LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN GRAM

Kamis, 5 Maret 2015

Kamis, Pukul 13.00 – 16.00 WIB

Nama NPM

Vikneswaran Mutayah 260110132004

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

PEWARNAAN SEDERHANA/TUNGGAL

Nilai TTD

I. TUJUAN

Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri,

dengan menggunakan satu macam zat pewarna.

II. PRINSIP

1. Teknik aseptis

Teknik aseptis memiliki beberapa macam sterilisasi, yaitu

sterilisasi mekanik, sterilisasi fisik dan sterilisasi kimia. Setiap

macam tersebut memiliki prinsip kerja yang berbeda sesuai dengan

keadaan media yang akan disterilisasikan. Apabila dalam

melakukan penelitian maupun percobaan tidak dilakukan teknik

tersebut kemungkinan akan terjadi kontaminasi yang menyebabkan

hasil penelitian atau percobaan itu kurang akurat. Oleh karena itu,

teknik aseptis sangat penting dalam kegiatan praktikum ataupun

penelitian. (Pratiwi, 2008).

2. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik untuk melihat bentuk

morfologi bakteri (basil, cocus, spiral, dll) dengan hanya

menggunakan satu macam zat warna. (Suriawiria, 1999).

3. Ikatan ion

Ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa

aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion

karena adanya muatan listrik baik pada komponen seuler maupun

pada pewarna. (Tryana, S.T, 2008).

III. TEORI DASAR

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur, dan sifat-

sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak

berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut di suspensikan.

Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk

diidentifikasi adalah dengan metode pengecatan atau pewarnaan, hal tersebut juga

berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding

sel bakteri melalui serangkain pengecetan. (Karmana,2008).

Sel bakteri dapat diamati dengan jelas jika menggunakan mikroskop

dengan perbesaran 100 x 10 yang ditambah minyak emersi. Jika dibuat preparat

ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk

memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel

bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras

sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat

asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan

warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. (Karmana,2008).

Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat

warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena

muatan negatif banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam

antara lain cristal violet, methylen blue, safranin, Base Fuchsin, Malachite Green,

dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Subandi, 2009).

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan

sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-

zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin

(komponen kromotofiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi

pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi, pewarnaan

dan penggunaan warna penutup. Suatu preparat yang sudah menyerap zat warna,

kemudian dicuci dengan asam encer maka zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat

juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri ini disebut bakteri

tahan asam, dan ini merupakan ciri khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 2005)

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesiemen mikroba untuk

pemeriksaan mikroskopis adalah penempatan olesan atau lapisan spesiemen pada

kaca objek, fiksasi olesan pada kaca objek dan aplikasi pewarnaan tunggal

(pewarnaan sederhana) atau serangkain larutan pewarna atau reagen

(Pelczar,1986)

Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,

susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus

diperlukan untuk melihat bentuk kapsul atau pun flagella, dan hal-hal terperinci

tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan

ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).

Pewarnaan sederhana merupakan tekhnik pewarnaan yang paling banyak

digunakan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat

sulit,larena selain bakteri itu tidak berwarna juga tranparan dan sangat kecil.

Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu tekhnik pewarnaan sel

bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamat. Oleh karena itu

tekhnik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama

dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. (Hadioetomo, 1993).

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara

komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut

kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen

seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat

dibedakan asam dan pewarna basa. (Hadioetomo, 1993).

Pewarna asam dapat terjadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif.

Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan

negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding

sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh

pewarna asam misalnya: tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat, eosin, dll.

(Hadioetomo, 1993).

Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga

akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri ini jadi berwarna dan terlihat.

Contoh dari pewarna basa misalnya metilen biru, kristal violet, safranin, dan lain-

lain. Teknik pewarnaa asam basa ini hanya menggunaka satu jenis senyawa

pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini

diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentuknya maupun susunan sel.

Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan

senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan

bakteri misalnya, bakteri gram positif dan gram negatif atau bakteri tahan asam

dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti

flagela, kapsula, spora, dan nukleus. (Waluyo,Lud. 2010)

Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan

kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku sebagai berikut,

mempersiapkan kaca objek. Kaca objek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk

membuat apusan dari bakteri yang diwarnai. Mempersiapkan apusan, apusan yang

baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis. Apusan ini

berasal dari biakan cair atau padat. Biakan cair suspensi sel sebanyak satu atau

dua mata ose dan diletakkan ke kaca objek. Lalu diapuskan pada kaca objek

selebar beberapa cm. biarkan mengerig di udara atau diatas apai kecil dengan

jarak 25 cm. (Waluyo,Lud. 2010)

Biakan padat. Bakteri yang dikulturkan pada medium padat tidak dapat

langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu.

Letakkan setetes air pada kaca objek, lalu dengan jarum inokulasi  ambil bakteri

dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering di

udara. Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada kaca objek dapat

dilakukan diantaranya dengan cara memanaskan diatas api. (Waluyo,Lud. 2010)

Faktor yang mempengaruhi pewaraan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,

subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu

preparat yang sudah suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer.bakteri-

bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang

khas bagi suatu spesies. (Waluyo,Lud. 2010)

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat

macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial

dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik

lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau

olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur

pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-

bagian sel mikroba disebut teknik pewarnan diferensial. Sedangkan pengecatan

struktural hanya bisa mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan

bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengectan

endospora, flagela dan pengecatan kapsul. (Waluyo,Lud. 2010)

IV. ALAT DAN BAHAN

IV.1 Alat

1. Bak pewarna

2. Kaca obyek

3. Kapas

4. Kertas saring

5. Mikroskop majemuk

6. Ose

7. Pembakar spirtus.

IV.2 Bahan

1. Air suling

2. Alkohol 70 %

3. Desinfektan

4. Minyak celup

5. Sampel air liur

6. Zat warna karbol fuksin, biru metilen dan karbol gentian violet.

IV.3 Gambar Alat

V.

PROSEDUR

Kaca objek di bersihkan menggunakan alkohol 70 % lalu di

keringkan menggunakan kapas hingga kering dan bersih. Dibuat tanda

pengamatan menggunakan spidol. Dilakukan fiksasi ose diatas api

hingga besi pada ose memerah, didinginkan didekat api. Diambil

sampel air ludah dalam cawan petri menggunakan ose yang telah dingin

lalu dibuat olesan bakteri dari air liur di atas kaca obyek yang bersih

1 2 3

45 6

7

serta bebas lemak. Kaca objek di lewatkan diatas api hingga telihat

kering. Dimulai dengan perlakuan proses pewarnaan menggunakan

pewarna carbol fuksin, dengan meneteskan karbol fuksin secara merata

pada preparat diatas bak warna. Didiamkan selama 5 menit, lalu dibilas

dengan aquadest. Preparat dikeringkan dengan kertas saring, lalu

ditetesi dengan minyak emersi. Diamati pada mikroskop majemuk

dengan obyektif berkekuatan 10x dan 100x. Prosedur diatas diulangi

dengan pewarna metilen blue.

VI. HASIL PENGAMATAN

Pewarnaan menggunakan karbol

fuksin dengan perbesaran 10X.

Pewarnaan menggunakan metilen

blue dengan perbesaran 10X.

Pewarnaan menggunakan karbol

fuksin dengan perbesaran 100X.

Pewarnaan menggunakan metilen

blue dengan perbesaran 100X.

VII. PEMBAHASAN

Pada percobaan ini, telah dipelajari untuk mengamati morfologi bakteri yang

melingkungi ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri dengan

menggunakan satu macam zat pewarna. Pada percobaan kali ini telah dilakukan

pewarnaan sederhana menggunakan sampel air liur dan zat pewarna atau

kromogen yaitu carbol fuksin dan metilen blue. Pengunaan satu macam zat warna

yaitu carbol fuksin dan metilen blue bertujuan hanya untuk melihat bentuk sel.

Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan.

Berbagai macam tipe morfologi bakteri seperti kokus, basil, spirilum, dan

sebagainya dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu

mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena

sitoplasmanya bersifat basofilik yang bermaksud ‘suka akan basa’ sedangkan zat-

zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin

yang mempunyai komponen kromoforiknya bermuatan positif.

Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan

pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat

morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak

digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-

karbol (5 detik).

Sebagai praktek telah diaplikasikan beberapa prinsip dalam percobaan ini. Antara

yang digunakan adalah teknik aseptis dimana ia merupakan suatu teknik yang

harus dipraktek selama melakukan pengamatan bakteri. Hal ini demikian karena

teknik aseptis merupakan satu teknik yang dilakukan untuk menjamin preparasi

atau pembiakan tersebut bebas dari partikel dan kontaminasi luar pada waktu

perlakuan. Prinsip seterusnya adalah pewarnaan sederhana yang bermaksud

percobaan ini diamati bentuk morfologi bakteri dengan menggunakan satu bahan.

Prinsip terakhir yang diaplikasikan dalam percobaan ini adalah ikatan ion. Ketika

bakteri diberikan pewarnaan, bakteri tersebut mengalamai ikatan ion antara

komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut

kromogen. Maka terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada

komponen seuler maupun pada pewarna.

Seterusnya dimulai dengan pembuatan pewarnaan sederhana dengan menyiapkan

alat dan bahan yang dibutuhkan. Olesan bakteri yang digunakan adalah sampel air

liur. Sekian itu, telah dibersihkan preparat dengan alkohol 70% lalu dikeringkan

dengan kapas dimana perlakuan ini betujuan agar tidak ada kontaminasi yang

terjadi dan bebas dari lemak yang masih menempel pada kaca obyek karena lemak

tersebut cenderung berikatan dengan zat warna yang mampu memberikan hasil

visualisasi terhadap bakteri yang kurang efektif. Selanjutnya telah dilakukan

pembuatan menandakan batas pengamatan dengan menggunakan spidol pada kaca

obyek yang bertujuan agar diketahui bagian yang akan dioleskan dengan sampel

kandungan bakteri dan lebih mudah untuk diamati pada saat apabila diobservasi

dibawah mikroskop karena setelah proses pewarnaan.

Prosedur selanjutnya adalah dimana sampel air liur dikumpul ke dalam suatu

cawan petri. Sebagai langkah pertama ose atau innoculating loop terlebih dahulu

harus di fixation/fiksasi dengan meletakkan hujung bagian kawat ose pada api

sehingga kawat pada ose bertukar menjadi merah. Perlakan ini dilakukan untuk

memastikan bahwa ose tersebut tidak mengandung atau menpunyai penempelan

sebarang bakteri dan kontaminan yang berada di sekitar atau sekian pemakaian

sebelumnya. Setelah fiksasi, ose didinginkan untuk beberapa menit sehingga ose

tidak panas lagi. Pendinginan ose adalah untuk memastikan bahwa ose yang

masih panas ketika dicelup kedalam sample bakteri berpotensi membunuh bakteri

yang ada pada sample sehingga hasil pengamatan tidak dapat dikenal pasti.

Berikutan itu, diambil sample air liur dengan menggunakan ose yang telah dingin

berdekatan api dan dioleskan pada linkungan yang ditandai pada kaca obyek

secara rata berdekatan api. Perlakuan ini dilakukan berdekatan dengan api untuk

mengurangkan dan mencegah paparan kontaminasi yang mungkin terjadi pada

proses pengambilan sampel dan pengolesan sampel. Seterusnya, kaca obyek yang

dioleskan air liur telah dilewatkan untuk beberapa detik sehingga kelihatan agak

mengering dan tidak bisa dilewatkan pada api terlalu lama karena bakteri pada

kaca obyek itu akan mati. Proses pengeringan itu bertujuan agar bakteri yang

dioleskan tidak tercuci apabila proses pewarnaan dilakukan. Berikutan itu, dilanjut

dengan proses pewarnaan dengan menggunakan pewarna Karbol Fuschin yang

telah diteteskan secara merata pada preparat pada posisi horizontal pada bak

pewarna. Seterusnya, didiamkan selama 5menit agar pewarnaan tersebut merata

ke seluruh daerah dimana bakteri dioleskan dan melewati ikatan ion antara

komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut

kromogen. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan

menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi

dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya

ditingkatkan. Kemudian dibilas dengan aquadest secara perlahan-lahan sehingga

tidak ada bakteri yang tercuci ketika proses pembilasan. Preparat tersbut

kemudian telah dikeringkan dengan kertas saring pada daerah diluar batas

pengamatan karena bakteri pada preparat cenderung menempel pada kertas saring

maka proses pengeringan ini harus dilakukan secara berhati-hati dan perlahan.

Proses akhirnya adalah penetesan minyak emersi pada preparat yang bertujuan

dapat memberikan visualisasi yang lebih jelas dan terang ketika pengamatan dan

juga melindungi mikroskop itu sendiri. Minyak imersi memiliki indeks refraksi

yang tinggi dibandingkan dengan air atau udara sehingga objek yang kita amati

dapat terlihat lebih jelas. Secara akhirnya, telah diamati preparat yang adanya

bakteri pada mikroskop majemuk. Sekian itu, seluruh percoban diulang dengan

pewarna yang beda yaitu metilen blue dan dilihat juga dibawah mikroscopik.

Hasil dari pengamatan telah dicatat dan telah dikenalpasti morfologi dan stuktur

dan ciri-ciri bakteri tersebut pada sample air liur.

VII. KESIMPULAN

1. Telah diamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri,

dengan menggunakan satu macam zat pewarna.

2. Telah mengenal pasti pewarna yang digunakan untuk proses pewarnaan

tunggal

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Tryana, S.T.2008. Dasar-dasar Mikorobiologi. Malang : Djambatan

Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.

Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.

Karmana, Oman. 2008. Biologi.PT Grafindo Media Pratama: Jakarta

Subandi, 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Gunung Djati Press: Bandung

Waluyo,Lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM:

Malang

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.

Pelczar, Michael. 1986. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Jakata: U dan D

Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.

Millati, Tanwirul, dkk. 2010. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Industri. Fakultas

Pertanian Universitas Lambung Mangkurat. Banjarbaru

Waluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum.UMM. Malang

Widjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan