determinar su densidad en las diferentes coberturas de la
EC.
El efecto del uso del suelo se pudo observar sobre la densidad de BOA,
BON y bacterias desnitrificantes, ya que fue posible determinar un aumento
de sus densidades en las coberturas donde se adicionan fertilizantes
nitrogenados.
Parámetros como pH, humedad, temperatura y nitratos tuvieron un efecto
significativo sobre la densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes.
.
De las bacterias del ciclo del nitrógeno evaluadas en este estudio, se
determinó que las BOA presentaron densidades significativamente mayores
en las coberturas donde se adicionan fertilizantes nitrogenados, durante los
dos eventos de muestreo, siendo altamente sensibles a cambios en su
microhábitat y se determinó por lo tanto que tienen gran potencial para ser
utilizadas como indicadores de la calidad de los suelos.
Durante el crecimiento y aislamiento de las bacterias nitrificantes y
desnitrificantes fue necesario utilizar parámetros específicos de cultivo como
la fuente de energía y de carbono, además se requirieron largos periodos de
tiempo.
89
8. RECOMENDACIONES
Además de estimar la densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes
en las coberturas de la EC es necesario hacer estudios sobre su actividad
metabólica (nitrificante y desnitrificante) y poder determinar si el uso del
suelo tiene algún efecto sobre esta actividad.
Continuar con los trabajos en el laboratorio para optimizar condiciones de
crecimiento más adecuadas para el estudio y el mantenimiento de las
cepas.
Realizar identificación de las bacterias nitrificantes y desnitrificantes
aisladas, mediante técnicas moleculares para que puedan utilizarse en
posteriores investigaciones.
Estudiar la composición, dinámica y actividad enzimática de las bacterias
nitrificantes y desnitrificantes principalmente BOA, en suelos con poca y alta
intervención antropogénica, debido a que estas bacterias presentaron alta
sensibilidad a cambios en su medio ambiente.
90
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100
ANEXO 1
Medio de cultivo estandarizado para bacterias oxidadoras de amonio (BOA)
(Aakra et al., 1999; Calvo; L, 2005).
Componente Cantidad (g/l)
(NH4)2SO4 0.5
MgSO4 * 7H2O 0.04
CaCl2 * 2H2O 0.02
KH2PO4 0.2
NaHCO3 0.125
Rojo de fenol 0.001
Solución de oligoelementos 1 ml
Preparación de la solución de oligoelementos Componente Cantidad (mg/l)
FeSO4 2.46
EDTA di sódico 3.31
MnCL *4 H2O 0.2
CoCL2 * 6 H2O 0.002
ZnSO4 *7 H2O 0.1
CuSO4 * 5 H2O 0.02
Na2MoO4 * 2 H2O 0.1
Llevar a 1 litro de agua desionizada, ajustar pH a 7.6-7.8 con NaOH 1.0 N.
Esterilizar en autoclave 121 oC por 20 min.
NaHCO3 es adicionado después de la esterilización.
101
ANEXO 2 Medio de cultivo estandarizado para bacterias oxidadoras de nitritos (BON)
(Stienstra, 1993; Bigelow et al., 2002).
Componente Cantidad (g/l) NaNO2 0.0035
MgSO4 * 7H2O 0.035
CaCl2 * 2H2O 0.02
KH2PO4 0.1
K2HPO4 0.2
NaHCO3 0.125
NaCL 0.5
Solución de oligoelementos 1 ml
Llevar a 1 litro de agua desionizada, ajustar pH a 7.6-7.8, con NaOH 1.0 N.
Esterilizar en autoclave a 121oC por 20 min.
NaHCO3 será adicionado después de la esterilización.
102
ANEXO 3 Medio de cultivo para bacterias heterótrofas.
Componente Cantidad (g/l) Extracto de levaduras 0.5
Peptona 0.5
Caseína hidrolizada 0.5
Glucosa 0.5
Almidón 0.5
Fosfato de potasio 0.3
Sulfato de magnesio 0.024
Piruvato de sodio 0.3
Llevar a 1 litro de agua desionizada pH 7.2 - 7.4.
Esterilizar en autoclave a 121 oC por 20 min.
.
103
ANEXO 4
Medio de cultivo estandarizado para bacterias desnitrificantes (Marazioti et
al., 2002, Casasus et al., 2005).
Componente Cantidad (g/L) NaCl 1.0
NH4Cl 1.0
MgS04 * 7 H20 0.2
K2HPO4 5.0
KH2PO4 1.5
Acetato de sodio 1.0
KNO3 2.0
MgCL2 * 6 H20 0.4
Extracto de levaduras 0.05
Solución de oligoelementos 1.0 ml
Ajustar el pH 7.1 –7.2 con NaOH 1 normal
Llevar a ebullición el medio de cultivo, marcando previamente a un litro,
agregar un 10% de ese volumen con agua desionizada, una vez que se
llegue al volumen inicial después de la ebullición, servir en tubos hungate 9
ml del medio de cultivo bajo atmósfera de nitrógeno. Antes de llevar los
tubos al autoclave, hacer cambio de fase N2:CO2. Previo a la inoculación de
las diluciones del suelo se adicionara a cada tubo hungate.
NaHCO3 al 10% 0.1 ml
N2S al 2% 0.1 ml
Etanol 1 g/L 0.03 ml
104
ANEXO 5
Técnica del tubo rodado para el aislamiento de las bacterias desnitrificantes.
Para el procedimiento se utilizan 3 tubos con 5 ml de medio mineral y 4
tubos con 5 ml de medio sólido (medio mineral adicionado con agar
bacteriológico 1.5 %).
Se toma con jeringa 1 ml con del tubo positivo del NMP para bacterias
desnitrificantes y se inocula en el primer tubo liquido y se siguen las
diluciones hasta 10-7 (3 primeras diluciones en medio liquido y 4 diluciones en
medio sólido).
Para realizar la inoculación en los tubos sólidos hay que hacer un
precalentamiento de los tubos.
Se dejan enfriar un poco los tubos y se adiciona la dilución respectiva.
Seguidamente el tubo se pone a girar y se le frota hielo hasta que el medio
de cultivo solidifique y se deposite en las paredes.
Los tubos son llevados a incubación a 28±2 oC por 15 d
105
ANEXO 6
Comparación de CaCO3 y NaHCO3 como fuente de carbono, utilizando las
densidades de BOA y BON.
Cobertura Finca NMP BOA CaCO3
NMP BOA NaHCO3
NMP BON CaCO3
NMP BON NaHCO3
Bosque La Ilusión 2.32 2.61 3.10 4.97 Bosque La Ilusión 2.16 2.44 2.77 5.24 Bosque La Ilusión 1.96 2.52 2.92 5.09 Bosque Bremen 2.17 2.94 3.29 4.79 Bosque Bremen 2.46 3.25 2.89 4.88 Bosque Bremen 2.27 3.10 3.06 4.81 Guadual La Ramada 2.37 2.86 3.90 5.34 Guadual La Ramada 2.41 3.34 3.54 5.27 Guadual La Ramada 2.25 3.28 3.12 5.13 Guadual La Comarca 2.22 2.86 3.08 5.06 Guadual La Comarca 2.38 3.11 2.78 5.33 Guadual La Comarca 2.51 2.86 3.17 5.13 Cafetal La Alegría 2.94 3.28 3.34 5.40 Cafetal La Alegría 3.25 3.53 3.60 5.38 Cafetal La Alegría 2.16 3.22 3.26 5.59 Cafetal El Bolsillo 2.52 2.83 3.07 5.14 Cafetal El Bolsillo 2.16 3.16 3.51 5.36 Cafetal El Bolsillo 2.32 3.37 3.09 5.16 Pastizal La Ramada 2.46 3.45 3.07 5.31 Pastizal La Ramada 2.27 2.94 3.25 4.94 Pastizal La Ramada 2.52 2.98 3.08 5.09 Pastizal Villa Ximena 2.98 3.62 4.94 5.37 Pastizal Villa Ximena 3.16 3.58 4.70 5.39 Pastizal Villa Ximena 3.12 3.46 4.52 5.25
106
ANEXO 7
Densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en las coberturas de la
ventana La Vieja en el mes de Junio.
Ventana Cobertura Finca Log 10 BOA
Log 10 BON
Log 10 Deni
Bosque La Ilusión 2.61 4.97 0.51 Bosque La Ilusión 2.44 5.25 0.46 Bosque La Ilusión 2.52 5.10 NR Bosque Bremen 2.94 4.80 0.59 Bosque Bremen 3.25 4.89 NR Bosque Bremen 3.10 4.81 0.62 Guadual La Ramada 2.86 5.34 0.56 Guadual La Ramada 3.34 5.28 NR Guadual La Ramada 3.28 5.13 0.55 Guadual La Comarca 2.86 5.07 0.54 Guadual La Comarca 3.11 5.23 0.57 Guadual La Comarca 2.86 5.14 NR Cafetal La Alegría 3.28 5.41 0.60 Cafetal La Alegría 3.53 5.39 0.55 Cafetal La Alegría 3.22 5.60 NR Cafetal El Bolsillo 2.83 5.15 0.69 Cafetal El Bolsillo 3.16 5.36 NR Cafetal El Bolsillo 3.37 5.16 0.74 Pastizal La Ramada 3.45 5.32 0.72 Pastizal La Ramada 2.94 4.94 0.68 Pastizal La Ramada 2.98 5.09 NR Pastizal Villa Ximena 3.62 5.37 0.78 Pastizal Villa Ximena 3.58 5.39 0.76
La Vieja Junio
Pastizal Villa Ximena 3.46 5.25 NR
NR= No Realizado
107
ANEXO 8
Densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en las coberturas de la
ventana La Vieja en el mes de Octubre.
Ventana Cobertura Finca Log 10 BOA
Log 10 BON Log 10 Deni
Bosque La Ilusión 2.52 4.82 0.51 Bosque La Ilusión 2.82 4.47 0.46 Bosque La Ilusión 2.74 4.44 NR Bosque Bremen 2.25 3.92 0.59 Bosque Bremen 2.46 4.06 NR Bosque Bremen 2.27 4.02 0.62 Guadual La Ramada 2.77 3.51 0.56 Guadual La Ramada 3.09 3.81 NR Guadual La Ramada 2.66 4.12 0.55 Guadual La Comarca 2.90 4.82 0.54 Guadual La Comarca 2.93 4.74 0.57 Guadual La Comarca 3.22 4.75 NR Cafetal La Alegría 3.40 3.76 0.60 Cafetal La Alegría 3.76 3.89 0.55 Cafetal La Alegría 3.70 4.05 NR Cafetal El Bolsillo 1.96 4.41 0.69 Cafetal El Bolsillo 2.16 4.58 NR Cafetal El Bolsillo 2.32 4.45 0.74 Pastizal La Ramada 3.63 4.09 0.72 Pastizal La Ramada 3.28 4.03 0.68 Pastizal La Ramada 3.22 3.88 NR Pastizal Villa Ximena 3.41 4.78 0.78 Pastizal Villa Ximena 3.38 4.91 0.76
La Vieja Octubre
Pastizal Villa Ximena 3.25 4.44 NR
NR= No Realizado
108
ANEXO 9
Densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en las coberturas de la
ventana Otún en el mes de Junio.
Ventana Cobertura Finca Log 10
B0A Log 10 BON
Log 10 Deni
Bosque Sta Helena 2.22 3.55 0.49 Bosque Sta Helena 2.38 3.95 0.46 Bosque Sta. Helena 2.51 3.84 NR Bosque La Pastora 3.04 4.82 0.49 Bosque La Pastora 2.88 5.19 0.55 Bosque La Pastora 3.39 5.15 NR Guadual La Playa 3.96 4.90 0.58 Guadual La Playa 4.00 4.86 0.53 Guadual La Playa 4.01 4.82 NR Guadual Mandalay 2.98 4.89 0.54 Guadual Mandalay 3.16 4.70 NR Guadual Mandalay 3.12 4.60 0.57 Cebolla Macarena 4.41 5.21 0.63 Cebolla Macarena 4.51 5.38 0.64 Cebolla Macarena 4.33 5.33 NR Cebolla Bella Vista 4.45 5.05 0.61 Cebolla Bella Vista 4.20 4.94 0.58 Cebolla Bella Vista 4.14 4.82 NR
Forestales Lisbran 3.42 4.75 0.55 Forestales Lisbran 3.60 4.82 0.57 Forestales Lisbran 3.75 4.86 NR Forestales Playa Rica 2.68 4.75 0.56 Forestales Playa Rica 2.83 4.76 NR
Otún Junio
Forestales Playa Rica 2.77 4.82 0.56
NR= No Realizado
109
ANEXO 10
Densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en las coberturas de la
ventana Otún en el mes de Octubre.
Ventana Cobertura Finca Log 10 BOA
Log10 BON
Log 10 Deni
Bosque Sta Helena 2.11 3.91 0.27 Bosque Sta Helena 2.30 3.73 0.36 Bosque Sta. Helena 2.25 4.04 NR Bosque La Pastora 2.37 4.62 0.54 Bosque La Pastora 2.41 4.48 0.52 Bosque La Pastora 2.17 4.71 NR Guadual La Playa 3.92 4.88 0.46 Guadual La Playa 3.54 4.95 0.53 Guadual La Playa 3.79 4.87 NR Guadual Mandalay 2.84 4.88 0.39 Guadual Mandalay 2.47 5.01 NR Guadual Mandalay 3.11 4.75 0.43 Cebolla Macarena 4.88 5.18 0.48 Cebolla Macarena 4.82 4.95 0.52 Cebolla Macarena 4.90 4.90 NR Cebolla Bella Vista 4.14 4.89 0.50 Cebolla Bella Vista 3.78 4.79 0.50 Cebolla Bella Vista 3.85 4.79 NR
Forestales Lisbran 2.95 4.45 0.37 Forestales Lisbran 2.92 4.18 0.48 Forestales Lisbran 3.06 4.30 NR Forestales Playa Rica 2.79 4.52 0.29 Forestales Playa Rica 2.93 4.87 NR
Otún Octubre
Forestales Playa Rica 2.74 4.92 0.40
NR= No Realizado
110
ANEXO 11
Análisis del Log10 NMP de BOA en las coberturas de la ventana La Vieja en
el mes de Junio.
Lon1
0 B
OA
Blo
ck C
ente
red
2,5
2,7
2,9
3,1
3,3
3,5
3,7
Bosque Cafetal Guadual Pastizal
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 0,9655322 0,321844 4,2009 0,0185 EM 0 0,0000000 . . . Error 20 1,5322635 0,076613 C. Total 23 2,4977958 Alpha= 0,05 Comparación de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD Abs(Dif)-LSD Pastizal Cafetal Guadual Bosque Pastizal -0,44728 -0,33833 -0,14479 0,07970 Cafetal -0,33833 -0,44728 -0,25374 -0,02925 Guadual -0,14479 -0,25374 -0,44728 -0,22279 Bosque 0,07970 -0,02925 -0,22279 -0,44728 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes.
111
ANEXO 12
Análisis del Log10 NMP de BOA en las coberturas de la ventana La Vieja en
el mes de Octubre.
Lon1
0 B
OA
Blo
ck C
ente
red
2
2,5
3
3,5
4
Bosque Cafetal Guadual Pastizal
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 2,1755155 0,725172 3,6390 0,0304 EM 0 0,0000000 . . . Error 20 3,9855120 0,199276 C. Total 23 6,1610275 Alpha=0,05 Comparación de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD Abs(Dif)-LSD Pastizal Guadual Cafetal Bosque Pastizal -0,72137 -0,28979 -0,24537 0,12804 Guadual -0,28979 -0,72137 -0,67695 -0,30354 Cafetal -0,24537 -0,67695 -0,72137 -0,34796 Bosque 0,12804 -0,30354 -0,34796 -0,72137 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes. Comparación BOA Junio vs. Octubre
Cobertura p Significancia Bosque 0,1020 NSD Guadual 0,3960 NSD CFSS 0,3459 NSD Pastizal 0,8807 NSD
NSD=p�0.05 SD=P�0.05 P�0.05
112
ANEXO 13
Análisis del Log10 NMP de BON en las coberturas de la ventana La Vieja en
el mes de Junio.
Log1
0 N
MP
BO
N
Blo
ck C
ente
red
4,7
4,8
4,9
5
5,1
5,2
5,3
5,4
5,5
5,6
Bosque Cafetal Guadual Pastizal
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 0,44853086 0,149510 5,7134 0,0054 EM 0 0,00000000 . . . Error 20 0,52336809 0,026168 C. Total 23 0,97189895 Alpha= 0,05 Comparacion de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD Abs(Dif)-LSD Cafetal Pastizal Guadual Bosque Cafetal -0,26141 -0,14587 -0,13207 0,11385 Pastizal -0,14587 -0,26141 -0,24761 -0,00169 Guadual -0,13207 -0,24761 -0,26141 -0,01549 Bosque 0,11385 -0,00169 -0,01549 -0,26141 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes.
113
ANEXO 14
Análisis del Log10 NMP de BON en las coberturas de la ventana La Vieja en
el mes de Octubre
Log1
0 N
MP
BO
N
3,4
3,6
3,8
4
4,2
4,4
4,6
4,8
5
Bosque Cafetal Guadual Pastizal
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 0,0821062 0,027369 0,1505 0,9281 Error 20 3,6371333 0,181857 C. Total 23 3,7192394 Alpha=0,05 Comparación de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD Abs(Dif)-LSD Pastizal Bosque Guadual Cafetal Pastizal -0,68912 -0,62698 -0,62640 -0,52593 Bosque -0,62698 -0,68912 -0,68854 -0,58806 Guadual -0,62640 -0,68854 -0,68912 -0,58865 Cafetal -0,52593 -0,58806 -0,58865 -0,68912 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes. Comparación BON Junio vs. Octubre
Cobertura P Significancia Bosque 0,0017 NS Guadual 0,0028 NS CFSS 0,001 NS Pastizal 0,0009 NS
.NSD=p�0.05 SD=P�0.05 P�0.05
114
ANEXO 15
Análisis del Log10 NMP de bacterias BOA en las coberturas de la venta Otún
en el mes de Junio.
Lon1
0 B
OA
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Bosque Cebolla Forestales Guadual
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 7,570850 2,52362 12,0349 0,0001 Error 20 4,193839 0,20969 C. Total 23 11,764689 Alpha=0,05 Comparación de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD Abs(Dif)-LSD Cebolla Guadual Forestales Bosque Cebolla -0,81061 0,06739 0,31802 0,86892 Guadual 0,06739 -0,73999 -0,48806 0,06154 Forestales 0,31802 -0,48806 -0,68509 -0,13655 Bosque 0,86892 0,06154 -0,13655 -0,73999 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes.
115
ANEXO 16
Análisis del Log10 NMP de bacterias BOA en las coberturas de la ventana
Otún en el mes de Octubre.
Lon1
0 B
OA
Blo
ck C
ente
red
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Bosque C Forestales Cebolla Guadual
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 14,328071 4,77602 30,1226 <.0001 EM 0 0,000000 . . . Error 20 3,171058 0,15855 C. Total 23 17,499128 Alpha=0,05 Comparación de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD Abs(Dif)-LSD Cebolla Guadual C Forestales Bosque Cebolla -0,6435 0,4697 0,8503 1,4814 Guadual 0,4697 -0,6435 -0,2629 0,3683 C Forestales 0,8503 -0,2629 -0,6435 -0,0123 Bosque 1,4814 0,3683 -0,0123 -0,6435 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes. Comparación BOA Junio vs. Octubre
Cobertura P Significancia Bosque 0,2975 NSD Guadual 0,4232 NSD Cebolla 0,8216 NSD Forestal 0,1918 NSD
NSD=p�0.05 SD=P�0.05 P�0.05
116
ANEXO 17
Análisis del Log10 NMP de bacterias BON en las coberturas de la ventana
del Otún en el mes de Junio.
Log1
0 N
MP
BO
N
3,5
4
4,5
5
5,5
Bosque Cebolla Forestales Guadual
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 1,0949089 0,364970 2,0046 0,1458 Error 20 3,6413282 0,182066 C. Total 23 4,7362370 Alpha=0,05 Comparación de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD
Abs(Dif)-LSD Cebolla Forestales Guadual Bosque Cebolla -0,75533 -0,35492 -0,37612 -0,08957 Forestales -0,35492 -0,63837 -0,66176 -0,37521 Guadual -0,37612 -0,66176 -0,68952 -0,40297 Bosque -0,08957 -0,37521 -0,40297 -0,68952 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes.
117
ANEXO 18
Análisis del Log10 NMP de los recuentos de BON en las coberturas de la
ventana del Otún en el mes de Octubre.
Log1
0 N
MP
BO
N
Blo
ck C
ente
red
3,6
3,8
4
4,2
4,4
4,6
4,8
5
5,2
Bosque C Forestales Cebolla Guadual
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 1,8185641 0,606188 8,5204 0,0008 EM 0 0,0000000 . . . Error 20 1,4229140 0,071146 C. Total 23 3,2414782 Alpha=0,05 Comparación de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD Abs(Dif)-LSD Cebolla Guadual C Forestales Bosque Cebolla -0,43103 -0,40388 -0,05380 0,23863 Guadual -0,40388 -0,43103 -0,08095 0,21148 C Forestales -0,05380 -0,08095 -0,43103 -0,13860 Bosque 0,23863 0,21148 -0,13860 -0,43103 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes. Comparación BON Junio vs. Octubre
Cobertura P Significancia Bosque 0,4996 NSD Guadual 0,1486 NSD Cebolla 0,2012 NSD Forestal 0,0674 NSD
NSD=p�0.05 SD=P�0.05 P�0.05
118
ANEXO 19
Análisis del Log10 NMP de bacterias desnitrificantes en las coberturas de la
ventana La Vieja en el mes de Junio.
Log1
0 N
MP
DE
NIT
RI
Blo
ck C
ente
red
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
Bosque Cafetal Guadual Pastizal
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > FCobertura 3 0,09468163 0,031561 8,5087 0,0027 EM 0 0,00000000 . . . Error 12 0,04451032 0,003709 C. Total 15 0,13919195 Alpha=0,05 Comparación de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD Abs(Dif)-LSD Pastizal Cafetal Guadual Bosque Pastizal -0,12785 -0,04106 0,04981 0,06284 Cafetal -0,04106 -0,12785 -0,03698 -0,02395 Guadual 0,04981 -0,03698 -0,12785 -0,11482 Bosque 0,06284 -0,02395 -0,11482 -0,12785 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes.
119
ANEXO 20
Análisis del Log10 NMP de bacterias desnitrificantes en las coberturas de la
ventana La Vieja en el mes de Octubre.
Log1
0 N
MP
DE
NIT
RI
Blo
ck C
ente
red
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
Bosque Cafetal Guadual Pastizal
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 0,04573645 0,015245 3,7436 0,0415 Cuenca 0 0,00000000 . . . Error 12 0,04886928 0,004072 C. Total 15 0,09460573 Alpha=0,05 Comparación de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD Abs(Dif)-LSD Pastizal Guadual Cafetal Bosque Pastizal -0,13397 -0,05314 -0,00425 -0,00213 Guadual -0,05314 -0,13397 -0,08508 -0,08296 Cafetal -0,00425 -0,08508 -0,13397 -0,13185 Bosque -0,00213 -0,08296 -0,13185 -0,13397 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes. Comparación bacterias desnitrificantes Junio vs. Octubre
Cobertura P Significancia Bosque 0,8485 NSD Guadual 0,3526 NSD CFSS 0,0879 NSD Pastizal 0,1701 NSD
NSD=p�0.05 SD=P�0.05 P�0.05
120
ANEXO 21
Análisis del Log10 NMP de bacterias desnitrificantes en las coberturas de la
ventana del Otún en el mes de Junio
Log1
0 N
MP
DE
NIT
RI
Blo
ck C
ente
red
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
Bosque Cebolla Forestales Guadual
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 0,02618634 0,008729 11,2409 0,0008 EM 0 0,00000000 . . . Error 12 0,00931820 0,000777 C. Total 15 0,03550454 Alpha= 0,05 Comparación de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD Abs(Dif)-LSD Cebolla Forestales Guadual Bosque Cebolla -0,05850 -0,00929 -0,00234 0,05555 Forestales -0,00929 -0,05850 -0,05154 0,00634 Guadual -0,00234 -0,05154 -0,05850 -0,00061 Bosque 0,05555 0,00634 -0,00061 -0,05850 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes.
121
ANEXO 22
Análisis del Log10 NMP de bacterias desnitrificantes en las coberturas de la
ventana del Otún en el mes de Octubre.
Log1
0 N
MP
DE
NIT
RI
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
Bosque C Forestales Cebolla Guadual
Cobertura
Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 0,02786861 0,009290 1,4076 0,2886 Error 12 0,07919721 0,006600 C. Total 15 0,10706583 Alpha= 0,05 Comparación de todos los pares usando Tukey-Kramer HSD Abs(Dif)-LSD Cebolla Guadual Bosque C Forestales Cebolla -0,17054 -0,12258 -0,09366 -0,05635 Guadual -0,12258 -0,17054 -0,14162 -0,10431 Bosque -0,09366 -0,14162 -0,17054 -0,13323 C Forestales -0,05635 -0,10431 -0,13323 -0,17054 Valores positivos muestran los pares de medias que son significativamente diferentes. Comparación bacterias desnitrificantes Junio vs. Octubre
Cobertura P Significancia Bosque 0,3069 NSD Guadual 0,0166 SD Cebolla 0,0013 SD Forestal 0,0038 ……SD
NSD=p�0.05 SD=P�0.05 P�0.05
122
ANEXO 23
Comparación del Log10 NMP de BOA en la ventana La Vieja en Junio y
Octubre
Lon1
0 B
OA
2
2,5
3
3,5
4
1 2
EM
Junio Octubre
Análisis de varianza
Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F
EM 1 0,4043236 0,404324 2,1480 0,1496
Error 46 8,6588233 0,188235
C. Total 47 9,0631468
123
ANEXO 24
Comparación del Log10 NMP de BON en la ventana La Vieja en Junio y
Octubre.
Log1
0 N
MP
BO
N
3,5
4
4,5
5
5,5
1 2
EM
Junio Octubre
Análisis de varianza
Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F
EM 1 9,839119 9,83912 96,4797 <.0001
Error 46 4,691138 0,10198
C. Total 47 14,530258
124
ANEXO 25
Comparación de los Log10 NMP de bacterias desnitrificantes en la ventana
La Vieja en los meses de Junio y Octubre
Log1
0 N
MP
DE
NIT
RI
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
1 2
EM
Junio Octubre
Análisis de varianza
Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F
EM 1 0,01266444 0,012664 1,6251 0,2122
Error 30 0,23379768 0,007793
C. Total 31 0,24646212
125
ANEXO 26
Comparación de los Log10 NMP de BOA en la ventana Otún en los meses de
Junio y Octubre
Lon1
0 B
OA
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
1 2
EM
Junio Octubre
Análisis de varianza
Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F
EM 1 0,678037 0,678037 1,0658 0,3073
Error 46 29,263817 0,636170
C. Total 47 29,941855
126
ANEXO 27
Comparación de los Log10 NMP de BON en la ventana Otún en los meses de
Junio y Octubre.
Log1
0 N
MP
BO
N
3,5
4
4,5
5
5,5
1 2
EM
Junio Octubre Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F EM 1 0,2575112 0,257511 1,4848 0,2292 Error 46 7,9777152 0,173429 C. Total 47 8,2352265
127
ANEXO 28
Comparación de los Log10 NMP de bacterias desnitrificantes en la ventana
Otún en los meses de Junio y Octubre.
Log1
0 N
MP
DE
NIT
RI
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
1 2
EM
Junio Octubre Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F EM 1 0,10939699 0,109397 23,0196 <.0001 Error 30 0,14257037 0,004752 C. Total 31 0,25196736
128
ANEXO 29
Comparación de los parámetros físico-químicos en la ventana La Vieja en
los meses de Junio y Octubre
Ventana La Vieja Cobertura Ph % Humedad Temperatura
del suelo N-NO3 mg/ml
Bosque
5.0±1.06
36.6±10.3
19.7±2.19
1.42±0.45
Guadual
5.5±0.24
39.9±6.8
22.2±0.14
1.97±0.12
CFSS
5.3±0.29
34.8±6.3
22.9±0-64
1.69±0.19
Junio
Pastizal
5.1±0.84
32.7±5.0
24.6±2.5
1.45±0.44
Bosque
5.3±0.41
32-1±12.0
19.2±1.84
1.40±006
Guadual
6.3± 0.11
23.6±8-24
22.8±0.30
1.42± 0.03
CFSS
6.0±0.43
21.6±6.39
22.4±0.71
1.50±0.34
Octubre
Pastizal
5.6±0.80
21.2±6.85
23.3±2.83
1.32±0.05
129
ANEXO 30
Comparación de los parámetros físico-químicos en la ventana Otún en los
meses de Junio y Octubre
Ventana Otún Cobertura pH % Humedad
temperatura del suelo
N-NO3 Mg/ml
Bosque
5.3±0.58
41.3±8.07
18.3±0.10
1.81±0.08
Guadual
5.4±0.24
39.2 ±2.48
18.9 ±0.49
1.74±0.20
Cebolla
6.1±0.25
30.3±3.99
23.0±0.97
1.37±0.58
Junio
Forestal
4.5±0.51
37.9±7.27
20.7±0.96
1.54±0.65
Bosque
5.7±0.18
26.9±12.0
13.9±2.88
1.33±008
Guadual
5.8± 0.17
27.1±8-24
16.5±8.57
1.42± 0.04
Cebolla
5.8±0.17
25.3±6.39
21.1±2.10
1.83±0.17
Octubre
Forestal
5.4±0.31
31.5±6.85
18.43±1.41
1.35±0.07
130
bANEXO 31
Distribución media mensual de la lluvia (mm) en la Ecorregión Cafetera.
Quindio: Buena vista
�������������������� Quindio: Quimbaya
������������������������ Risaralda: Río Otún
131
.�