MODUL BIOLOGI MOLEKULER

2015

Drs. Yurnadi M.Kes.03/13/2008

Goal Isolation DNA : To isolate DNA from the cell The Cell and Its Organels

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN

ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS BENGKULU

2015

2

PENUNTUN PRAKTIKUM

KIMIA

MODUL BIOLOGI MOLEKULER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN

ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS BENGKULU

2015

3

KARBOHIDRAT

1. Tes Molisch

Tujuan : Merupakan test umum karbohidrat

Prinsip :

Karbohidrat dengan asam sulfat pekat menghasilkan senyawa furfural. Senyawa

furfural dengan pereaksi alfa naftol menghasilkan senyawa yang berwarna ungu.

Hasil negatif merupakan suatu bukti bahwa tidak ada karbohidrat.

Alat dan Bahan :

Alat :

1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Tabung Ukur 4. Pipet tetes

Bahan :

1. Larutan Sampel (Monosakarida, disakarida, polisakarida) 2. Pereaksi Molisch 3. Asam Sulfat Pekat

Cara kerja :

2 ml larutan monosakarida dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diberikan 3 tetes

pereaksi Molisch. Kocoklah. Miringkan tabung tsb sekitar 45 derajat, kemudian

tambahkan dengan hati-hati 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung reaksi itu,

sehingga tak bercampur. Jangan dikocok. Reaksi positif ditandai oleh pembentukan

suatu cincin berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan cairan.

Ulangi percobaan dengan satu larutan disakarida dan satu larutan polisakarida.

2. Tes Benedict Tujuan:

Mengetahui sifat reduksi karbohidrat

Prinsip : Larutan tembaga dalam suasana basa akan direduksi oleh gula yang mempunyai

gugus aldehida atau keton bebas, sehingga akan terbentuk endapan kupro-oksida yang

berwarna merah.

Larutan Benedict mengandung kupri sulfat, natrum karbonat, dan natrium sitrat.

Alat dan Bahan :

Alat :

1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi

4

3. Pipet tetes 4. Penangas Air 5. Penjepit tabung reaksi

Bahan :

1. Larutan Sampel (glukosa, laktosa, maltose dan sukrosa) 2. Larutan Benedict

Cara kerja :

Masukkan 1 ml larutan Benedict ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 2 mL larutan

glukosa atau fruktosa. Masukkan ke dalam penangas air mendidih selama 3 menit,

dinginkan perlahan-lahan. Perhatikan apakah ada endapan yang terbentuk. Adanya

endapan menandakan reaksi positif. Ulangi percobaan terhadap larutan laktosa atau

malltosa, dan sukrosa.

3. Modifikasi tes Barfoed

Tujuan :

Membedakan monosakarida dan disakarida.

Prinsip :

Tes ini untuk mendeteksi adanya monosakarida. Reaksi Barfoed berlangsung dalam

suasana asam. Reagen Barfoed mengandung larutan kupri asetat dan asam laktat.

Dengan penambahan larutan fosfomolibdat, larutan monosakarida akan memberikan

warna biru tua, sedangkan larutan disakarida akan memberikan warna biru muda.

Alat dan Bahan :

Alat :

1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Tabung Ukur 4. Pipet tetes 5. Penangas Air 6. Penjepit tabung reaksi

Bahan :

1. Larutan Sampel (glukosa, laktosa, maltose dan sukrosa) 2. Aquadest 3. Larutan Barfoed 4. Pereaksi Fosfomolibdat

Cara kerja :

10 tetes larutan glukosa + 10 tetes akuades ke dalam tabung reaksi, kemudian

tambahkan 1 ml larutan Barfoed .Panaskan dalam penangas air mendidih selama tiga

menit. Dinginkan dalam gelas kimia yang berisi air selama tiga menit. Tambahkan 1

ml pereaksi fosfomolibdat. Warna biru tua menunjukan adanya monosakarida.

Ulangi percobaan terhadap larutan sukrosa, laktosa, dan air sebagai blanko.

5

4 Tes Selliwanoff Tujuan :

Membedakan karbohidrat yang mempunyai gugus keto dan aldehid

Prinsip : Karbohidrat atau turunannya (4-hidroksi metil furfural) dengan resorsinol

menghasilkan senyawa yang berwarna merah.

Alat dan Bahan :

Alat :

1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Tabung Ukur 4. Pipet tetes 5. Penangas Air 6. Penjepit tabung reaksi

Bahan :

1. Larutan Sampel (glukosa, fruktosa dan sukrosa) 2. Pereaksi Selliwanoff

Cara Kerja :

Masukan 2 ml larutan glukosa ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 2 ml pereksi

Selliwanoff. Campur dan panaskan dalam penangas air mendidih selama 30 60 detik. Perhatikan warna yang terjadi. Ulangi percobaan ini terhadap larutan fruktosa

dan sukrosa .

LIPID

Tes Hubl

Tujuan :

Mengetahui ikatan tak jenuh dalam suatu lipid.

Prinsip :

Lipid dapat mengalami reaksi adisi. Untuk menentukan adanya ikatan rangkap,

sampel direaksikan dengan larutan Hubl. Berkurangnya warna merah larutan Hubl,

menunjukan adanya ikatan rangkap.

Alat dan Bahan :

Alat :

1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Tabung Ukur 4. Pipet tetes 5. Penangas Air 6. Penjepit tabung reaksi

Bahan :

6

1. Kloroform 2. Minyak goreng 3. Larutan mentega 4. Larutan Hubl

Cara kerja :

Sediakan tiga tabung reaksi.

Ke dalam tabung I, masukkan 2 mL kloroform,

Ke dalam tabung II, masukkan 1,5 ml kloroform + 10 tetes minyak

Ke dalam tabung III, masukkan 10 tetes larutan mentega dalam 1,5 ml kloroform

Masukkan ke dalam ke-3 tabung tersebut, 2 tetes larutan Hubl, kocok dan setelah 5

menit bandingkan warna yang terbentuk pada tiap tabung.

PROTEIN

1. Reaksi Biuret

Tujuan :

Mengetahui adanya ikatan peptida pada protein. Percobaan ini merupakan test umum

untuk mengetahui adanya protein.

Prinsip :

Proten dengan tembaga hidroksida membentuk kompleks berwarna ungu.

Alat dan Bahan :

Alat :

1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Tabung Ukur 4. Pipet tetes

Bahan :

1. Larutan sampel (Albumin, kasein, dan gelatin) 2. NaOH (5%) 3. Larutan CuSO4 4. Minyak goring 5. Larutan mentega

Cara kerja :

2 ml larutan albumin dicampur dengan 2 ml NaOH (5%) dan tambahkan

5 tetes larutan CuSO4 , kocok. Ulangi percobaan ini dengan larutan

kasein dan gelatin.

2.Reaksi Millon

Tujuan :

Untuk mengetahui gugus mono hidroksi benzen dalam sampel protein.

7

Prinsip :

Reaksi ini bergantung adanya derivat mono hidroksi benzen seperti tirosin dan fenol.

Alat dan Bahan :

Alat :

1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Tabung Ukur 4. Pipet tetes 5. Penangas Air 6. Penjepit tabung reaksi

Bahan :

1. Larutan sampel (Albumin, kasein, dan gelatin) 2. Reagen Millon

Cara kerja :

Dalam tabung reaksi, campurkan 2 mL albumin dangan 3 tetes reagen Millon.

Panaskan 5 menit. Adanya endapan merah menunjukan positip reaksi Millon. Ulangi

percobaan dengan gelatin dan kasein.

3. Pengaruh alkohol terhadap protein.

Tujuan :

Mengetahui pengaruh alkohol terhadap protein.

Prinsip : Protein dapat membentuk presipitat dengan alkohol. Penambahan air, dapat

menyebabkan protein akan jernih kembali. Percobaan ini menunjukan sifat

reversibilitas protein.

Alat dan Bahan :

Alat :

1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Tabung Ukur 4. Pipet tetes

Bahan :

1. Larutan sampel (Albumin, kasein, dan gelatin) 2. Alkohol 3. Aquadest

Cara kerja : 2 ml larutan albumin dicampur dengan 3 ml alkohol, kemudian tambahkan 5 ml air.

Percobaan diulangi terhadap gelatin kasein.

8

Bagan untuk lab test

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODA BIURET

1. Pendahuluan :

Di alam protein terdapat dalam 3 ( tiga ) bentuk, yaitu ;

a. Protein bebas.

b. Protein yang tidak terlarut , terdapat dalam tulang, otot, rambut dan

gumpalan darah.

c. Protein terlarut, terdapat banyak dalam bahan pangan seperti susu,

telur dan daging.

Kadar protein terlarut dapat ditentukan berdasarkan pada berbagai metoda, misalnya : titrasi

formol, spektrofotometri dan sebagainya. Teknik spektrofotometri yang biasa digunakan

untuk analisis protein antara lain adalah dengan metode biuret.

2. Prinsip Reaksi

Dalam suasana basa, zat yang mengandung dua atau lebih ikatan peptida dapat membentuk

kompleks berwarna ungu jika direaksikan dengan garam tembaga (pereaksi biuret)

SAMPEL

1 mL NaOH + 2 tetes CuSO4

KARBOHIDRAT PROTEIN

UNGU

1. Millon

2. Alkohol

BIRU

1. Molisch 2. Barfoed 3. Benedict

4. Seliwanoff

9

3. Tujuan

Untuk menentukan kadar protein terlarut dengan metode biuret

4. Bahan & Alat

Larutan protein yang diselidiki (larutan sampel) dan larutan standar protein

Pereaksi biuret

Tabung reaksi 20 ml

Spektrofotometer

Kuvet

5. Cara kerja

a. Persiapan larutan standar dan blanko

1. Masukkan campuran berikut ke dalam tabung reaksi 20 ml :

2. Tentukan konsentrasi standar protein yang baru dan masukkan datanya

ke dalam tabel di atas.

b. Persiapan alat spektrofotometer

1. Panaskan spektrofotometer 30 menit sebelum digunakan

2. Atur nilai absorban menjadi nol

3. Atur panjang gelombang pada 550 nm

4. Masukkan larutan tabung no. 1 ke dalam kuvet (sebagai larutan blanko)

dan letakkan kuvet pada alat spektrofotometer

5. Atur nilai absorban blanko menjadi 0 (100% transmitan)

c. Pembuatan kurva standar

1. Masukkan larutan tabung no. 2 s/d no. 4 ke dalam kuvet

No.

Tabung

Vol stok standar

protein 50 mg/ml

(ml)

Vol Akuades

(ml)

Vol pereaksi

biuret

(ml)

Konsentrasi

standar protein

(mg/ml)

1 ( blanko) - 1,00 9,00

2 1,00 - 9,00

3 0,75 0,25 9,00

4 0,50 0,50 9,00

Kompleks tembaga-protein

(ungu)

10

2. Baca nilai absorban tabung no. 2 s/d no. 4, masukkan datanya pada tabel

di bawah ini

No.

Tabung

Konsentrasi

standar protein

(mg/ml)

Nilai Absorban (A)

3. Buat kurva kalibrasi antara A dengan konsentrasi standar protein (C)

pada kertas grafik atau buat persamaan garis A= mC + b

dengan : A = Nilai absorban yang diukur (A)

C = Konsentrasi standar protein (mg/ml)

m = Gradien garis atau dy/dx

b = Nilai perpotongan garis pada sumbu y

d. Pengukuran larutan sampel

1. Masukkan 1,00 ml sampel, dan 9,00 ml pereaksi biuret ke dalam tabung

reaksi 20 ml

2. Masukkan larutan sampel ke dalam kuvet

3. Ukur nilai absorban larutan sampel

4. Tentukan konsentrasi larutan sampel dengan memplot nilai A sampel

pada kurva hubungan antara A dengan konsentrasi standar, atau

dengan memasukkan nilai A

sampel pada persamaan garis A= mC + b.

11

PENUNTUN PRAKTIKUM

BIOKIMIA

MODUL BIOLOGI MOLEKULER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN

ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS BENGKULU

2015

12

FAKTOR- FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KERJA ENZIM

1. Pengaruh suhu terhadap kerja enzim

Tujuan :

membuktikan bahwa kecepatan reaksi enzimatik sampai suhu tertentu sebanding dengan

kenaikan suhu. Reaksi enzimatik mempunyai suhu optimum.

Dasar :

Suhu yang sangat rendah akan menyebabkan terhentinya kerja enzim secara reversible,

karena dalam keadaan tersebut tidak terjadi benturan antara partikel E (enzim) dan S

(substrat). Akibatnya komplek E-S yang sangat penting dalam reaksi enzimatik tidak

terbentuk, sehingga P yang terbentuk makin banyak. Keadaan ini terjadi sampai suhu

tertentu, yaitu suhu optimum.

Suhu yang lebih tinggi dari suhu optimum menyebabkan enzim terdenaturasi. Akibatnya

benturan E dengan S lebih gencar lagi, komplek ES tidak terbentuk karena enzim

terdenaturasi. Akibatnya pembentukan P berkurang. Denaturasi enzim dapat terjadi

irreversible terutama bila suhu lingkungan melampaui suhu optimum.

Bahan dan pereaksi :

1. Liur, sebagai sumber amilase. Tampunglah 2 ml liur dalam gelas kimia atau tabung reaksi yang bersih dan kering.

2. Larutan pati 0,4 mg/ ml. 3. Larutan iodium

Cara Kerja :

1. Encerkan liur 100x dengan air suling.

2. Siapkan 6 pasang tabung reaksi yang bersih.

a. pasangan pertama ditempatkan dalam bejana berisi es (0C)

b. pasangan kedua ditempatkan dalam bejana berisi air, yang suhunya dipertahankan

tetap pada 25C.

c. pasangan ketiga ditempatkan di rak tabung, pada suhu ruang.

d. pasangan keempat ditempatkan dalam penangas air yang suhunya dipertahankan

tetap pada 37C

e. pasangan kelima ditempatkan dalam penangas air yang suhunya dipertahankan

tetap pada 60C

f. pasangan keenam ditempatkan dalam penangas air mendidih (100C)

tiap pasangan tabung diberi tanda B untuk blanko dan U untuk uji.

Keram pasangan tabung pada setiap suhu selama paling sedikit 5 menit.

4. Pipetkan ke dalam tiap- tiap tabung

13

Larutan Tabung B Tabung U

Larutan pati 1 ml 1 ml

Keram pasangan tabung dari tiap suhu paling sedikit 5 menit

Liur (diencerkan 100x) - 200 ml

Campurkan baik- baik, keram tepat 1 menit

Larutan iodium (untuk suhu 60 dan 100C penambahan dilakukan

di luar penangas)

1 ml 1 ml

Air suling 8 ml 8 ml

Segera baca serapan (A) pada panjang gelombang 680 nm. Hitung selisih serapan ( A) antara tabung B (A pada t = 0 menit) dengan tabung U dari tiap suhu.

4. Buatlah tabel berikut ini :

Suhu AB AU A/ menit (v)

0C

25C

Suhu ruang

37C

60C

100C

5. Buatlah kurva yang menggambarkan hubungan kecepatan reaksi enzimatik ( v = A/ menit ) dengan suhu.

14

3. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim

Tujuan :

Membuktikan bahwa keasaman (pH) mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatik.

Dasar :

Enzim bekerja pada kisaran pH tertentu dan menunjukkan kerja maksimum pada pH

optimum. Di luar pH optimum aktivitas enzim dapat terganggu.

Bahan dan pereaksi :

1. Liur sebagai sumber amilase. Tampunglah 2 ml dalam gelas kimia atau tabung reaksi yang bersih dan kering.

2. Larutan pati 0,4 mg/ml dilarutkan dalam berbagai pH. (1,3,5,7,9, dan 11) 3. Larutan iodium

Cara kerja :

1. Encerkan liur 100x dengan air suling 2. Siapkan 6 pasang tabung reaksi yang bersih. Tiap pasangan tabung diberi tanda B

untuk blanko dan U untuk uji.

3. Pipetkan ke dalam tiap- tiap tabung

Larutan Tabung B Tabung U

Larutan pati dalam berbagai pH 1 ml 1 ml

Keram pada suhu 37C paling sedikit 5 menit

Liur (diencerkan 100x) - 200 ml

Campurkan baik- baik, keram tepat 1 menit

Larutan iodium 1 ml 1 ml

Air suling 8 ml 8 ml

4. Segera baca serapan (A) pada 680 nm. Hitung A antara tabung B (A pada t = 0 menit) dengan tabung U

5. Buatlah tabel berikut ini :

pH AB AU A / menit (v)

1

3

5

7

9

11

15

6. Buatlah kurva yang menggambarkan hubungan kecepatan reaksi enzimatik ( v = A/ menit ) dengan pH.

3. Pengaruh kadar enzim terhadap aktivitas enzim

Tujuan :

membuktikan bahwa kecepatan reaksi enzimatik berbanding lurus dengan konsentrasi

enzim.

Dasar :

Pada konsentrasi substrat tertentu, penambahan enzim dengan konsentrasi bertingkat akan

meningkatkan pembentukan kompleks enzim- substrat, sehingga jumlah produk yang

terbentuk akan meningkat.

Bahan dan pereaksi :

1. Liur, sebagai sumber amilase. Tampunglah 2 ml liur dalam gelas kimia atau tabung reaksi yang bersih dan kering.

2. Larutan pati 0,4 mg/dl 3. Larutan iodium

Cara kerja :

5. Encerkan liur 100x, 200x, 300x, 400x, dan 500x dengan air suling. 6. Siapkan 5 pasang tabung reaksi yang bersih dan kering. Tiap pasangan tabung diberi

tanda B untuk blanko dan U untuk uji.

7. Pipetkan ke dalam tiap- tiap tabung.

Larutan Tabung B Tabung U

Larutan pati 1 ml 1 ml

Keram pada suhu 37C paling sedikit 5 menit

Liur (diencerkan 100x -

500x)

- 200 ml

Campurkan baik- baik, keram tepat 1 menit

Larutan iodium 1 ml 1 ml

Air suling 8 ml 8 ml

4. Segera baca serapan (A) pada panjang gelombang 680 nm. Hitung selisih serapan

antara tabung B (A pada t = 0 menit) dengan tabung U dari tiap pengenceran enzim.

16

5. Buatlah tabel sebagai berikut :

Pengenceran enzim AB AU A / menit (v)

500x

400x

300x

200x

100x

6. Buatlah kurva yang menggambarkan hubungan antara kecepatan reaksi enzimatik (v = A/ menit) dengan konsentrasi atau pengenceran enzim.

Pemisahan Molekul Berdasarkan Perbedaan Berat Molekul

Dengan Kolom Kromatografi Gel Penyaring

Tujuan :

Memisahkan molekul hemoglobin dari molekul vitamin B12, dengan menggunakan

butiran- butiran mikroskopis dekstran (suatu bentuk polimer dari glukosa) sebagai

penyaring molekuler.

Dasar :

Dalam percobaan ini, digunakan butiran- butiran mikroskopis dekstran, suatu bentuk

polimer dari glukosa, dengan ukuran tertentu yang seragam, sebagai fasa stasioner atau

matriks pemisah. Dekstran yang menyusun butiran mikroskopis tersebut teranyam

sedemikian rupa, sehingga mempunyai mata anyaman dengan ukuran tertentu pula.

Partikel yang larut dalam fasa mobil dan dengan ukuran lebih kecil dari mata anyaman

tersebut akan terperangkap lagi dalam butiran yang lain, demikian seterusnya.

Sebaliknya, molekul dengan ukuran lebih besar dari mata anyaman tidak terperangkap

dan mengalir dalam cairan di antara- partikel- partikel tersebut. Akibatnya, molekul

dengan ukuran lebih besar dari mata anyaman tersebut menempuh jalan yang lebih

pendek dan keluar lebih dahulu dari kolom pemisah.

Alat dan Bahan :

Perangkat siap pakai, terdiri atas :

1. Larutan yang akan dipisahkan, yang mengandung hemoglobin dan vitamin B12 2. Kolom berisi gel penyaring molekul

3. Dapar kolom

4. Tutup ujung kolom

5. Pipet tetes

17

6. Tabung kalorimeter untuk menampung

Cara kerja :

1. Siapkan 16 tabung penampung. Tandai tabung 1 sampai tabung 16 dengan angka 1-

16. Tabung ke-16 ditandai dengan sisa. 2. Buka penutup atas dan penutup ujung kolom pemisah. Tampung dapar kolom dalam

tabung ke-16 (sisa) samapi hampir seluruh dapar keluar. Tutup kembali ujung kolom pemisah.

3. Dengan hati- hati, tempatkan kolom tersebut ke tabung no.1.

4. Dengan pipet yang tersedia, teteskan 2-3 tetes campuran Hb dan vitamin B12 tepat di

atas permukaan gel dengan hati- hati sekali supaya tidak mengganggu gel.

5. Segera setelah campuran Hb dan vitamin B12 masuk ke dalam gel, tambahkan dapar

kolom secukupnya ke permukaan gel dalam kolom. Penutup ujung kolom dibuka

hanya pada saat pemisahan dilakukan.

6. Tampung fraksi 5 tetes dalam tiap tabung penampung. Permukaan gel tidak boleh

kering maka sambil menampung fraksi dapar kolom terus ditambahkan sedikit demi

sedikit ke permukaan gel.

7. Setelah pemisahan selesai, tutup kembali ujung kolom pemisah.

8. Catat warna dan intensitas dari tiap tabung. Ukur serapan fraksi- fraksi pada panjang

gelombang 540 nm. Kemudian gambarkan kurva serapan fraksi dengan sumbu x

adalah nomor tabung dan sumbu y adalah serapan pada panjang gelombang 540 nm.

Hasil :

Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Warna

Intensitas

(++)

Serapan

540 nm

Kesimpulan :

18

Pertanyaan :

1. Apakah fungsi vitamin B12 ?

2. Apakah yang menyebabkan vitamin B12 dan Hb berwarna merah ?

3. Bandingkan rumus kimia vitamin B12 dengan gugus prostetik Hb !

4. Berapakah berat molekul (BM) Hb dan BM vitamin B12 ?

5. Apakah logam yang terdapat dalam Hb dan dalam vitamin B12 ?

19

Isolasi DNA dari Jaringan

Pendahuluan

Sampai awal tahun 70an, DNA merupakan molekul seluler yang paling sulit

dianalisis, karena strukturnya yang panjang dan secara kimiawi monoton. Sebagai materi

genetik suatu organisme nukleotida hanya dapat dianalisis secara tidak langsung melalui

analisis urutan protein dan RNA atau melalui analisis genetic. Kini menjadi hal yang

mungkin untuk mengisolasi suatu region spesifik dari suatu genome, yaitu total informasi

genetic yang dimiliki oleh suatu organisme; dan untuk memproduksi jumlah kopi yang tidak

terbatas dari region tersebut, atau untuk mendeterminasi urutan nukleotida dari region

tersebut hanya dalam semalam, dengan kecepatan pembacaan 1000 nukleotida per detik.

Teknologi rekombinan DNA yang menjadi pusat kegiatan dalam aktifitas

Bioteknologi, merupakan suatu teknik yang menggabungkan suatu segmen DNA dengan

DNA yang lain, telah menjadi pengetahuan yang memberikan banyak manfaat bagi

kehidupan manusia, seperti dalam produksi vaksin dan hormone. Aktifitas utama dalam

teknik rekombinan DNA, antara lain:

1. Memotong DNA pada tempat (site) yang spesifik dengan enzim restriksi nuclease.

Dengan teknik ini, dimungkinkan untuk mengisolasi dan memanipulasi gen secara

individual.

2. Kloning DNA dengan menggunakan suatu vector atau teknik Polymerase Chains

Reaction (PCR), yang memungkinkan suatu molekul DNA dapat dikopi untuk

meghasilkan jutaan molekul identik.

3. Hibridisasi asam nukleat, teknik untuk menemukan urutan DNA atau RNA yang

spesifik dengan tingkat akurasi yang tinggi berdasarkan kemampuannya mengikat

urutan asam nukleat komplemennya

4. Pengurutan (sequencing) semua nukleotida dari fragmen DNA yang telah dipurifikasi.

Bertujuan untuk mengidentifikasi gen dan memperkirakan urutan asam amino yang

membentuk protein.

5. Pemantauan (monitoring) tingkat ekspresi suatu gen di dalam sel dengan

menggunakan teknik mircroarry asam nukleat.

Pada praktikum kali ini akan dilakukan isolasi DNA dari jaringan dengan

menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Tissue). Dengan menggunakan maksimal 30 mg

20

jaringan dapat diperoleh 10-20 ug DNA total (termasuk DNA genom, mitokondria, dan

virus). Hasil isolasi DNA disebut baik bila didapatkan DNA dengan konsentrasi 10 ug

dengan rasio A260/A280 sebesar 1,8-2,0).

Tujuan Praktikum

- Mengisolasi DNA dari jaringan dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Tissue)

Metodologi

1. Alat

a. Micropipet 0,5-10 ul, 10-100 ul, 100-1000 ul.

b. Tip biru.

c. Tip kuning.

d. Tip putih.

e. Vortex.

f. Microcentrifugator.

g. Timbangan analitik.

h. Inkubator.

i. Kulkas.

j. Alarm/stopwatch.

2. Bahan

a. Genomic DNA mini kit (tissue) GT100, yang terdiri dari:

- GT buffer.

- GBT buffer.

- W1 buffer.

- Proteinase K.

- GD column.

- 2 ml collection tube.

- Micropestle.

b. Etanol absolut.

c. Microtube 1,5 mL.

d. Aquabidest.

e. Jaringan otak/hepar @ 30 mg.

21

f. Aluminum foil.

3. Cara Kerja

Ada empat (4) tahap dalam proses isolasi/purifikasi DNA dari sel:

a. Menghancurkan jaringan secara mekanik dengan micropestle.

b. Melisiskan sel secara kimiawi dengan GT buffer.

c. Mempresipitasikan protein dengan proteinase K dan GBT buffer (mengandung garam

chaotropic guanidine hidroklorida, SELALU GUNAKAN APD SELAMA

BEKERJA), kemudian (opsional) memurnikan DNA dari RNA dengan RNase A (10

mg/mL).

d. Mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh

Urutan cara kerja:

1. Potong 20 mg jaringan dan masukkan dalam microtube.

2. Masukkan micropestle dalam microtube dan hancurkan jaringan hingga menjadi

bubur.

3. Tambahkan 200 ul GT buffer ke microtube dan lanjutkan proses penghancuran

dengan micropestle.

4. Tambahkan 20 ul proteinase K dan kocok dengan kuat. Inkubasi selama 30 menit

pada suhu 60oC (selama inkubasi, bolak-balik tabung setiap 5 menit).

5. Tambahkan 200 ul GBT buffer dan kocok kuat selama 5 detik.

6. Inkubasi pada suhu 60oC selama minimal 20 menit hingga lisat jernih (selama

inkubasi, bolak-balik tabung setiap 5 menit).

7. Panaskan elution buffer (100 ul per sampel) pada suhu 60oC.

8. Tambahkan 200 ul etanol absolut pada lisat kemudian kocok dengan kuat selama 10

detik.

9. Pasang GD column pada 2 ml collection tube.

10. Transfer campuran ke GD column.

11. Sentrifugasi pada 14-16.000 g selama 2 menit.

12. Buang collection tube lalu transfer GD column ke collection tube baru.

13. Tambahkan 400 ul W1 buffer ke GD column lalu sentrifugasi pada 14-16.000 g

selama 1 menit.

14. Buang cairan hasil penyaringan lalu pasang kembali GD column pada collection tube.

15. Sentrifugasi pada 14-16.000 g selama 3 menit.

22

16. Transfer GD column ke microtube baru.

17. Tambahkan 100 ml elution buffer yang telah dipanaskan ke bagian tengah matriks

kolom.

18. Diamkan selama 5 menit.

19. Sentrifugasi pada 14-16.000 g selama 1 menit.

20. Masukkan kembali cairan hasil penyaringan ke bagian tengah matriks kolom.

21. Ulangi sentrifugasi pada 14-16.000 g selama 1 menit.

22. Simpan DNA pada suhu -20 oC.

(Untuk keterangan lebih lengkap silakan baca package insert)

23

Polymerase Chains Reaction (PCR)

Pendahuluan

Polymerase Chains Reaction (PCR) adalah teknik/metode in vitro untuk mensintesis

asam nukleat dengan cara mereplikasi atau mengamplifikasi suatu segmen DNA yang

spesifik. Metode ini membutuhkan pasangan primer oligonukleotida, yang akan menentukan

fragmen DNA mana yang akan di amplifikasi. Dengan metode ini, DNA dapat diamplifikasi

sampai jutaan kopi dengan cepat dan tepat. Produk dari PCR merupakan suatu fragmen DNA

yang cukup untuk digunakan pada kloning gen, digesti DNA dengan enzim restriksi,

elektroforesis dan sekuensing.

Prinsip dasar suatu PCR adalah: Pangasangan primer menghibridisasi sekuens

komplemen target pada rantai DNA yang sebelumnya telah terdenaturasi. Sintesis DNA

kemudian berlangsung dengan bantuan enzim polimerase di sepanjang daerah diantara

primer. PCR dilaksanakan dengan cara menginkubasi sample pada 3 temperatur yang berbeda

pada 3 tahap, dalam suatu siklus PCR; yaitu tahap:

1. Denaturasi

Dengan pemanasan 95 oC rantai ganda DNA akan terpisah, karena panas dapat merusak

ikatan hidroksi antara basa-basa yang komplementar.

2. Penempatan/pemasangan primer (annealing)

Primer ditempatkan/dipasang pada tempat yang sesuai (berkomplementer dengan rantai

tungal DNA) melalui proses pembentukan ikatan hidroksi. Untuk proses pemasangan

primer ini dibutuhkan temperature yang berbeda dari setiap primer.

3. Perpanjangan (extension)

Setelah primer ditempatkan pada posisi yang tepat, dimulailah proses pemanjangan rantai

baru DNA yang komplementar, dengan bantuan enzim DNA polymerase, sehingga

terbentuk suatu fragmen rantai ganda DNA yang spesifik. Enzim yang stabil pada

temparatur tinggi ini akan membantu proses penempatan nukleotida yang

dibutuhkan sampai terbentuknya suatu rantai ganda DNA. Temperatur optimal yang

dibutuhkan untuk proses ini adalah 72 oC.

Proses ini dapat diulang melampaui beberapa siklus (biasanya 23 35 siklus). Kopi dari

fragmen target spesifik yang diperoleh dapat dihitung dengan rumus 2n, dimana n adalah

jumlah siklus dari amplifikasi yang dilakukan.

24

Metode PCR bermanfaat untuk

- mendeteksi penyakit yang disebabkan oleh adanya kelainan gen

- mengidentifikasi gen yang menyebabkan kanker atau tumor

- mengidentifikasi DNA dari sample yang sangat sedikit pada kasus

forensic

- mempelajari ekspresi gen suatu gen dan mutagenesis

Gambar 1. Amplifikasi DNA menggunakan teknik PCR. Dimulai ketika dua rantai DNA

terpisah karena adanya pemanasan (tahap 1). Setelah terpisah, dengan adanya

penurunan suhu kedua, primer menghibridisasi rantai komplemennya (tahap 2).

Inkubasi reaksi dengan enzim DNA polymerase dan dNTP menyebabkan sintesa

DNA terjadi, dimulai dari kedua primer (tahap 3). Prosedur PCR dilakukan

berulang, fragmen DNA baru akan menjadi cetakannya.

Tujuan praktikum

Mengamplifikasi atau memperbanyak fragmen gen reseptor hormone FSH dengan

teknik PCR (Polymerase Chains Reaktion)

Metodologi

1. Bahan-bahan yang diperlukan:

25

a. DNA rantai ganda yang diperoleh dari praktikum Isolasi DNA.

b. Primer (Oligonukleotida) yang terdiri dari primer up stream dan down stream.

Karakteristik primer menentukan keberhasilan suatu reaksi PCR. Primer dapat di

disain sendiri menurut kebutuhan, dengan memperhatikan kriteria-kriteria berikut ini:

- Komposisi pasangan basa G-C diusahakan sekitar 50 %

- Basa-basa yang terdapat pada kedua primer sebaiknya tidak berkomplementasi,

untuk mencegah terbentuknya dimmer primer

- Panjang primer sebaiknya 20 30 nukleotida

Dalam praktikum ini digunakan primer dari urutan gen reseptor Vitamin D

c. Enzim DNA polimerase yang dapat mengkatalisis polimerisasi nukleotida (dNTP)

mulai dari primer memanjang ke arah 3 terminal. DNA polmerase merupakan enzim

yang stabil terhadap pemanasan dan pendinginan berkali-kali, yang diisolasi dari

bakteri, seperti Thermus aquaticus (tag polimerase).

d. Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

e. Larutan buffer dan garam sebagai sumber ion

2. Cara Kerja

Dalam praktikum ini digunakan kit PCR core system (Promega)

a. Buatlah larutan campuran untuk PCR dalam suatu tabung reaksi PCR yang terdiri dari:

b. Campurkan larutan tersebut dengan baik (dengan menggunakan vortex).

c. Memprogram mesin PCR (Thermocycler) dengan profil (30 siklus) sebagai berikut:

26

d. Letakkan tabung reaksi PCR pada mesin PCR dan jalankan (on) program yang telah

dibuat.

e. Setelah selesai reaksi PCR, ambil tabung reaksi dan DNA hasil amplifikasi siap dinilai

melalui gel elektroforesis DNA.

27

Sidik DNA (DNA FINGERPRINTING)

Tujuan :

1. Mempelajari salah satu acara analisis DNA yaitu dengan memeriksa sidik DNA 2. Mempelajari prinsip elektroforesis DNA 3. Mempelajari cara menentukan ukuran fragmen DNA

Dasar :

Enzim endonuklease restriksi dapat memotong DNA pada urutan basa spesifik yang bersifat

palindrome

Alat dan Bahan :

Alat :

1. Tabung mikro 1,5 ml

2. Pipet Eppendorf + tip

3. Alat sentrifugasi mikro

4. Penangas air

5. Alat elektroforesis horizontal

6. Power supply

7. Wadah plastik untuk mewarnai gel

8. Rak tabung mikro

Bahan :

1. Kit DNA Fingerprinting (Biorad):

a. DNA tempat kejadian

b. DNA terdakwa 1-4 (T1-T4)

c. Petanda DNA Lambda Hind III

d. Bufer enzim restriksi

e. Campuran enzim Bam H1 / Hind III

f. Pewarna sampel

g. Larutan DNA

2. DNA praktikum XIII

3. Akuades

4. Agarosa

Cara Kerja :

Pemotongan DNA dengan enzim restriksi

1. Sediakan 6 tabung mikro dan beri tanda sebagai berikut :

Tabung 1 : TK (tempat kejadian)

Tabung 2 : T1 (terdakwa 1 )

Tabung 3 : T2 (terdakwa 2 )

Tabung 4 : T3 (terdakwa 3 )

Tabung 5 : T4 (terdakwa 4 )

Tabung 6 : T5 (terdakwa 5 )

2. Ambil 2 tabung mikro yang berisi :

ENZ : enzim restriksi

BR : buffer restriksi

3. Ambil sampel DNA, kemudian masukkan 8 l DNA ke dalam tabung yang sesuai (TK,

T1-T5). Gunakan tip yang berbeda untuk tiap sampel.

28

4. Masukkan 1 l buffer restriksi (BR) ke dalam tiap- tiap tabung sampel. Lalu masukkan 1

l enzim (ENZ) ke dalam tiap- tiap tabung tersebut. Setelah itu semua tabung ditutup.

Gunakan tip yang berbeda untuk setiap sampel.

5. Sentrifugasi selama 2 detik.

6. Inkubasi 37C selama 45 menit (atau dapat diinkubasi pada suhu ruang semalam). Simpan

dalam lemari pendingin.

Pertanyaan :

1. Sebelum sampel diinkubasi, perubahan apa yang tampak dalam tabung yang mengandung

DNA dan enzim restriksi ?

2. Apakah dapat terlihat tanda- tanda yang menunjukkan bahwa DNA telah difragmentasi

oleh enzim restriksi ?

3. Meskipun tidak terlihat perubahan dalam tabung, apakah masih mungkin bahwa sampel

NA terfragmentasi ? Jelaskan ?

29

Gel Elektroforesis DNA

Pendahuluan

Molekul DNA atau suatu fragmen DNA yang telah diamplifikasi dapat dipisahkan

berdasarkan ukuran atau besarnya pasangan basanya melalui gel elektroforesis. Deteksi

fragmen DNA tersebut dapat dilakukan dengan cara mewarnai gel dengan suatu zat yang

dapat meng-interkalasi rantai ganda DNA, yaitu misalnya dengan ethidiumbromida. Metoda

pemisahan/separasi DNA secara luas digunakan untuk tujuan analisis molekul DNA atau

tujuan preparatif.

Tujuan praktikum

1. Melakukan elektroforesis DNA hasil isolasi dari darah vena dan hasil amplifikasi,

dengan gel agarosa

2. Melakukan analisis hasil elektroforesis total DNA genom manusia dan hasil

amplifikasi fragmen gen dengan metode PCR.

Metodologi

1. Alat

Satu set alat elektroforesis DNA berikut power supply, yang terdiri dari:

- chamber elektroforesis

- tray elektroforesis

- sisir

- power supply

2. Bahan

- Larutan hasil isolasi DNA.

- Larutan hasil PCR (produk PCR).

- Larutan TAE 1x (Tris-base, glacial acetic acid dan EDTA).

- Marker DNA + loading dye.

- Ethidium bromida.

3. Cara kerja

a. Pembuatan gel.

30

i. Masukkan 0,8 g bubuk agarosa ke tabung Erlenmeyer, tambahkan TAE buffer 0,5x

sebanyak 40 mL (konsentrasi gel agarosa disesuaikan dengan panjang sekuens DNA

yang akan dilihat).

ii. Kocok perlahan sesaat.

iii. Larutkan agarosa dengan memanaskan pada hot plate hingga larutan jernih.

iv. Tambahkan 1 L EtBr, larutkan dengan orbital shaker.

v. Tuang ke wadah elektroforesis.

vi. Diamkan hingga membentuk struktur agar.

b. Elektroforesis.

i. Campur 5 L DNA amplikon dengan 1 L loading dye.

ii. Masukkan ke dalam sumuran yang sesuai.

iii. Campur DNA ladder 100 bp sebanyak 5 L dengan 1 L loading dye.

iv. Masukkan ke dalam sumuran yang sesuai.

v. Aliri dengan listrik 100 V selama 30 menit.

vi. Baca hasil elektroforesis dengan Gel Doc.

Gambar 2. Gambaran Skematik proses elektroforesis.