PERCOBAAN III

“ ISOLASI DNA BAKTERI GRAM NEGATIF Escherichia coli DH5 Alpha”

I. Tujuan

Memahami dan mampu melakukan isolasi DNA bakteri.

II. Dasar Teori

DNA (asam deoksiribonukleat) merupakan polimer asam nukleat yang

tersusun secara sistematis serta membawa informasi genetik dari sel khususnya.

Informasi genetik disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang basa

nukleotida yang mana menentukan bentuk, struktur, maupun fisiologi suatu jasad.

DNA terdapat dalam sel prokariot maupun eukariot. Tempat yang paling banyak

mengandung DNA terdapat pada bagian aktifitas genetik utama sel. Sel prokariot,

aktifitas genetiknya terjadi di seluruh sel sehingga DNA tidak mempunyai tempat

yang spesifik dalam sel. Sebaliknya, karena aktifitas pada sel eukariot

terjadi didalam inti, maka sebagian besar DNA terdapat dalam inti sel (Triwibowo,

2005).

DNA berfungsi untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap yang

diperlukan untuk mencirikan struktur semua protein dan RNA tiap-tiap spesies

organisme, untuk membuat program pada saat yang tepat dan menempatkan

biosintesis sel dan jaringan secara teratur, untuk menentukan aktivitas organisme

sepanjang siklus hidupnya, dan untuk menentukan kekhususan organisme tertentu.

DNA alami terdiri dari dua rantai anti parallel dalam suatu rangkaian heliks ganda.

Basa A-T dan G-T yang saling komplementer tersusun berpasangan melalui ikatan

hydrogen pada heliks (Lehninger, 1982).

DNA merupakan sumber informasi genetik yang potensial dan akurat.

DNA ditemukan dalam hampir semua sel semua organisme, baik pada jaringan

hidup maupun yang mati. Ditambah lagi, jaringan tersebut dapat secara mudah

disimpan di bawah kondisi lapangan (Zulfahmi, 2013).

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.

Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan

teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.

Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawahtabung

dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Deoxyribonucleic acid

(DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalammakhluk hidup. DNA

merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu

generasi ke generasi selanjutnya (Suryo, 2004).

Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom

meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam selorganisme.

DNA genom meliputi gen dan intergen. Penambahan deterjen dalamisolasi DNA

dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yangdibentuk melalui

sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk

senyawa “lipid protein- deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk

karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik danhidrofobik, demikian juga

dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatuikatan kimia. Genom adalah

komplemen lengkap gen-gen atau materi genetik suatu organisme dan terorganisasi

menjadi kromosom.  DNA genom adalah semua gen-gen dan semua sekuens DNA

(urutan polinukleotida) yang fungsional maupun non-fungsional dalam inti suatu

organisme.  DNA genom meliputi gen dan intergen (Campbell et al., 2002).

Isolasi genomic DNA dari bakteri telah menjadi hal yang populer dalam

penelitian phylogenic dan populasi genetik yang mana menyangkut mikrobiologi.

Pada studi genetika molekuler, hal yang penting adalah mengisolasi fragmen besar

dari genom DNA. Langkah-langkah dasar pada isolasi DNA adalah mengganggu

struktur selular untuk membuat sebuah lisat, pemisahan DNA yang larut dari sel

debris serta bahan tidak larut lainnya dan pemurnian DNA dari protein larut dan

asam nukleat lainnya. Secara garis besar, hal ini dilakukan dengan menggunakan

ekstraksi organik (misalnya, fenol: kloroform) yang diikuti oleh presipitasi etanol

(Pindi et al., 2013).

DNA yang berkualitas tinggi sangat diperlukan untuk mengidentifikasi

mikroorganisme dalam suatu sampel yang mana hal tersebut dapat dilakukan

dengan beberapa metode. Metode ini dapat klasifikasikan dalam 2 kelompok besar

yaitu : metode ekstraksi in-house dan metode menggunakan komersial kit. Kit

komersial menyediakan larutan yang siap digunakan seperti buffer dan enzim.

Selain itu, banyak kit komersial yang sudah termasuk matriks pendukung khusus

yang akan memberikan peningkatkan terhadap pemulihan DNA dan memungkinkan

lebih banyak penghapusan/peghilangan yang lebih efisisen terhadap molekul yang

bersifat mencemar (Mozioglu et al., 2014).

Bakteri mengandung lebih banyak DNA dibanding virus. Kromosom

Escherichia coli merupakan molekul DNA sirkular rantai ganda yang mengandung

4.639.221 pasang basa dengan panjang kira-kira 1,7 mm, 850x lebih panjang

dibanding sel Escherichia coli (Khurin’in et al., 2014).

III. Alat & Bahan

1. Alat

- Mikropipet dan tip 1 buah

- Mikro sentrifus 2 buah

- Tabung mikro sentrifus 4 buah

- Vortex 1 buah

- Autoklaf 1 buah

- Inkubator shaker 1 buah

2. Bahan

- Kultur bakteri Escherichia coli 1,5ml

- Etanol 96% PA 400μl

- Kit Gene Jet Genomic DNA

Purification :

Digestion solution 180μl

RNAse A 20μl

Lysis solution 200μl

Proteinase K 20μl

Wash Buffer I & II @500μl

Elution Buffer 200μl

3. Gambar

IV. Cara Kerja

1. Nutrient Broth (NB) 0,4 gram ditambah dengan 50ml aquadest, dipanaskan pada

water bath, kemudian di sterilisasi di autoklaf pada suhu 121˚C dengan waktu ± 15

menit, lalu ditambah dengan biakan baktei Escherichia coli dan diletakkan pada

inkubator shaker.

2. Kultur diambil sebanyak 0,5 ml, lalu diletakkan pada mikrotube dan disentrifuse

selama 10 menit 5000rpm.

3. Pelet diresuspensi dalam 180μl digestion solutin, kemudian proteinase K

ditambahkan sebanyak 20μl, Pelet campuran tersebut dicampurkan dengan vortex

atau dengan cara tabung dibolak-balik.

4. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 56˚C selama 30 menit sambil sesekali

dibolak-balik.

5. RNAse A sebanyak 20μl ditambahkan pada campuran, lalu diinkubasi selama 10

menit di suhu ruang.

6. Lysis solutin sebanyak 200μl ditambahkan dan dicampurkan dengan vortex selama

15 detik dan ditambahkan lagi etanol 96% PA sebanyak 400μl lalu dicampurkan.

7. Lisat yang dihasilkan, dipindahkan ke dalam spin column yang telah dimasukkan

ke dalam collection tube, lalu disentrifuse selama 1 menit pada 6000rpm. Cairan

yang tertampung dalam collection tube dibuang, kemudian ditaruh kembali spin

column pada collection tube.

8. Wash buffer I (yang sudah ditambahi dengan etanol) ditambahkan sebanyak 500μl,

lalu disentrifuse selama 1 menit pada 8000rpm. Cairan yang tertampung dalam

collection tube dan dikembalikan pada spin column.

9. Wash buffer II (yang sudah ditambahi dengan etanol) ditambahkan sebanyak 500μl,

kemudian disentrifuse 3 menit dengan kecepatan maksimum (12000rpm).

Optional : Jika masih ada cairan yang tertinggal dalam spin column (tidak turun ke

collection tube), collection tube dikosongkan dan diulangi spin selama 1 menit.

10. Cairan dalam collection tube dibuang, lalu dipindahkan spin column ke dalam

tabung mikro 1,5ml yang baru dan steril.

11. Elution buffer ditambahkan sebanyak 200μl tepat ditengah membran spin column.

Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit dalam kondisi yang tegak.

Selanjutnya disentrifuse selama 1 menit pada 8000rpm. Catatan : Jika

menginginkan DNA lebih terksonsentrasi, jumlah dari elution buffer dapat

dikurangi sampai 50μl.

12. Spin column dibuang dan diberi label tabung mikro lalu disimpan dalam suhu -

20˚C.

V. Hasil

VI. Pembahasan

Percobaan ini bertujuan untuk memahami serta mampu melakukan

isolasi DNA bakteri, yang mana bakteri yang digunakan adalah bakteri gram

negatif Eschericihia coli DH5 Alpha. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga

yakni ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein,

penghancuran (lisis), serta pemurnian DNA.

DNA merupakan suatu asam nukleat yang mengandung materi genetik

yang dimiliki makhluk hidup, dan berfungsi untuk mengatur perkembangan

biologis pada seluruh bentuk kehidupan yang dilakukan secara seluler. DNA

terdapat pada inti sel (nukleus), mitokondria dan kloroplas. Perbedaan ketiganya

yaitu, DNA nukleus memiliki bentuk yang linear serta dapat berikatan atau

berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan

kloroplas memiliki sifat dan bentuk yang sama yaitu berbentuk sirkular dan tidak

berikatan atau berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan

kloroplas juga memiliki ciri khas yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal

dari garis keturunan ibu. Berdasarkan organismenya DNA dibedakan menjadi dua

yaitu DNA prokariot dan eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon

dan strukturnya berbentuk sirkular serta memiliki untai DNA yang tidak teratur.

Pada DNA eukariot memiliki protein histon dan strukturnya berbentuk linear.

Protein histon serta DNA terorganisir yang mana dalam bentuk dipadatkan pada

kromosom.

Pada isolasi DNA bakteri yang dilakukan pada percobaan ini,

tahapannya seperti yang telah dijelaskan sebelumnya yaitu prinsipnya, ekstraksi,

pelisisan, serta pemurnian DNA. Ekstraksi pada percobaan ini yang dilakukan

adalah pemanenan pelet, yang bertujuan untuk mendapatkan pelet yang terpisah

dari media pertumbuhannya, dalam hal ini yang digunakan adalah media Nutrient

Broth (NB).

Hal yang selanjutnya dilakukan pada isolasi DNA bakteri ini adalah

pelisisan sel yang dilakukan dengan penambahan digestion solutin pada kultur

bakteri, yang mana digestion solution bekerja dengan melemahkan membran sel

bakteri, sehingga akan berfungsi untuk melisiskan membran sel tersebut.

Kemudian dilakukan penambahan Proteinase K yang mana berfungsi melisiskan

membran sel serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida

dalam komponen sel secara enzimatis. Pada percobaan dilakukan inkubasi setelah

penambahan proteinase K dengan suhu 56˚C, yang mana dilakukan pada suhu

tersebut, sebab proteinase K merupakan protease yang aktif pada suhu ±50˚C,

serta sesekali tabung dibolak balik, bertujuan untuk mengoptimalkan reaksi serta

untuk memaksimalkan proses lysis dan kerja enzim.

Proses selanjutnya adalah pemisahan dan pemekatan DNA, yang

bertujuan untuk memurnikan DNA dari senyawa pengotor yang ada didalamnya

selama proses isolasi. Hal tersebut dilakukan dengan menambahkan 20μl RNAse

A yang mana bahan ini berfungsi untuk mendegradasi RNA, agar RNA dapat

terpisah dari DNA, sebab yang akan diambil adalah DNA. Kemudian, dilakukan

juga penambahan lysis solution, yang mana berfungsi untuk merusak integritas

barrier membran sel, yaitu dengan merusak residu membran sel bakteri. Dalam

praktikum juga dilakukan penambahan etanol 96% PA, yang mana berfungsi

untuk melarutkan senyawa non DNA.

Selama proses isolasi digunakan juga Wash buffer 1 dan 2 yang

keduanya berfungsi untuk mencuci DNA dari pengotor (debris). Setelah beberapa

proses dari isolasi telah selesai, kemudian dilakukan penambahan Elution buffer

yang berfungsi untuk mengikat pengotor selain DNA.

Pada praktikum, dilakukan sentrifugasi dengan sentrifuse yang mana

berfungsi untuk memisahkan molekul yang didasarkan dengan berat molekul.

Serta digunakan juga vortex yang mana berfungsi untuk menghomogenkan

larutan atau medium khusus pada tabung. Alat lain yang juga digunakan adalah

autoklaf, inkubator shaker, mikropipet dan tabung mikrosentrifus. Autoklaf

berfungsi untuk mensterilisasi media yang telah dibuat dengan menggunakan uap

bersuhu dan bertekanan tinggi. Inkubator shaker berfungsi untuk mengocok atau

mencampur atau merekasikan campuran bahan kimia yang mana memerlukan

temperatur serta kecepatan (rpm) konstan, dan juga digunakan untuk inkubasi

mikroba. Mikropipet befungsi untuk mengambil cairan dengan ukuran yang

tepat. Tabung mikrosentrifuse digunakan untuk menyimpan sampel serta sebagai

wadah bagi sampel untuk dicampurkan dengan larutan lain selama proses isolasi.

Pada saat proses isolasi tahap awal yaitu ketika kultur bakteri

disentrifuse dengan 5000 rpm, dilakukan atau diulangi sebanyak tiga kali, hal ini

dilakukan karena hasil yang didapat setelah sentrifuse sedikit sehingga untuk

mendapatkan sesuai yang dibutuhkan atau dikehendaki, maka perlu dilakukan

pengulangan. Sedikitnya hasil yang didapat dikarenakan pada saat dilakukan

inkubasi pada inkubator shaker, hanya dilakukan 4 jam, seharusnya 24 jam, agar

didapatkan hasil yang maksimal, sehingga tidak perlu dilakukan pengulangan.

Selain itu pada saat setelah selesai penambahan wash buffer II, dilakukan

sentrifuse pada mikrotube yang kosong hal ini merupakan optional yang

dilakukan karena terdapat cairan yang masih tertinggal didalam spin column yang

tidak turun pada collection tube. Setelah semua proses selesai, sampel DNA yang

telah didapat disimpan pada freezer, hal ini agar menjaga sampel tetap dalam

keadaan baik atau tidak rusak, sebelum dilakukan analisis selanjutnya

menggunakan elektroforesis.

Hasil akhir yang didapatkan dari isolasi DNA bakteri Escherichia coli

DH5 Alpha pada praktikum ini yaitu berupa cairan bening.

VII. Kesimpulan

Hasil dari isolasi DNA bakteri gram negatif Escherichia coli DH5 Alpha yaitu

berupa cairan bening.

Daftar Pustaka

Campbell, N.A., J. B. Reece and L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Jakarta:

Penerbit Erlangga.

Khurin’in, Bhintarti S.H., Festy A.R., Nugroho A.M., Indina R. 2014. “Isolasi DNA

Kromosomal dan Plasmid dari Bakteri Escerechia coli”. Jurnal UIN Jakarta.

2(1) : 1-10.

Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia, diterjemahkan oleh M.Thenawijaya.

Jakarta: Erlangga.

Mozioglu, E., Muslum A., Candan T., Zuhtu T.K. 2014. “ A Simple Guanidinium

Isothiocyanate Method for Bacterial Genomic DNA Isolation “. Turkish

Journal of Biology. 38 : 125 - 129.

Pindi, P.K., Raja S.R., and A. Shiva S. 2013. “An Efficient Protocol for Genomic DNA

Isolation from Cultivable Bacteria”. International Journal of Pharma and Bio

Sciences. 4(1) : 596 - 600.

Suryo. 2004. Genetika. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press.

Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Penerbit Erlangga.

Zulfahmi. 2013. Penanda DNA untuk analisis genetik tanaman. Jurnal

Agroekoteknologi. 3 (2): 41-52.

Mengetahui Surakarta, Mei 2016

Asisten Praktikum Praktikan

( ) (PRATIWI NOOR PPS)

Lampiran

DNA hasil isolasi pada 4 mikrotube 1, 2, 3 dan 4.