Počítačová část1. Databáze na internetu:

(Databáze, navržení primerů)

2. Fylogenetická analýza

Kde se dozvědět více?

• Kurz Computational Genomics(Marc VanRanst)Bioinformatics bookmarks(http://www.kuleuven.ac.be/rega/mvr/bioinformatics.htm)

• Úvod do bioinformatiky/Základy bioinformatiky(F. Cvrčková)

• Molekulární ekologie(letní semestr, populační genetika, analýza paternity)

Kde najdu adresy stránek z tohoto praktika?

(http://www.natur.cuni.cz/~muncling)

DATABÁZE

Primární databáze DNA sekvencí

GenBank (Amerika) EMBL (Evropa) DDBJ (Japonsko)

Databáze genů

Entrez GeneRefSeq

Databáze genových expresních dat

UniGeneGEO

Databáze genomů

NCBIEnsemblUCSC Genome Browser

Důležité odkazy

PROGRAMY

BLASTNa stránkách NCBI, Ensembl

BLATNa stránkách USCS

Primer3 – navrhování primerů

In Silico PCR

RepeatMasker

NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tam najdu skoro vše: GenBank, Entrez Gene, UniGene, MapViewer, BLAST…

ENSEMBL - http://www.ensembl.org/Genome Browser, BLAST

USCS – http://genome.ucsc.edu/Genome Browser, BLAT, In Silico PCR

Formáty sekvencí

• Fasta

• GenBank

• NEXUS

• Phylip

FASTA

>gi|gi-number|gb|accession|locus – description

GATCCTCCATATACAACGGTATCTCCACCTCAGGTTTAGATCTCAACAACGGAACCATTGCCGACATGAGACAGTTAGGTATCGTCGAGAGTTACAAGCTAAAACGAGCAGTAGTCAGCTCTGCATCTGAAGCCGCTGAAGTTCTACTAAGGGTGGATAACATCATCCGTGCAAGACCAAGAACCGCCAATAGACAACATATGTAACATATTTAGGATATACCTCGAAAATAATAAACCGCCACACTGTCATTATTATAATTAGAAACAGAACGCAAAAATTATCCACTATATAATTCAAAGACGCGAAAAAAAAAGAACAACGCGTCATAGAACTTTTGGCAATTCGCGTCACAAATAAATTTTGGCAACTTATGTTTCCTCTTCGAGCAGTACTCGAGCCCTGTCTCAAGAATGTAATAATACCCATCGTAGGTATGGTTAAAGATAGCATCTCCACAACCTCAAAGCTCCTTGCCGAGAGTCGCCCTCCTTTGTCGAGTAATTTTCACTTTTCATATGAGAACTTATTTTCTTATTCTTTACTCTCACATCCTGTAG

GenBank• Obsahuje velmi podrobnou informaci o sekvenci:

Locus Základní vlastnosti sekvence (název, délka, typ)

Definition Výpis genů v sekvenci

Accession Databázové přístupové číslo

Version Verze dané sekvence

Keywords Pod kterými klíčovými slovy ji lze najít

Source organism Zařazení v systému

Reference Článek, kde byla daná sekvence publikována

Features Podrobný popis jednotlivých genů včetně jejich pozic

Origin Sekvence

Sekvence v genetické bance• Jsou známy nějaké sekvence mamuta (nejlépe

cytochrom b)?

• Z jakého druhu mamuta jsou známé sekvence?

• Sekvence si chci stáhnout a porovnat

Využijeme:

1. genetickou banku na stránkách NCBI (National Centre for Biotechnology Information)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

2. Volně dostupný program BioEdit

http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html

Alignment

• Přiřazení dvou i více sekvencí

Sekvence si navzájem odpovídají

Sekvence se liší

Sekvence chybí

• Pairwise Alignment (2 sekvence)– Globální:

• Zhruba stejně dlouhé sekvence

• Snaží se přiřadit od začátku až do konce sekvence

– Lokální:• Jen nejlépe shodující se místa obou sekvencí

• Sekvence různě dlouhé

Např. BioEdit http://www.ebi.ac.uk/http://www.bioinformatics.org/sms2/index.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment

• Multiple Alignment– Více sekvencí– Hledá konzervativní místa– ClustalW

Např. BioEdit,http://www.ebi.ac.uk/,http://www.bioinformatics.org/sms2/index.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Multiple_sequence_alignment

Příklad

• Zkuste provést alignment stažených sekvencí mamutů

• V programu BioEdit lze použít možnost:Accessory Applications – ClustalW Multiple Alignment

Čemu je tato sekvence podobná?

BLASTBasic Local Alignment SearchTool

===========================================

• Hledá lokální (částečné) podobnosti• Na rozdíl od klasického alignmentu, umožňuje velmi

rychle a efektivně prohledávat velké databáze

Úloha

• Vyhledejte sekvence nejpodobnější cytochromu b mamuta

• Použijeme BLAST na stránkách NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

BLAST - Úloha ze života

• Sekvenuji mamuty

• Jedna ze sekvencí se mi nějak nezdáctagccatgc actactcacc agacgcctca accgcctttt catcaatcgc ccacatcact cgagacgtaa attatggctg aatcatccgc taccttcacg ccaatggcgc ctcaatattc tttatctgcc tcttcctaca catcgggcga ggcctatatt acggatcatt tctctactca gaaacctgaa acatcggcat tatcctcctg cttgcaacta tagcaacagc cttcataggc tatgtcctcc cgtgaggaca aatatcattc tga

• V laboratoři se pracuje i s jinými zvířaty

• Chci zjistit, kdo mi zkontaminoval vzorky

Navržení vlastních primerů pro PCR

http://www.repeatmasker.org/

RepeatMasker

• Umožní vyhledat a „zakrýt“ oblasti, které jsou v genomu ve větším počtu (mikrosatelity, retrotranspozony a transpozony)

• Umožní nám to při navrhování primerů se vyvarovat nespecifickým amplifikacím při PCR

• Pouze ale organismy, které jsou již osekvenovány

Zamaskovaná sekvence

• Pomocí N nebo použitím malých písmen (většina programů určených pro analýzu sekvencí s nimi umí pracovat)

>MusY.1ACACTTTTTCTTTTGCATAATGCTGTGTGGAGATTTTGCAGACAGCATTGCTGTAAAATGCAGAGTAATTTCTGTAATGAGCTTGTGAAATATTGACTATTATGGCCCTCTCTAAGCATGGCTTTAATTATATTCTAGCACAGCAGCTTCTCTGGGGATACTCAGGTCAGATCACTGACTGAATGTTGTGTTCATTTGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCATTTGTTGGTGTGCTGAATTCTGTTTTGTTTTGCTTTTAACCTAACTAGCTAGAAATTCTGTCAATCTTTTTTCCTTCCTAGAAAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAAACACAGGCTTT

Primer3, Primer3Plus

http://primer3.sourceforge.net/

TGCG{CGCTAAGA<CTCCT>AA[CACACACACA]CGGAATTAGGGAAC}TT

Included RegionTargetExcluded Region

Maskování repeatů

Koncentrace Mg2+ Koncentrace dNTPs

Rozestup primerů => délka amplifikované oblasti

Elektronická PCR

• Vezme dvojici primerů a zkouší, zda-li by PCR ve známém genomu amplifikovala pouze námi požadovanou oblast nebo i jiné oblasti

• Server UCSC (http://www.genome.ucsc.edu/)

• Lze i na NCBI

Úloha:

• Zjistěte zda-li se nachází v sekvencích mikrosatelity

• Zamaskujte je pomocí Repeatmaskeru

• Navrhněte kolem nich primery v Primer3

• Zjistěte, které z těchto primerů jsou dále použitelné pomocí e-PCR

Vyhledání restrikčních míst

• WebCutter

• http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/

Příklad• Castor fiber • Castor canadensis

• Je známa sekvence cytochromu b (Kuehn at al. 2000)

• V mrazáku mám enzym RsaI (GT/AC)• Lze použít pro rychlé rozlišení druhů?

• Postup: • Stažení sekvencí z genetické banky• Vyhledání restrikčních míst pro RsaI• Navržení primerů

• V praxi bychom samozřejmě výsledky ověřili sekvenováním.

Celé genomy

MAPY:

Cytogenetická(proužky)

Genetická(cM)

Fyzická (Mb, sekvence, složeno z menších úseků - contig)

Příklad:

• Zjistěte přesnou pozici genu pro TLR1 u orangutana a zjistěte, zda se v jeho okolí vyskytují další TLR geny.

Samostatná úloha

• Stáhnout sekvenci cytochromu b alky velké(Pinguinus impennis), tak aby před začátkem i koncem sekvence cyt b byly dostatečně dlouhé oblasti na navrhnutí primerů

• Navrhnout primery na vybranou část sekvence

• Vyhledat podobné sekvence přes BLAST nebo prověřit příbuzné druhy

• Udělat alignment sekvencí sekvencí cytochromu b