[Pick the date]

Petunjuk Praktikum Biokimia Modul Respirasi PSPD UNTANDikutip dari : Bagian Biokimia FKUI. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Widya Medika, 2000.

Praktikum 1Sifat Hemoglobin dan Sel Darah Merah

PendahuluanHemoglobin merupakan protein yang terdapat dalam sel darah merah dan berfungsi antara lain untuk:1. Mengikat dan membawa oksigen dari paru-paru ke seluruh jaringan tubuh

2. Mengikat dan membawa CO2 dari seluruh jaringan tubuh ke paru-paru

3. Memberi warna merah pada darah

4. Mempertahankan keseimbangan asam basa dari tubuh

Hemoglobin merupakan protein tetramer kompak yang setiap monomernya terikat pada gugus hem dan keseluruhannya mempunyai berat molekul 64.450 Dalton. Darah mengandung 7,8 sampai 11,2 mMol hemoglobin monomer/L (12,6 sampai 18,4 gram/dL), tergantung pada jenis kelamin dan umur individu.

Hemoglobin dapat mengikat 4 atom oksigen per tetramer (satu pada tiap subunit hem), atom oksigen terikat pada atom Fe2+, yang terdapat pada hem, pada ikatan koordinasi ke-5. Hemoglobin yang terikat pada oksigen disebut hemoglobin teroksigenasi atau oksihemoglobin (HbO2), sedangkan hemoglobin yang sudah melepaskan oksigen disebut deoksihemoglobin (Hb). Hemoglobin juga dapat mengikat suatu gas hasil pembakaran yang tidak sempurna yaitu karbonmonoksida (CO) dan disebut karbonmonoksidahemoglobin (HbCO). Ikatan Hb dengan CO ini 200 kali lebih kuat daripada ikatan Hb dengan oksigen, dan akibatnya Hb tidak dapat lagi mengikat, membawa dan mendistribusikan oksigen ke jaringan. Dalam keadaan lain, muatan atom Fe yang terdapat pada pusat hem dapat berubah menjadi Fe3+. Hal ini dapat terjadi karena oksidasi dari senyawa-senyawa pengoksidasi. Hemoglobinnya disebut hemoglobin teroksidasi atau methemoglobin (MetHb) atau Hb(Fe3+). Dalam bentuk ini Hb tidak dapat mengikat oksigen atau kehilangan fungsinya yang amat penting. Beberapa derivat dari hemoglobin, misalnya oksiHb, Hb dan HbCO dapat dibedakan dengan melakukan pengenceran, dan pada pengenceran ini OksiHb terlihat berwarna merah kekuning-kuningan, Hb berwarna merah kecoklatan dan HbCO berwarna merah terang (carmine tint). Untuk lebih jelas lagi, setiap dervat Hb dapat pula dibedakan dengan menggunakan spektroskop, yaitu suatu teknik berdasarkan perbedaan absorbsi warna-warna tertentu dari spektrum cahaya putih. Bila suatu larutan berisi suatu zat warna diletakkan antara alat tersebut dan sumber cahaya, maka akan terlihat daerah (pita) yang berwarna hitam pada bagian spektrum tepat terjadinya penyerapan warna tersebut. Dengan menentukan letak serta intensitas pita-pita absorbsi itu, maka dapat ditentukan pigmen apa yang sedang diperiksa itu. Pada spektroskop yang tidak dilengkapi dengan skala panjang gelombang cahaya, letak pita absorbsi itu ditentukan dengan membandingkan dengan garis-garis Fraunhofer dari spektrum sinar matahari. Pada gambar berikut, garis-garis Fraunhofer itu akan terletak pada perkiraan : B = 687 mu, C = 656 mu, D = 589 mu, E = 527 mu, b =517 mu, F = 468 mu dan G =431 mu. Tujuan Praktikum1. Memperlihatkan bahwa hemoglobin dapat mengikat dan melepaskan oksigen2. Memperlihatkan bahwa ikatan Hb dengan karbonmonoksida jauh lebih kuat dibandingkan ikatan Hb dengan oksigen

3. Memperlihatkan bahwa besi dalam molekul Hb bila dioksidasi akan menjadi MetHb dan tidak dapat mengikat oksigen lagi

4. Demonstrasi spektrum derivat-derivat hemoglobin

5. Penetapan kadar Hb kuantitatif (cara sianmethemoglobin)

Percobaan Hemoglobin

1. Uji oksihemoglobin dan deoksihemoglobin

Tujuan : Membuktikan hemoglobin dapat mengikat oksigen membentuk oksihemoglobin (HbO2) dan dapat terurai kembali menjadi O2 dan deoksihemoglobin.

Dasar : Dalam keadaan tereduksi Fe dalam molekul Hb dapat mengikat dan melepaskan oksigen tergantung pada tekanan O2 atau CO2.

Hb(Fe2+) + O2 ( Hb(Fe2+)O2

deoksiHb oksiHb

Untuk mereduksi oksiHb menjadi deoksiHb digunakan larutan pereduksi Stokes.

Bahan dan pereaksi :

1. Darah segar

2. Pereaksi stokes

3. Larutan NH4OH

Cara kerja :

A. OksiHb

1. Ke dalam sebuah tabung reaksi encerkan 2 mL darah dengan 6 mL air suling. Campur dengan baik dan perhatikan warna merah terang dari oksihemoglobin yang terbentuk

2. Bagi 2 isi tabung tersebut sehingga masing-masing tabung berisi 4 mL. Gunakan tabung 1 sebagai kontrol.B. Pembentukan deoksiHb

1. Isi tabung ketiga dengan 2 mL pereaksi Stokes, dan tambahkan NH4OH secukupnya untuk melarutkan endapan yang segera terbentuk. Campuran ini merupakan larutan pereduksi yang kuat.

2. Masukkan beberapa tetes larutan stokes ke dalam tabung 2. Terlihat perubahan warna karena terbentuknya deoksiHb. Bandingkan dengan tabung 1.

C. Pembentukan kembali oksiHb dari deoksiHb

1. Kocok kuat-kuat tabung yang berisi deoksiHb, maka akan terjadi kembali oksigenasi dari udara. Perhatikan dan catat warna HbO2 yang kembali terbentuk.

2. Oksigenasi dan deoksigenasi kembali ini dapat dilakukan berulang-ulang.

Hasil :

Hasil

Tabung 1 oksiHb

Tabung 2 deoksiHb

Tabung 3 reoksigenasi deoksiHb

Warna yang terbentuk

Kesimpulan : ............................................

Pertanyaan : Peristiwa faal apakah yang ditiru dari percobaan ini ?...............2. Uji terhadap karbonmonoksida hemoglobin (HbCO)

Tujuan : Membuktikan bahwa Hb dapat megnikat CO yang ikatannya lebih kuat daripada Hb dengn O2.Dasar : Gas CO yang berasal dari proses-proses pembakaran yang tidak sempurna dapat mengikat Hb membnetuk HbCO. Ikatan ini sangat kuat (lebih kurang 200 kali lebih kuat daripada ikatan Hb dengan oksigen). Berwarna merah terang.

HbO2 + CO ( HbCO + O2HbCO + Stokes ( tidak bereaksi (tetap berwarna merah terang)

Bahan dan pereaksi :

1. Darah segar

2. Sumber gas CO

3. Pereaksi stokes

4. NH4OH

Pelaksanaan :

1. Encerkan 2 mL darah dengan 8 mL air suling. Bagi 2 darah encer itu (masing-masing 5 mL) dalm dua tabung reaksi.

2. Pada tabung 1 alirkan gas CO (dalam lemari asam). Oksihemoglobin akan berubah menjadi karbonmonoksihemoglobin. Bandingkan warna kedua tabung tadi.

3. Pindahkan masing-masing 1 mL dari tabung 1 (yang berisi HbCO) ke dalam tabung 3 dan tabung 4, dan masing-masing 1 mL dari tabung 2 (yang berisi HbO2) ke dalam tabung 5 dan tabung 6.

4. Tambahkan pereaksi Stokes (yang dibuat pad apercobaan 1B1) pada tabung ke 3 dan tabung ke 5. Jelaskan hasil yang didapat !

5. Encerkan isi tabung ke 4 dan tabung ke 6 dengan 4 mL air suling. Bandingkan warna kedua cairan itu. oksiHb berwarna kekuning-kuningan, sedang COHb bersemu kemerahan (carmine tint).

Hasil :

Tabung

OksiHb

KarbonmonoksiHb

Warna sebelum penambahan pereaksi StokesWarna setelah penambahan]pereaksi StokesKesimpulan : ................

Pertanyaan : Gejala-gejala apakah yang jelas terlihat pada seseorang yang keracunan CO ?.....

3. Uji untuk methemoglobin

Tujuan : Memperlihatkan bila besi dalam molekul hemoglobin dioksidasi menjadi Fe3+ maka terbentuk metHb yang tidak lagi bisa mengikat oksigen.

Dasar : Hb(Fe2+) + K3Fe(CN)6 ( Hb(Fe3+) + K4Fe(CN)6 Hb Oksidator MetHb

MetHb ini tidak dapat lagi mengikat oksigen

Bahan dan pereaksi :

1. Darah segar

2. Pereaksi K3Fe(CN)63. Pereaksi Stokes

Cara kerja :

1. Encerkan 1 mL darah dengan 4 mL air suling dalam tabung reaksi

2. Ke dalam tabung itu tambahkan beberapa tetes K3Fe(CN)6 33%. Perhatikan dan catat perubahan warna yang terjadi. Kemudian tambahkan pereaksi Stokes ke dalam tabung itu dan kocok kuat-kuat. Perubahan apakah yang terlihat ?3. Encerkan 3 mL darah dengan 3 mL air suling dan panaskan sebentar, lalu tambahkan 6 mL K3Fe(CN)6. Campur dengan membalik-balikkannya. Perhatikan gelembung-gelembung oksigen yang terbentuk.

Hasil :

Tabung

Warna tabung 1

TabungWarna tabung 2

+ K3Fe(CN)6+ K3Fe(CN)6Pengocokan kuat

+ Stokes

Gelembung udara

Pengocokan kuat

Kesimpulan : ..............Pertanyaan : Percobaan ini terdiri atas dua bagian, apakah perbedaan dari kedua percobaan itu ?...4. Penetapan kadar Hb dengan metoda sianmethemoglobin

Tujuan : Menentukan kadar Hb dalam darah secara kuantitatif dengan metoda sianmethemoglobinDasar : pada metoda ini semua bentuk hemoglobin diubah menjadi pigmen yang lebih stabil, yaitu sianmetHb setelah Penambahan suatu pereaksi tunggal yang mengandung kalium sianida dan kalium ferisianida. Ferisianida akan mengoksidasi Hb menjadi metHb yang kemudian direaksikan dengan ion sianida membentuk sianmetHb.

Bahan dan alat :

1. Darah yang akan diperiksa

2. Pipet sahli 0,2 mL

3. Pipet volumetrik 5 mL

4. Pereaksi Drabkin (1,0 gram NaHCO3, 52 mg KCN-beracun-, dan 198 mg K3fe(CN)6 dalam 1 L airsuling. Simpan dalam botol coklat).

5. Spektrofotometer dan kuvet.

6. Standar Hb.

Cara kerja :

1. Pipetkan dengan pipet volumetrik 5 mL pereaksi drabkin ke dalam sebuah tabung reaksi

2. Tambahkan 0,02 mL darah yang akan diperiksa pada tabung yang berisi pereaksi Drabkin, bilas pipet tersebut 3 kali dengan pereaksi Drabkin dalam tabung tersebut.

3. Diamkan selama 10 menit.

4. Pindahkan campuran tersebut ke dalam kuvet spektrofotometer dan tentukan serapannya pada 540 nM. Sebagai blanko digunakan pereaksi Drabkin.

5. Tentukan kadar Hb dalam g% dari standar Hb yang disediakan dengan rumus sbb.

6. Kadar Hb =Interpretasi : Batas-batas nilai normal dengan metoda ini untuk laki-laki berkisar antara 13,5 sampai 18,0 g/dL darah dan untuk wanita berkisar antara 11,5-16,5 g/dL darah.Hasil :Tabung

Blanko

Standar

Uji

Pereaksi Drabkin (mL)

5,02

-

5

Darah segar (mL)

-

-

0,02

Standar Hb (mL)

-

5,02

-

Diamkan (menit)

10

10

10

Bacalah serapan pada panjang gelombang 540 nm

Hasil perhitungan : kadar (g%)

Kesimpulan : ...

Praktikum 2Sifat Hemoglobin dan Sel Darah Merah

Sifat-sifat membran Pendahuluan

Semua membran biologis mempunyaii suatu struktur yang sama yaitu dibentuk dari molekul-molekul lipid dan protein yang satu dengan lainnya saling dihubungkan dengan ikatan-ikatan nonkovalen. Molekul-molekul lipid tersusun dalam dwilapis lipid (lipid bilayer) dan merupakan struktur dasar membran. Lipid ini berperan sebagai pembatas yang bersifat impermeabel relatif terhadap aliran molekul-molekul yang larut dala air. Molekul-molekul protein seolah-olah larut dalam lapisan dwilapis lipid dan berperan sebagai perantara dari berbagai fungsi membran antara lain untuk fasilitas transport. Sebagi protein membran berfungsi sebagai enzim-enzim yang mengkatalisis reaksi-reaksi yang berhubungan dengan peran membran dalam sel hidup. Sebagian lainnya dari protein membran tersebut merupakan protein struktural yang menyusun rangka sel tersebut, atau sebagai reseptor untuk menerima dan meneruskan sinyal-sinyal kimia dari dan ke dalam lingkungan sel. Berbagai percobaan berikut memperlihatkan hal-hal yang mempengaruhi membran sel darah merah dan suatu model mengenai proses difusi larutan koloid melalui suatu membran.

Tujuan :

1. Memperlihatkan pengaruh larutan hiper/hipotonik terhadap membran sel darah merah

2. Memperlihatkan pengaruh pelarut organik terhadap fragilitas membran sel darah merah

3. Memperlihatkan bahwa suatu larutan koloid tidak dapat berdifusi melalui membran dialisis

Percobaan membran

1. Hemolisis sel darah merah

Tujuan : memperlihatkan pengaruh larutan hiper/hipotonik terhadap membran sel darah merah

Dasar : dalam larutan hipotonik sel darah merah akan menggembung karena cairan dari luar sel akan masuk ke dalam sel darah merah (SDM). Bila pembengkakan SDM melewati batas fragilitas SDM, sel itu akan pecah atau menjadi hemolisis. Hemoglobin akan larut dalam cairan hipotonik sehingga larutan akan berwarna merah jernih. Didalam larutan hipertonik terhadap tekanan osmotik plasma darah, maka cairan dari SDM akan keluar dari sel sehingga SDM akan mengkerut (crenated).

Bahan dan pereaksi :

1. Darah segar

2. Larutan NaCl 2 %

Cara kerja :

1. Kedalam 10 tabung reaksi isikan campuran berikut :

Tabung

Air suling (mL)

NaCl 2% (mL)

% NaCl

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2. Campur dengan baik3. Tambahkan 2 tetes suspensi darah ke dalam setiap tabung dan kocok dengan membalik-balikkan tabung perlahan. Diamkan selama 1 jam.

4. Perhatikan dan catatlah derajat hemolisis pada tiap tabung.

Hasil :Tabung

% NaCl

Hemolisis

Tabung

% NaCl

Hemolisis

1

6

2

7

3

8

4

9

5

10

Kesimpulan : ....

Pertanyaan : Dari percobaan diatas, berapakah resistensi osmotik minimum sel darah merah ?...

2. Pengaruh pelarut organik terhadap membran sel darah merah

Tujuan : Memperlihatkan bahwa membran sel darah merah dapat mengalami lisis dalam pelarut organik tertentu.Dasar : Membran SDM mengandung lipid. Pelarut organik tertentu yang bersifat melarutkan lemak akan menyebabkan lipid membran larut sehingga terjadi hemolisis.

Bahan dan pereaksi :

1. Darah segar2. Larutan NaCl 0,9%3. Kloroform4. Eter5. Aseton6. Toluen7. AlkoholPelaksanaan :

1. Kedalam 6 tabung reaksi masukkan setiap 10 mL larutan NaCl 0,9%

2. Tabung pertama digunakan sebagai kontrol dan pada ke 5 tabung lainnya tambahkan setiap 2 tetes kloroform, eter, aseton, toluen, dan alkohol secara berurutan.3. Tambahkan ke dalam tiap tabung 2 tetes suspensi darah, biarkan selama setengah jam. Perhatikan warna yang terbentuk dan bandingkan dengan kontrol.

Hasil :

Pelarut

Hemolisis

NaCl 0,9% (kontrol)

Kloroform

Eter

Aseton

Toluen

Alkohol

Kesimpulan : ...

Praktikum 3Pengukuran kadar peroksida lipid dalam serum

HasPendahuluan Oksigen diperlukan dalam proses metabolisme dalam mahluk hidup untuk menghasilkan energi. Proses oksidasi ini dapat berlangsung secara enzimatik yang melibatkan enzim seperti superoksida dismutase (SOD), katalase dan perosidase. Proses oksidasi dapat berlangsung secara nonenzimatik yang berlangsung spontan dan melibatkan logam-logam transisi seperti Fe dan Cu. Pada proses oksidasi ini dapat terbentuk radikal bebas yang beasal dari oksigen yaitu senyawa oksigen reaktif (reactive oxygen species, ROS). ROS yang terbentuk ini dapat bereaksi dengan berbagai makromolekul di dalam tubuh seperti protein, lipid maupun asam nukleat. Reaksi radikal bebas dengan protein akan menghasilkan senyawa karbonil, dengan asam nukleat antara lain membentuk dimer timin yang dapat menyebabkan mutasi. Reaksi radikal bebas dengan lipid, yang terbanyak terjadi adalah asam lemak tidak jenuh jamak yang terdapat dimembran, sehingga terbentuk peroksida lipid. Salah satu produk proses peroksida lipid adalah malondialdehid (MDA). Oleh karena itu pengukuran kadar peroksida lipid dapat menggambarkan banyaknya radikal bebas yang terbentuk.Tujuan : menetapkan kadar peroksida lipid dalam cairan biologis

Dasar : asam lemak tidak jenuh (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksida lipid yang kemudian mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA). MDA bila direaksikan dengan asam tiobarbiturat (thiobarbitiuric acid, TBA), akan membentuk senyawa berwarna merah muda yang menyerap cahaya pada panjang gelombang 532 nm. Jumlah MD yang terbentuk dapat menggambarkan proses peroksidasi lipid.

Bahan dan pereaksi :

1. Hemolisat darah

2. Larutan asam trikloroasetat (TCA) 10%

3. Larutan TBA 0,67 %

Pelaksanaan dan hasil percobaan :

Bahan

Uji

Blanko

Hemolisat darah

0,25 mL

-

Akuades

-

0,25 mL

Larutan TCA 10 %, dingin

0,50 mL

0,50 mL

Kocok, pusing, ambil supernatan

Larutan TBA 0,067%

0,75 mL

0,75 mL

Masukkan penangas mendidih 10 menit, dinginkan. Baca serapan pada panjang gelombang 532 nm

Hasil A 532 kadar MDA

Perhitungan kadar MDA =

(E = 153.000 M-1cm-1)

Kesimpulan : ...

Page 2Page 9