penuntun praktikum mikrobiologi...oleh: i n. sujaya petunjuk praktikum mikrobiologi 2 kata pengantar...

Oleh: I N. Sujaya

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 1

PENUNTUN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

Aspergillus niger

Oleh

I Nengah Sujaya

Untuk Kalangan Internal

Program Studi Ilmu Kesehatan Masyarakat

Universitas Udayana

2017

Oleh: I N. Sujaya


KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang Hyang Widi

Waca, karena hanya atas rachmat-Nya lah, Penuntun Praktikum Mikrobiologi ini bisa

diselesaikan. Penuntun Praktikum Mikrobiologi ini disusun dengan tujuan memberikan

bahan acuan kepada mahasiswa Program Studi Ilmu Kesehatan Masyarakat (PS IKM),

Universitas Udayana, tentang pengetahuan dasar dalam praktek mikrobiologi umum.

Disamping langkah dasar dalam mikrobiologi yang harus dikuasai oleh mahasiswa,

buku ini juga memberikan gambaran sekilas tentang teknik dasar biologi molekuler yang

menyebabkan revolusi dibidang ilmu mikrobiologi dan belakangan menjadi teknik yang

paling terpercaya dalam pengelompokan/klasifikasi organisme hidup di alam semesta ini.

Akhirnya dengan segala kerendahan hati penyusun menyampaikan ucapan

terimaksih yang sedalam dalamnya kepada pihak pimpinan PS IKM Unud, teman teman

sejawat staf pengajar di PS IKM Unud, serta mahasiswa yang banyak memberikan

bantuan dan dorongan sehingga Penuntun Praktikum initersusun dengan harapan buku

kecil ini bisa bermanfaat. Penyusun menyadari bahwa buku ini masih sangat jauh dari

sempurna dan oleh karena itu segala saran dan bimbingan dari pembaca sangat

diharapkan untuk penyempurnaan edisi berikutnya.

Denpasar, Agustus 2017

Penyusun,

Ir. I N. Sujaya, M.Agr. Sc.,

Ph..D.

Oleh: I N. Sujaya


PETUNJUK UMUM

PETUNJUK UMUM

1. Dalam praktikum mikrobiologi, anda akan bekerja dengan berbagai macam

mikroorganisme (Bakteri, Jamur, Yeast, dll). Walaupun sebagian besar

mikroorganisme yang dipakai tidak berbahaya, hendaknya saudara bekerja dengan

hati-hati. Taatilah petunjuk-petunjuk yang diberikan oleh pembimbing praktikum

saudara.

2. Sebelum saudara mulai bekerja, hendaknya saudara mempelajari betul pekerjaan yang

akan saudara lakukan. Buatlah rencana kerja yang baik, kalau perlu dengan membuat

skema kerja, sehingga saudara dapat bekerja dengan tepat, teliti dan cepat.

3. Dalam praktikum mikrobiologi, kondisi steril (bebas dari mikroorganisme

kontaminan) sangat penting dan merupakan faktor yang paling menentukan percobaan

saudara. Oleh karena itu, ikutilah selalu cara kerja steril yang diajarkan oleh

pembimbing praktikum saudara. Transfer material, pananaman dilakukan dalam ruang

steril (cleanbench) yang dilengkapi api burner (Bunsen), filter udara, lampu UV.

4. Jagalah selalu kebersihan dan kerapihan tempat saudara bekerja, sebelum, selama, dan

sesudah praktikum.

5. Janganlah memasukkan atau menggigit pensil, kertas dan sebagainya ke dalam mulut

selama berada di dalam ruang praktikum.

6. Kalau terjadi kecelakaan, cepat laporkan kepada asisten atau pembimbing praktikum

saudara.

7. Sesudah selesai praktikum, jangan lupa mencuci tangan dengan air dan sabun.

8. Hanya dengan memperhatikan ketelitian, kebersihan, dan kesabaran, pekerjaan saudara

akan berhasil.

9. Selama di laboratorium sangat dilarang melakukan aktivitas makan atau minum

10. Peserta praktikum diwajibkan mengenakan jas praktikum (jas lab) selama melakukan

praktikum.

11. Semua bahan yang akan diinkubasi harus diberi label yang cukup (berisi nama

kelompok, tanggal, dan informasi lain yang saudara anggap penting) agar tidak

tertukar dengan bahan lain yang tampak serupa. Inkubasi umumnya dilakukan dalam

inkubator dnegan suhu yang bisa dikontrol (atau pada kasus tertentu dilakukan dalam

suhu kamar atau waterbath).

Oleh: I N. Sujaya


Burner

Selang gas

Filter udara

Alas stainless steel

Switch (lampu, uv,

blower)

Gambar cleanbench

Oleh: I N. Sujaya


PRAKTIKUM

1 PENYIAPAN DAN PEMBUATAN MEDIUM

1.1 Fungsi Media Media merupakan substrat yang diperlukan untuk menumbuhkan dan mengembang-

biakkan mikroorganisme. Sebelum dipakai dalam percobaan, media ini perlu disterilkan

terlebih dahulu, supaya tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme yang tidak dikehendaki

(kontaminan). Agar mikroba yang kita kultur dapat tumbuh dengan baik, maka persyarat-

an yang harus dipenuhi oleh suatu media adalah :

a. Didalamnya harus terkandung bahan-bahan yang diperlukan oleh mikroba yang akan

ditumbuhkan. Bahan-bahan ini meliputi unsur-unsur makro, unsur mikro, dan trace

elemen serta zat pengatur tumbuh.

b. Media tersebut harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang

sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan dikultur.

c. Media harus dalam keadaan steril sebelum dipakai untuk menumbuhkan mikroba yang

diperlukan.

1.2. Jenis Media 1.2.1. Menurut bahan yang dipakai dalam pembuatannya, media dapat

digolongkan menjadi :

a. Media alami : Media yang komponen pembentuknya terdiri dari bahan-bahan alam,

seperti kentang, tauge, daging, nasi, dan lain sebagainya.

b. Media semi sintetik : Media yang bahan pembentuknya terdiri dari campuran bahan-

bahan alami dan bahan sintetik. Contoh : Agar Tauge, Agar Kentang Dextrosa, dll.

c. Media sintetik : Media yang bahan pembentuknya secara keseluruhan terbuat dari

bahan-bahan sintetik. Contoh : Agar Sabouraud, Endo Agar, Agar Czapex Dox, dll.

1.2.2. Menurut bentuknya, media dapat digolongkan menjadi :

a. Media cair : Media yang tidak ditambahkan zat pemadat (agar), sehingga media ini

dalam keadaan encer (cair). Contoh : Lactose Broth, Nutrient Broth.

b. Media semi padat : Media yang mengandung bahan yang sama dengan media cair,

tetapi ditambah sedikit agar (setengah konsentrasi agar), sehingga menjadi agak padat.

Media ini dipakai untuk menumbuhkan mikroba yang banyak memerlukan air dan

hidup dalam lingkungan yang anaerob atau anaerob fakultatif. Media ini juga dipakai

untuk uji motilitas suatu bakteri.

c. Media padat : Media cair yang ditambahkan dengan agar-agar sehingga menjadi padat.

Contoh : Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), dll.

1.2.3. Menurut kegunaanya, Media digolongkan menjadi:

Oleh: I N. Sujaya


a. Media umum: Media yang digunakan untuk menumbuhkan satu atau lebih kelompok

mikroba secara umum. Contoh : Nutrient Agar (media untuk menumbuhkan kelompok

bakteri, Potato Dextrose Agar (media yang dipakai untuk menumbuhkan kelompok

jamur, dll.

b. Media pengaya: Media yang dipakai untuk menyuburkan mikroba tertentu sebelum

ditumbuhkan pada media yang dipakai dalam penelitian. Contoh: Selenit Broth (untuk

menyuburkan pertumbuhan bakteri Salmonella.

c. Media selektif: Media yang dipakai untuk menumbuhkan species tertentu dari

mikroba, dengan menghambat pertumbuhan species lain yang tidak dikehendaki.

Contoh: Media SS Agar(Salmonella dan Shigella Agar) untuk bakteri Salmonella dan

Shigella.

d. Media penghitungan : Media yang dipakai untuk menghitung jumlah mikroba suatu

bahan. Media ini dapat berupa media media umum dan media selektif.

1.3. Pembuatan Media

Dalam praktikum ini, saudara akan membuat beberapa macam media, yaitu media

Nutrient Agar, Malt extract, Lactose Broth, Brilliant Green 2 % Bile Broth, dan media

Endo Agar. Semua media tersebut merupakan media sintetik yang banyak dijual dalam

bentuk instant, sehingga dalam pembuatannya, saudara cukup memperhatikan petunjuk

yang tertera pada setiap media.

1.3.1. Cara pembuatan Nutrient Agar.

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukanlah prosedur berikut ini :

a. Timbang sebanyak 23,5 gram medium instant.

b. Suspensikan dalam akuadest dan volume akhir dibuat 1000 ml.

c. Panaskan suspensi ini sampai agar-agar menjadi matang.

d. Masukkan ke dalam tabung reaksi ( 5ml untuk media miring, dan 10 ml untuk

media tegak).

e. Sterilkan dengan autoclave pada temperatur 121 oC dan tekanan 15 lbs. Selama 15

menit.

f. Simpan pada tempat yang dingin dan kering (dalam kulkas).

1.3.2. Pembuatan Malt Extrak

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukan kangkah-langkah berikut :

a. Timbang sebanyak gram media instant.

b. Suspensikan dalam akuadest sampai volume akhir menjadi 1000 ml.

c. Masukkan ke dalam tabung reaksi (kurang lebih 7 ml tiap tabung)

d. sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC dan tekanan 15 lbs, selama 15 menit.

1.3.3. Pembuatan medium Lactose Broth

Dalam praktikum ini akan dibuat medium lactose broth dengan dua konsentrasi (single

strength dan double strength). Untuk membuat satu liter single strength lactose broth,

lakukanlah prosedur berikut ini :

a. Timbang sebanyak 13 gram medium lactose broth instant.

b. Suspensikan dalam akuades sampai volume akhir mencapai 1000 ml.

c. Masukkan ke dalam tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung Durham.

Oleh: I N. Sujaya


d. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC pada tekanan 15 lbs selama 15 menit.

e. Simpan pada tempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas).

f. Prosedur yang sama dikerjakan untuk membuat double strength lactose broth, tapi

konsentrasinya dilipat duakan.

g.

1.3.3. Pembuatan medium BGBB (Brilliant Green Bile 2 % Broth)

Untuk membuat satu liter medium ini, lakukan prosedur berikut ini :

a. Timbang sebanyak gram medium instant.

b. Suspensikan dalam akuadest dan volume akhir dibuat menjadi 1000 ml.

c. Masukkan ke dalam tabung reaksi kecil yang telah dilengkapi dengan tabung Durham.

d. Sterilkan dengan autoclave pada temperatur 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama 15

menit.

e. Simpan di tempat yang sejuk dan kering.

1.3.4. Pembuatan medium Endo Agar

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukanlah prosedur berikut:

a. Timbang sebanyak gram medium instant.

b. Suspensikan dalam akuades dan buat volume akhir menjadi 1000 ml.

c. Panaskan sampai semua komponen larut.

d. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama 15 menit.

e. Simpan ditempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas).

1.3.5. Pembuatan medium Palte Count Agar

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukanlah prosedur berikut:

a. Timbang sebanyak 23,5 gram medium instant PCA, Pronadisa).

Catatan :

Merk yang berbeda mempunyai kompisisi yang berbeda sehingga berat gram / lt

mungkin berbeda. Sehingga, perhatikan panduan yang tertulis pada kemasan/botol

media yang diupergunakan.

b. Suspensikan dalam akuades dan buat volume akhir menjadi 1000 ml.

c. Panaskan sampai semua komponen larut (langkah ini bisa tdak dilakukan apabila tidak

mempersiapkan agar tega/agar mirin dalam tabung reaksi).

d. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama 15 menit.

e. Media bisa dituang ke dalam cawan petri yang sudah di autovlave (lihat gambar di

bawah).

Untuk satu cawanpetri diameter 9,9mm, ketebalan 1,5 cm, maka volume agar yang

diperkukan sebanyak 17,5-20 ml untuk ketebalan media agar yang baik.

Agar di tulang ke dalam cawan petri pada kondisi suhu media + 65-75oC. Pada suhu di

bawah itu agar akan memberku.

f. Biarkan agar dalam cawan petri membeku, tutup cawan di buka sampai agar

memebrku (20-30 menit dalam laminar flow).

g. Simpan ditempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas) dalam keadaan dibungkus

kantong plastik dan agar diletakkan terbalik (bagian tutup cawan petri di bawah dan

agar di atas).

Oleh: I N. Sujaya


Media umumnya dibuat dalam bentuk media agar (agar plate) yang mana media

dituangkan dalam cawan petri, media agar miring/agar tegak yang disiapkan dalam

tabung reaksi umunya digunakan untuk menyimpan kultur. Kultur aerob biasanya

disimpan dalam agar miring, semantara kultur anaerob umumnya disimpan dalam agar

tusuk (stab) pada media tegak.

A. Media agar

B. Agar tegak C. Agar miring

Gambar 1-1. Menyiapkan media agar yang telah disterilkan di tuang ke dalam cawan petri. (A).

Perhatikan bahwa mulut erlenmeyer harus dibakar pada api bunsen terlebih dahulu. Pada media

tegak dan miring, tutup kapas harus dibuat dalam keadaan padat dan ketat sehingga tidak mudah

lepas.

Oleh: I N. Sujaya


PRAKTIKUM

2 MORFOLOGI SEL BAKTERI

2.1. Pendahuluan.

Walaupun ada ratusan species bakteria yang berbeda, namun suatu bakteria dalam bentuk

sel tunggal akan memiliki salah satu dari tiga bentuk yang umum dikenal, yaitu:

a. Bentuk bulat/elips/spherical shape yang lazim disebut dengan coccus.

b. Bentuk batang yang umum disebut basil.

c. Bentuk spiral.

Bakteri berbentuk bulat atau coccus, sering menunjukkan variasi bentuk. Variasi bentuk

ini sering dipakai sebagai ciri yang khas dalam proses identifikasi jenis. Beberapa variasi

bentuk tersebut antara lain:

a. Diplococcus: Dua buah sel saling bedempetan atau berpasangan.

b. Streptococcus: Untaian sel yang lebih dari 4 sel dan membentuk suatu untaian yang

menyerupai rantai.

c. Tetrad atau tetracoccus: Empat buah sel yang saling berdempetan yang membentuk

suatu bentuk yang menyerupai bujur sangkar.

d. Staphylococcus: Kumpulan sel yang saling bedempetan, sehingga menyerupai buah

anggur.

e. Sarcina: Kelompok yang terdiri atas 8 sel (4 sel pada bagian depan dan 4 sel pada

bagian belakang) yang membentuk suatu bentuk yang menyerupai kubus.

Berbeda dengan bakteri bentuk bulat, bakteri bentuk batang (basil) jarang sekali

berada dalam variasi diatas. Pada bakteri bentuk batang ini, variasi diatas (jarang)

bukan merupakan karakteristik dari bakteri ini. Bila dialam dijumpai adanya variasi

bentuk dari bakteri basil ini, maka hal tersebut cenderung disebabkan oleh tahap

pertumbuhannya atau kondisi-kondisi yang mempengaruhi kultur tersebut.

Bakteri berbentuk spiral pada umumnya dijumpai dalam bentuk soliter atau bersel

tunggal dan bukan merupakan kumpulan sel yang berdempetan.

Dalam praktikum ini saudara akan diperkenalkan beberapa species bakteri yang

mewakili bentuk bentuk diatas. Disamping itu juga akan diperkenalkan beberapa struktur

luar dan struktur dalam bakteri, seperti flagella, capsula, dan endospora, sebagai

pelengkap morfologi bakteri tersebut.

2.2 Alat dan Bahan yang diperlukan

a. Mikroskop cahaya.

b. Minyak emersi

c. Objek glass dan alat fiksasi

d. Kultur bakteri (sebaiknya yang masih muda).

Oleh: I N. Sujaya


e. Jarum ose (loop)

f. Burner (bunsen)

2.3. Cara Kerja

a. Amatilah bentuk-bentuk sel bakteri yang disediakan oleh asisten dan pembimbing

praktikum saudara, dengan menggunakan mikroskop cahaya dan mulai dengan

perbesaran lemah.

b. Bila pengamatan kurang jelas, lakukan pengamatan dengan lensa objektive yang

berkekuatan 100 x. (Ingat : pakailah minyak emersi pada perbesaran 100 x ini).

c. Gambarlah bentuk-bentuk bakteri beserta variasinya pada buku journal saudara.

d. Bersihkan minyak emersi pada lensa yang saudara pakai dengan menggunakan larutan

xylol (Ingat : hati-hati bekerja dengan xylol ini, karena bersifat karsinogenik/penyebab

terjadinya kanker).

Gambar 2-1 A. Kocok kultur cair dan ambil satu

mata loop yang sebelumnya dipanaskan di atas

api

Gambar 2-1B. Sebarkan di atas glas objek dan

lakukan pengamatan di bawah mikroskop

Gambar 2-1 C. Bentuk sel bakteri

Oleh: I N. Sujaya


PRAKTIKUM

3 STERILISASI

3.1. Pendahuluan

Sterilisasi merupakan suatu proses membebaskan peralatan atau bahan dari

mikroorganisme yang tidak dikehendaki. Untuk mencapai tujuan ini, ada beberapa

macam sterilisasi yang dapat dipilih dan disesuaikan dengan sifat bahan yang akan

disterilkan. Cara-cara yang umum dilakukan adalah:

a. Sterilisasi secara fisik : sterilisasi dengan menggunakan pemanasan, penggunaan sinar

UV, sinar X dan sinar-sinar yang panjang gelombangnya pendek.

b. Sterilisasi secara kimia : sterilisasi dengan menggunakan bahan-bahan kimia, seperti

alkohol, desinfektan, larutan formalin, dll.

c. Sterilisasi mekanik : sterilisasi dengan menggunakan filter atau saringan.

3.2. Sterilisasi dengan pemanasan

a. Pemanasan dengan udara kering atau udara basah

Cara ini sangat cocok untuk mensterilkan alat-alat atau bahan-bahan yang tahan panas.

Dalam cara ini, temperatur yang dipakai adalah 170 oC dan dilakukan selama 1 jam.

b. Tindalisasi

Cara ini dipakai untuk mensterilkan bahan-bahan yang tidak tahan suhu tinggi. Dalam

cara ini, bahan dan alat dipanaskan selama 30 menit pada suhu 100 oC, dan diulang

sebanyak 3 kali berturut-turut, dengan selang waktu 1 hari. Bahan dan alat disimpan

pada suhu kamar pada saat tidak dipanaskan.

c. Pasteurisasi

Cara ini dipakai untuk mensterilkan bahan makanan yang akan mengalami denaturasi

pada suhu tinggi. Dengan cara ini, alat dan bahan dipanaskan pada suhu 60 - 80 oC

selama satu jam sebanyak 3 kali berturut-turut, dengan selang waktu 1 hari.

d. Sterilisasi dengan nyala api langsung.

Cara ini sangat cocok untuk mensterilkan jarum inokulasi.

e. Sterilisasi dengan uap panas yang bertekanan

Cara ini umum dipakai untuk mensterilkan alat dan bahan yang tahan panas tinggi dan

tekanan. Alat yang dipakai adalah autoclave yang dapat mencapai suhu 121 oC dan

tekanan 15 lbs.

Cara memakai AUTOCLAVE.

a. Isi autoclave dengan air sebanyak 3-5 liter.

b. Siapkan alat atau bahan yang akan disterilkan pada bagian rak autoclave.

c. Masukkan alat dan bahan yang ada di dalam rak tersebut ke dalam bejana autoclave,

dan tutup dengan rapat (kecuali klep udara).

Oleh: I N. Sujaya


d. Panaskan autoclave ini dan biarkan semua udara yang ada di dalamnya keluar (yang

ditandai dengan keluarnya tetes-tetes air melalui lkep udara.

e. Tutup klep udara bila semua udara dalam autoclave sudah keluar.

f. Pemanasan dilanjutkan sampai mencapai suhu 121 oC dan tekanan 15 lbs, selama 15

menit.

g. Pemanasan dihentikan, suhu dikembalikan ke suhu kamar dan tekanan pada titik 0.

h. JANGAN PERNAH MENCOBA UNTUK MEMBUKA AUTOCLAVE SEBELUM

JARUM PENUNJUK TEKANAN MENUNJUKAN PADA ANGKA 0 (NOL),

KARENA SANGAT BERBAHAYA!!!!!!!.

Meter tekanan

uap dan suhu

Tempat

pembuangan uap

Klep pengunci

Gambar 3-1. Autoclave manual

Catatan : Bila di dalam autoclave terdapat :

a. 100 % uap air murni, maka suhu yang dicapai adalah 121 oC dan tekanan 15 lbs.

b. 2/3 bagian uap air dan 1/3 udara, maka suhu dan tekanan yang dicapai adalah 115 oC

dan 15 lbs.

c. 1/3 bagian uap air dan 2/3 udara, maka suhu dan tekanan yang dicapai adalah 109 oC

dan 15 lbs.

d. 100 % udara, maka suhu dan tekanan yang dicapai adalah 100 oC dan 15 lbs.

3.2. Sterilisasi dnegan radiasi

Dilakukan dengan menggunakan cahaya gelombang pendek, seperti UV atau sinar

Co 60 atau Cs 69. Dalam praktikum ini akan dilakukan sterilisasi medium padat dengan

menggunakan sinar UV.

Oleh: I N. Sujaya


Gambar 3-2. autoclave elektrik

Dalam melakukan autoclaving menggunakan autoclave ini lakukan sebarai berikut :

1. Isi chamber dengan air sampai permukaan atas air sedikit di atas permukaan

kerajang.

2. Masukkan bahan dan alat ke dalam kerajang di dalam autoalve dnegan memutar

(full) handle 1.

3. Hidupkan mesin dnegan menekan power on.

4. Tutup rapat autoclave

5. Atur meter suhu (4) untuk menetukan susu autoclave (panel 4)

Oleh: I N. Sujaya


6. Atur lama waktu aucocklave (panel 5)

7. Tutup rapat pengeluaran uap panel 2)

8. Tekan star (panel 8)

Auclaving akan berjalan secara otomati, dan lampu pada panel lama waktu

autoclaving akan menyala menunjukkan proses autoclaving (panel 7).

Apabila proses autoclaving telah selesai, maka akan mterdengar bunyi

“Ti..Ti.....Ti....”.

Setelah selesai proses autoclaving maka lakukan sebagai berikut:

1. Tekan stop (panel 9)

2. Buka keran pengeluaran uap (panel 2) sampai uap semuanya keluar

3. Pastikan tekanan di dalam mesin ‘NOL” (lihat panel 3).

4. Setelah tenaklan NOL baru mesin autoclave bisa di buka dan bahan/alat yang

diosterilkan dikeluarkan dan di aruh ditempat yang berseih.

5. Matikan power mesin autoclave.

A. Sterilisasi dengan UV

Alat dan bahan

a. Cawan petri

b. Medium Agar tegak.

c. Lampu UV

d. Lampu Bunsen

Cara kerja

a. Cairkan 3 tabung medium Agar tegak dalam penangas air.

b. Tuangkan ke dalam 3 cawan petri steril dan biarkan membeku.

c. Sinari cawan petri pertama dengan UV selama 1 menit, cawan kedua selama 3 menit,

dan cawan ketiga tidak disinari (dalam keadaan terbuka).

d. Inkubasi cawan petri selama 24 - 48 jam pada suhu 37 oC, dalam keadaan terbalik.

e. Amati pertumbuhan mikroba pada ketiga cawan petri tersebut.

3.3. Sterilisasi dengan zat kimia

Zat-zat kimia seperti alkohol, formalin, karbol, lisol, sabun, dan lain-lain dapat dipakai

untuk mensterilkan alat-alat. Pada praktikum ini akan dilakukan sterilisasi dengan

menggunakan beberapa zat kimia.

A. Sterilisasi dengan alkohol

Alat dan bahan

a. Cawan petri steril

b. Medium NA tegak

c. Jarum pentul/Paku kecil.

d. Alkohol dengan konsentrasi 40 %, 70 %, dan 96 %

e. Air steril

Oleh: I N. Sujaya


f. Pinset

Cara kerja

a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan tuangkan kedalam cawan petri. Biarkan

membeku pada suku kamar.

b. Rendam jarum pentul atau paku dalam larutan alkohol diatas selama 10 menit.

c. Cuci jarum pentul dengan air steril dan letakkan pada permukaan medium dalam

cawan petri.

d. Inkubasi pada suhu 28 - 30 oC selama 24-48 jam.

e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada sekitar jarum pentul. Larutan mana yang

paling efektif.

f. Lakukan hal yang sama dengan menggunakan formalin 4 %, lisol dan karbol.

B. Sterilisasi dengan sabun

Alat dan bahan

a. Cawan petri steril

b. Medium NA tegak

c. Sabun dengan berbagai Merek dagang.

Cara kerja

a. Cairkan 2 tabung medium NA tegak dalam penangas air dan tuangkan ke dalam dua

cawan petri steril

b. Apuskan jari tangan saudara yang belum dicuci pada permukaan medium pada cawan

petri pertama.

c. Cuci jari tangan saudara dengan sabun merk tertentu sebersih mungkin dan biarkan

kering dengan sendirinya (jangan di keringkan dengan lap). Setelah kering, apuskan

jari saudara pada permukaan medium dalam cawan petri kedua.

d. Inkubasi kedua cawan petri tersebut selama 24-48 jam pada suhu 28-30 oC.

e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada kedua cawan petri tersebut.

3.4. Sterilisasi dengan membrane filter

Bahan-bahan yang tidak boleh dipanaskan, seperti serum dan beberapa macam gula

tertentu dapat disterilkan dengan menggunakan membran filter. Dalam bidang

mikrobiologi, alat penyaring yang paling banyak dipergunakan adalah filter berkerfield,

filter chamberland, filter seilz, dll. Filter-filter ini terbuat dari polimer khusus dengan

diameter 0,45 mikron, sehingga dapat menahan bakteri yang terkandung dalam sample.

Dalam praktikum ini saudara akan menggunakan membran yang terbuat dari polisulfon,

yang diproduksi oleh Millipore.

Alat dan bahan

a. Polisulfon membran dengan diameter 0,22 mikron (hidrofilik)

b. Satu set alat percobaan membran lengkap dengan regulator gas.

c. Cawan petri

d. Botol McCartney

e. Gun pipet lengkap dengan tipsnya

f. Medium NA tegak

g. Air tercemar

Oleh: I N. Sujaya


Cara kerja

a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan biarkan pada temperatur 40 oC.

b. Saringlah sejulah air yang sudah tercemar (air kali) dengan menggunakan membran

polisulfon.

c. Pipet sebanyak 1 ml. Air hasil saringan ini dan tempatkan ke dalam cawan petri

d. Sebagai kontrol, pipet 1 ml air yang belum disaring dan tempatkan pada cawan petri

kedua.

e. Tuangkan masing-masing satu tabung medium NA (suhu 40 oC) ke dalam masing-

masing cawan petri yang sudah berisi sampel air.

f. Goyang kedua cawan sedemikian rupa sehingga sampel menjadi homogen dengan

medium, dan biarkan membeku.

g. Inkubasi kedua cawan petri tersebut pada suhu 20-30 oC selama 24-48 jam.

h. Amati kedua cawan petri !!. Kesimpulan apa yang dapat anda ambil dari percobaan ini

?

Oleh: I N. Sujaya


PRAKTIKUM

4 ENUMERASI DAN ISOLASI

Perhitungan jumlah mikroba (enumerasi) yang terkandung di dalam sampel dapat

dilakukan dengan berbagai cara, antara lain: metode pengenceran, metoda perhitungan

langsung dalam ruang hitung (hemasitometer), Metode membran filter, metode berat

kering dan volume sel, metode MPN, dll. Pada praktikum ini, saudara akan belajar

menentukan jumlah sel yang terdapat dalam suatu sample dengan menggunakan metoda

pengenceran dan metoda penghitungan langsung dengan menggunakan alat

haemasitometer (Improved New Bauwer).

4.1 Metoda pengenceran

Metoda pengenceran ini menggunakan suatu seri pengenceran dari sampel yang

kemudian ditanam pada medium. Setelah diinkubasi, koloni yang tumbuh dapat dihitung

dengan asumsi bahwa satu koloni yang tumbuh berasal dari satu sel. Dengan demikian,

maka jumlah sel pada sample asal dapat dihitung dengan cara mengalikan jumlah koloni

yang tumbuh dengan faktor pengencernya. Pengenceran biasanya dinyatakan dengan

pangkat negatif, misalnya 10-5 untuk pengenceran 1:100.000. Dengan menggunakan

metoda ini kita dapat menghitung jumlah total mikroba yang terdapat dalam sample air

atau sample tanah.

Alat dan bahan

a. Sampel (bahan makanan, air dan bahan lainnya)

b. media NA (atau media lain yang sesuai dengan tujuan)

c. Botol steril (eppendorf tube)

d. Cawan petri

e. Larutan NaCL 0,85% steril

f. Pipetman

Cara kerja

a. Ambil sampel air secara aseptik dengan menggunakan botol steril.

b. Cairkan medium NA dalam penangas air dan dinginkan sampai suhu 45oC.

Kalau menggunakan cara sebar, Media Agar siap pakai sudah disiapkan di dalam

cawan petri.

c. Tandai 6 cawan petri dengan 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ,10-6.

d. Kocok sampel air sampai homogen dan ambil secara aseptik sebanyak 1 ml, kemudian

dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml air steril untuk mendapatkan

faktor pengenceran sebesar 10 kali (10-1).

e. Kocok tabung reaksi ini dengan baik, dan ambil air di dalamnya secara aseptik

sebanyak 1 ml, dan masukkan ke dalam cawan petri yang bertanda 10-1. Dari tabung

ini juga, ambil sebanyak 1 ml sampel dan masukkan ke dalam tabung reaksi kedua

Oleh: I N. Sujaya


yang telah berisi 9 ml air steril untuk memperoleh faktor pengenceran sebesar 100 kali

(10-2).

f. Masukkan sebanyak 0,1 ml bertanda 10-2 ke dalam media agar, lalu sebar dipermukaan

Media Agar dengan mempergunakan gelas kaca bengkok. Celupkan gelas kaca

bengkok ke dalam alkohol 70%, bakar di atas api, dan dinginkan sebelum dilakukan

penyebaran.

g. Lakukan lamgkah (f) pada pengenceran yang lainnya.

h. Untuk menghitung total mikroba dalam sampel lainnya, prosedur yang dipakai persis

sama dengan diatas, tetapi banyaknya sample yang harus ditimbang adalah 1 gram

sample padat atau 1 ml sample cair (Perhatikan lampiran !!!!).

i. Inkubasi semua cawan yang telah ditanami dengan sample yang berisi mikroba pada

temperature 37 oC selama 24 jam.

j. Lakukan penghitungan koloni yang tumbuh pada semua cawan Petri yang jumlah

koloninya berkisar antara 30 – 300 koloni.

k. Jumlah sel mikroba yang terdapat pada sample dihitung dengan cara mengalikan

jumlah koloni yang tumbuh pada medium dengan factor pengenceran.

Oleh: I N. Sujaya


Metode pengencera

Gambar 4-1. Cara menyebarkan (spreading) sample di cawan petri

Contoh

bahan cair

9 ml

(10-1)

9 ml

(10-2)

9 ml

(10-3)

9 ml

(10-4)

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

X = julah koloni yang tumbuh dalam cawan petri X 10 X faktor pengenceran

Oleh: I N. Sujaya


PRAKTIKUM

5 BIAKAN MURNI

5.1. Pendahuluan

Untuk memepelajari karakteristik mikrooragnisme, langkah awal yang harus dilakukan

adalah mengisolasi mikrooragnisme dari sumbernya. Salah satu cara mengisolasi

mikroorganisme dari campuran mikroorganisme adalahd neagn teknik penggoresan

(streak plate techniques) (Gamba 4.1.). Atau mikrooragnisme bisa pula diisolasi dari

media agar yang sudah disebar setelah melakukan penghitungan jumlah mikroorganisme

menggunakan agar tuang. Dalam melakukan isolasi, diperlukan suatu teknik aseptik

sehingga mikrooragnisme yang kita dapatkna tidak tercemar (kontaminsa) olehg

mikroorganisme lainnya. Dan untuk langkah ini dfalam teknik dasar mikroobiologi

biasanya dilakukan dnegan pemurnian isolat dengan beberapa kali penggoresan yang

berulang (re-streaking) dengan cara yang sama seperti di bawah ini.

5.2. Isolasi mikroba

Alat dan bahan

a. Cawan petri

b. Medium NA

c. Medium NA miring

Cara kerja

a. Cairkan media NA tegak dalam penangas air dan tuangkan ke dalam cawan petri steril.

b. Setelah beku, pilihlah koloni-koloni yang tumbuh pada cawan hitung dalam

enumerasi, yang menurut saudara menarik. Lakukan “streak for single colony” pada

media steril dalam cawan petri yang telah beku.

c. Inkubasi selama 24 jam.

d. Isolasi koloni yang tumbuh dan tanam pada medium agar miring. Biakan ini akan

dipakai pada praktikum selanjutnya.

Oleh: I N. Sujaya


Gambar 5-A. Pilih koloni

yang mudah diambil

secara random dari cawan

Petri.

Gambar 5-B. Ambil koloni

tunggal.

Gambar 5-C. Lakukan penggoresan.

Setiap memulai goresan baru, jarum

ose harus dipanaskan.

Oleh: I N. Sujaya


PRAKTIKUM

6 PEWARNAAN SEL BAKTERI

6.1. Pendahuluan

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan

terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Tujuan pewarnaan adalah:

1. Mempermudah pengamatan bentuk sel mikroorganisme (khususnya bakteri).

2. Memperjelas ukuran jasad

3. Dapat mengamati struktur luar dan struktur dalam dari sel mikroba.

4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan, sehingga sifat fisik, kimia dari

jasad dapat diketahui. Dengan demikian, kita dapat menggunakan pewarnaan sebagai

salah satu cara untuk klasifikasi bakteria. Berhasil atau tidaknya pewarnaan sangat

ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (Umur biakan

yang baik adalah 24 jam).

6.2 Berbagai macam metoda pewarnaan

6.2.1 Pewarnaan langsung dengan pewarna basa

Umumnya zat pewarna merupakan garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang

bermuatan positif atau negatif, dimana salah satu ion-ion tersebut berwarna. Kalau suatu

sel bakteri yang dinding selnya bermuatan relatif negatif bersatu dengan ion yang

bermuatan positif dari suatu pewarna, maka menyebabkan sel bakteri tersebut terwarnai.

Zat pewarna dapat dikelompokkan menjadi dua group, yaitu zat pewarna yang

bersifat basa dan zat pewarna yang bersifat asam. Kalau ion positif dari zat pewarna yang

mengandung warna tersebut, maka pewarna tersebut adalah pewarna basa. Dan bila warna

tersebut berada pada ion yang bermuatan negatif, maka pewarna tersebut adalah pewarna

asam.

Alat dan bahan

a. Kultur bakteri yang diiolasi dalam praktikum sebelumnya dan beberapa biakan murni.

b. Pewarna Metilene blue

c. Pewarna kristal violet.

d. Karbol fuhsin

e. Kaca objek bersih dan kaca penutup.

Cara kerja.

a. Letakkan sebuah kaca objek yang bebas lemak diatas meja kerja.

b. Teteskan setetes air ditengah-tengah kaca objek tersebut.

c. Dengan menggunakan jarum Ose yang telah dipijarkan, ambil sedikit biakan bakteri

yang saudara isolasi pada praktikum sebelumnya atau dari biakan murni bakteri yang

disediakan oleh asisten saudara.

Oleh: I N. Sujaya


d. Buat apusan bakteri pada air yang diletakkan pada kaca objek dengan cara menggesek-

gesekan jarum ose yang berisi biakan bakteri, sehingga didapatkan suatu campuran

yang tipis dan merata.

e. Fiksasi diatas api bunsen dengan jarak sekitar 30 Cm. Dari nyala api. Dalam

memfiksasi ini jangan terlalu panas karena dapat merusak bentuk sel.

f. Teteskan salah satu larutan pewarna yang disediakan oleh asisten pada sediaan yang

telah difiksasi. Pewarna Metilene blu akan mewarnai sel dalam 30 - 60 detik, Kristak

violet dalam 10 detik, dan Karbol fuhsin dalam 5 detik.

g. Cuci dengan air mengalir.

h. Keringkan sediaan dengan meletakkannya diantara kertas saring.

i. Amati dengan mikroskop dengan menggunakan lensa objektive dengan perbesaran 100

kali, dan minyak imersi.

j. Catat dan gambar bentuk sel dan warna sel mikroorganisme yang saudara lihat.

Pertanyaan :

1. Apakah kultur yang saudara isolasi merupakan kultur murni, mengapa ?

2. Apa maksud memfiksasi sediaan ?.

6.2.2. Pewarnaan negatif atau pewarnaan tak langsung

Salah satu pewarna asam adalah nigrosin atau tinta cina. Karena daya mewarnai pada zat

ini berada pada ion negatif dan tidak bereaksi dengan ion negatif lainnya dari sel bakteri,

maka pewarna ini tidak mewarnai sel. Dalam hal ini, yang terwarnai adalah lingkungan

sekitar sel. Dengan cara ini saudara sudah dapat mengamati bentuk-bentuk sel bakteri dan

juga ukurannya dengan jelas.

Alat dan bahan

a. Kultur bakteri hasil isolasi atau kultur yang disediakan oleh asisten.

b. Cairan nigrosin atau tinta cina

c. Kaca objek bebas lemak.

Cara kerja

a. Teteskan sati tetes cairan nigosin atau tinta cina pada pinggir ujung kaca objek.

b. Dengan menggunakan jarum Ose yang telah dipijarkan, ambil sedikit biakan bakteri

dan suspensikan pada tetesan nigrosin pada permukaan kaca objek.

c. Ratakan suspensi bakteri dalam nigrosin pada permukaan kaca objek ini dengan

menggunakan kaca objek lain.

d. Biarkan kering pada suhu kamar, dan amati dengan mikroskop (perbesaran lensa

objektif 100 x), dan pakai minyak imersi.

e. Gambar bentuk bakteri yang saudara lihat.

Cara-cara pewarnaan berikut merupakan teknik pewarnaan diferensial, sebagai

salah satu cara dalam mengklasifikasi bakteri.

Oleh: I N. Sujaya


6.2.3. Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan yang sangat umum dalam bidang

bakteriologi. Dengan pewarnaan ini, kelompok bakteri dapat dibedakan menjadi dua,

yaitu kelompok bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif . Ada banyak modifikasi

dari teknik pewarnaan ini, namun semua teknik tersebut berdasarkan pada prinsip yang

sama, yaitu :

1. Mewarnai mikroorganisme dengan pewarna dasar, yaitu dengan kristal violet atau

gentian violet.

2. Fiksasi warna, yaitu untuk menguatkan perlekatan warna dasar, misalnya dilakukan

dengan garam iodin (modifikasi larutan lugol).

3. Pencucian atau penghapusan warna dasar dengan alkohol, aseton, atau campuran

alkohol dengan aseton.

4. Pewarnaan kembali dengan pewarna pembanding atau kontras yang berbeda dengan

pewarna dasar, yaitu untuk mewarnai sel-sel yang telah hilang warnanya oleh

penghapusan warna. Misalnya dalam hal ini dipakai safranin atau karbol fuhsin..

Bakeri yang setelah diwarnai dengan pewarna dasar warnanya tidak terhapus oleh

alkohol akan berwarna violet karena terwarnai oleh kristal violet, dan tidak lagi menyerap

pewarna kontras. Kelompok bakteri yang mempunyai sifat ini dikelompokkan menjadi

bakteri Gram positif. Sedangkan, kelompok bakteri yang telah diwarnai dengan pewarna

dasar dan warnanya terhapus setelah diperlakukan dengan alkohol, akan menyerap

pewarna safranin atau karbol fuhsin yang dipakai sebagai pewarna kontras, sehingga

dalam preparat akan terlihat warna merah(warna safranin atau karbol fuhsin). Kelompok

bakteri yang demikian disebut dengan bakteri Gram negatif.

Alat dan bahan

a. Kultur muda bakteri yang diisolasi atau yang disediakan oleh asisten.

b. Larutan kristal violet

c. Larutan garam iodin.

d. Alkohol 95 %.

e. Larutan safranin

f. Kaca objek

Cara kerja

a. Buat apusabn bakteri pada kaca objek kering dan bersih.

b. Fiksasi diatas nyala api bunsen atau di udara.

c. Warnai dengan larutan kristal violet selama 1 - 1,5 menit.

d. Cuci dengan air suling.

e. Tetesi dengan larutan garam iodin, dan biarkan selama 1 menit.

f. Cuci dengan larutan alkohol 95 % sampai warnanya terhapus, biasanya selama 0,5

menit (30 detik).

g. Cuci dengan air.

h. Warnai dengan safranin atau karbol fuhsin selama 2 menit.

i. Cuci dengan air, dan buang kelebihan air dengan menggunakan kertas hisap, tanpa

menggosok sediaan.

Oleh: I N. Sujaya


j. Keringkan diudara atau diatas nyala api bunsen.

k. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. (ingat pakai minyak imersi).

l. Catat pengamatan saudara.

Gambar 6-1. Zat warna umum yang digunakan dalam pewarnaan Gram

Langkah kerja

NO. Langkah Waktu Keterangan

1 Krital violet 60 detik Zat warna utama

2 Cuci dnegan air Cuci sedikit saja

3 Gram lar. Yod

(Lar Mordan)

60 detik Sebagai Mordant, membantu zat warna mebentuk

kompleks (terikat kuat) dengan bagian bermuatan

dalam didinding sel, plasma membran dan sitoplasma.

4 Cuci dengan air Cuci dengan

saksama

5 Alkohol 95% 10 detik Pencuci zat warna, kompleks yod-kristal violet

kompleks. Karena bakteri Gram negatif mempunyai

didning sel lebih tipis dari Gram positif maka

kompleks yod-kristal violet akan tercuci dnegan cepat

6 Cuci dengan air Cuci dengan

saksama

7

Safranin 60 detik Zat warna sekunder. Fungsi safranin adalah sebagai

zat warna pengkonter dari warna vbakteri Gram,

negatif yang tercuci karena penambahan alkohol.

Bakteri Gram positif hanya sedikit mengikat safranin

karena bagian bermuatan sudah diikat oleh kristal

violet.

8 Cuci dnegan air Bilas sebentar

saja

9 Keringkan Dengan tissue

kering

Oleh: I N. Sujaya


C

N-asetil muramat

N-asetil muramat

..... peptida pendek

___ jembatan peptida

B Gambar 6-A: Komponen dinding sel bakteri Gram positif;

(6-B): Gram negatif; 6-C: lapisan peptidoglikan

DAFTAR PUSTAKA

1. Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. Brock Biology of Microorganisms. 10 th

Ed. Perason Education Inc. Upper Saddle River, New Jersey (2003).

2. Lay, D.W. Analisis Mikroba di Laboratorium. Penerbit Raja Grafindo Persada,

Jakarta (1994).

3. Seely, H.W.Jr., dan VanDemark, P.J. Microbes in cation. A Laboratory Manual of

Microbiology. 3rd Ed. W.H. Freeman and Company. San Francisco (1981).

4. Hairy, J.B. Clinical Diagnostic and Management by Laboratory Method, 9ed, WB

Saunders, Co. (1989).

5. Colome, J.S., Kubinski, A.M., Cano, R.J., Grady, D.V. Laboratory Exercise in

Microbiology. West Pub. Comp., USA. (1986).

6. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and Direct Sequencing of

Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. In PCR Protocols. A Guide to

Methods and Applications, ed. Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. & White,

T.J. pp.315-322. San Diego: Academic Press, Inc. ISBN 0-12-372181-4 (1990).

7. Ausbel F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A.,

Struhl, K., Albright, L.M., Coen, D.M., Varki, A. Current Protocols in Molecular

Biology. Jhon Wiley & Son, Inc., USA (1997)

A

penuntun praktikum mikrobiologi...oleh: i n. sujaya petunjuk praktikum mikrobiologi 2 kata pengantar...

Documents